Warszawski Uniwersytet Medyczny Wydział Farmaceutyczny Oddział Analityki Medycznej Justyna Krystyna Ciepły Nr albumu 41624 Charakterystyka lekoopornych szczepów wirusa HIV 1 izolowanych w Polsce w 2008 roku Praca magisterska wykonana w Zakładzie Mikrobiologii Farmaceutycznej Warszawskiego Uniwersytetu Medycznego pod kierownictwem naukowym prof. dr hab. Stefana Tyskiego Opiekunowie pracy: Dr n. farm. Bohdan Starościak (Zakład Mikrobiologii Farmaceutycznej Warszawskiego Uniwersytetu Medycznego) Dr n. med. Janusz J. Stańczak (Pracownia Diagnostyki Molekularnej Wojewódzkiego Szpitala Zakaźnego w Warszawie)
Wirus HIV 1 Zidentyfikowany w 1983 roku przez L. Montagnier, następnie w 1984 roku przez R. Gallo Rodzina Retroviridae, grupa Len.virus complex Ma kształt kulisty, średnicę 100 nm Genom to dwie cząsteczki jednoniciowego +ssrna Geny gag (białka strukturalne), pol (białka enzymatyczne), env (białka otoczki) oraz tat, rev, nef, vif, vpu, vpr (regulatorowe) Enzymy: 1 cząsteczka proteazy, 1 integrazy i 2 odwrotnej transkryptazy
Wirus HIV 1 Do wniknięcia do komórki wymaga cząsteczki CD4+ (receptor) oraz CCR5 lub CXCR4 (koreceptory) Szczepy M tropowe korzystające z CCR5 Szczepy T tropowe korzystające z CXCR4
Wirus HIV 1 główne grupy genetyczne M (major) Grupa M to 9 subtypów: A D, F H, J i K O (outlier) N (non M, non O) P ( wyizolowany w 2009 roku od kobiety z Kamerunu mieszkającej we Francji) Występują formy zrekombinowane CRF (Circulajng Recombinant Forms) 48 form np. CRF01_AE, CRF02_AG, CRF05_DF, CRF07_BC
Leki antyretrowirusowe Nukleozydowe (NtRTI) i nukleotydowe (NRTI) inhibitory odwrotnej transkryptazy Nienukleozydowe inhibitory odwrotnej transkryptazy (NNRTI) Inhibitory proteazy (PI) Inhibitory fuzji i wejścia (EI) Inhibitory integrazy (II) Nowe preparaty inhibitory dojrzewania (III faza badań klinicznych)
Metody oznaczania lekooporności Fenotypowanie (w tym również fenotypowanie wirtualne) Genotypowanie Hybrydyzacja Sekwencjonowanie
Czynniki wpływające na powstanie lekooporności wirusa HIV 1 Wysokie tempo replikacji (dziennie syntetyzowanych jest 10 10 10 11 nowych wirionów) Niedokładność wirusowej odwrotnej transkryptazy 1 5x10 9 wirionów syntetyzowanych w ciągu 24 h zawiera mutacje w regionach kodujących odwrotną transkryptazę i proteazę Niewystarczająca współpraca pacjenta z lekarzem Akumulacja mutantów w czasie zakażenia
Oznaczanie lekooporności (zalecenia EACS) Pacjenci nowozdiagnozowani Pacjenci rozpoczynający leczenie o ile nie byli testowani wcześniej. Należy użyć najwcześniej pobraną próbkę krwi przed rozpoczęciem terapii. Pacjenci z niepowodzeniem leczenia (wirusologicznym) Kobiety ciężarne przed rozpoczęciem terapii (dla efektywnej terapii i ochrony dziecka przed zakażeniem) Profilaktyka poekspozycyjna
Cel pracy wykrycie mutacji odpowiedzialnych za oporność wirusa HIV 1 na leki ocena częstości występowania w Polsce wariantów genetycznych HIV 1 o obniżonej podatności na leki wykrycie przyczyn niepowodzeń terapeutycznych wśród pacjentów leczonych, umożliwienie prawidłowego doboru następnego schematu leczenia (nowych, aktywnych wobec mutantów leków) ocena występowania subtypów HIV 1 w Polsce ocena właściwości/przydatności metod sekwencjonowania ViroSeq i Trugene
Przygotowanie materiału Zbadano 285 próbek w tym 91 od chorych leczonych, 194 od nieleczonych Materiałem wyjściowym do badań było osocze Przed przystąpieniem do sekwencjonowania materiał przygotowywano w następujących etapach: a) Izolacja RNA wirusa HIV 1 b) Odwrotna transkrypcja c) Reakcja PCR d) Oczyszczanie DNA na kolumienkach e) Elektroforeza DNA w żelu agarozowym f) PCR sekwencyjny g) Oczyszczanie DNA
Metody sekwencjonowania ViroSeq HIV 1 Genotyping System v2.6 (Abbos, Niemcy) sekwencjonowany jest region kodujący proteazę wirusa (kodony 1 99) oraz 2/3 regionu kodującego odwrotną transkryptazę (kodony 1 335)
Metody sekwencjonowania Test Trugene HIV 1 Genotyping Assay (Siemens, Niemcy) określana jest sekwencja regionu proteazy wirusa (kodony 1 99) oraz odwrotnej transkryptazy wirusa (kodony 40 247)
Przydatność metod stosowanych do oznaczania lekooporności wirusa HIV 1 Metoda ViroSeq Zautomatyzowana Wykrywa 67 mutacji Etapy dodatkowe w przygotowaniu materiału Metoda Trugene Półautomatyczna Wykrywa 72 mutacje Brak etapów dodatkowych w przygotowaniu materiału Konieczna interwencja eksperta, nie wykrywa insercji i delecji Łatwiej poszerzyć oprogramowanie o wykrycie nowych mutacji Trudniej poszerzyć oprogramowanie o wykrycie nowych mutacji
Wynik sekwencjonowania Pik zielony adenina (A), czerwony tymina(t), niebieski cytozyna (C), czarny guanina (G)
Subtypy HIV 1 zidentyfikowane w Polsce w 2008roku 1,4% 0,4% 3,9% 0,7% 1,8% 91,9% B C D G CRF01_AE CRF02_AG
Wyniki Najczęściej wykrywane mutacje Chorzy leczeni NRTI i NtRTI: M184V NNRTI:K103N, Y181C, E138A PI: L10I, L10IL Chorzy nieleczeni PI: L10I, L90M, L76LV NRTI i NtRTI: M41L, T215S i M184V NNRTI: G190A Leki, na które wystąpiła największa oporność NNRTI: newirapina, delawirdyna, efawirenz NRTI i NtRTI: lamiwudyna, emtrycytabina PI: nelfinawir PI: nelfinavir, sakwinawir, indinawir NRTI i NtRTI: azydotymidyna, stawudyna NNRTI: newirapina
Wyniki pacjenci leczeni Wśród 91 pacjentów leczonych szczepy lekooporne HIV 1 stwierdzono u 35 (38,5%) 35% Częstość występowania wariantów opornych HIV 1 30% 25% 20% 15% 10% 5% 0% PI NRTI i NtRTI NNRTI Grupy leków
Wyniki pacjenci nieleczeni Wśród 194 pacjentów szczepy oporne wirusa HIV 1 stwierdzono u 15 (7,7%) 5,0% Częstość występowania wariantów opornych HIV 1 4,5% 4,0% 3,5% 3,0% 2,5% 2,0% 1,5% 1,0% 0,5% 0,0% PI NRTI i NtRTI NNRTI Grupy leków
Częstość występowania wariantów opornych HIV 1 wśród pacjentów nieleczonych w Polsce 30,0% 25,0% 20,0% 15,0% 28,7% 10,0% 14,1% 5,0% 5,8% 3,9% 7,7% 0,0% 2001 2002 2002 2005 2006 2007 2008
Częstość występowania wariantów opornych HIV 1 wśród pacjentów leczonych w Polsce 80,0% 70,0% 60,0% 50,0% 40,0% 75,1% 76,7% 30,0% 20,0% 52,6% 43,1% 38,5% 10,0% 0,0% 2000 2001 2002 2005 2006 2007 2008
Podsumowanie Chorzy leczeni częstość oporności wirusa HIV 1 na leki 38,5% Chorzy nieleczeni częstość oporności wirusa HIV 1 na leki 7,7% Subtypy HIV 1 w Polsce w 2008 roku: B(91,9%), C, D, G, CRF01_AE, CRF02_AG Metoda Trugene mniej złożona pod względem przygotowania materiału, metoda ViroSeq bardziej złożona
Dziękuję za uwagę