Rozdzia³ III. Diagnostyka laboratoryjna zaka enia wirusem HIV-1 i AIDS. Janusz J. Stañczak. Diagnostyka serologiczna

Transkrypt

1 Janusz J. Stañczak Rozdzia³ III Diagnostyka laboratoryjna zaka enia wirusem HIV-1 i AIDS Zakażenie ludzkim wirusem HIV-1 jest wykrywane w różnych stadiach choroby. Mimo wielu dostępnych leków jest ono obecnie dożywotnie. Czas i intensywność leczenia antyretrowirusowego powodują liczne objawy uboczne. Zjawiskiem bardzo niekorzystnym jest, podobnie jak w antybiotykoterapii zakażeń bakteryjnych, selekcja wariantów genetycznych o braku lub obniżonej wrażliwości na leki. Te cechy zakażenia, a także jego aspekty społeczne, ekonomiczne i kulturowe spowodowały gwałtowny rozwój nowych metod diagnostycznych i usprawnienie już istniejących. Obecnie diagnostyka zakażeń HIV jest jedną z najbardziej złożonych i jednocześnie najskuteczniejszych w wirusologii klinicznej. Ocenia się obecność przeciwciał anty-hiv i wybranych antygenów wirusa, materiału genetycznego genomowego RNA i prowirusowego cdna. Bardzo ważnym elementem jest ocena wpływu zakażenia oraz leczenia na jakość układu odpornościowego, najczęściej dokonywana cytometrycznym pomiarem liczby limfocytów T CD4+ oraz T CD8+. Najnowszym wzbogaceniem diagnostyki jest genetyczne charakteryzowanie wirusa, umożliwiające wykrywanie mutantów o obniżonej wrażliwości na leki oraz subtypów HIV, istotne w badaniach epidemiologicznych. Diagnostyka serologiczna Diagnostyka serologiczna jest podstawą w badaniach przesiewowych. W 1985 roku Federal Drug Administation (USA) zatwierdziła pierwszy test wykrywający przeciwciała anty-hiv. Obecnie powszechnie stosuje się testy immunoenzymatyczne (EIA enzyme immunoassay) III i IV generacji, umożliwiające wykrycie przeciwciał anty-hiv-1, anty-hiv-1 z grupy 0 oraz anty-hiv-2. Materiałem badanym jest surowica, osocze; w uzasadnionych wypadkach mogą być diagnozowane inne płyny ustrojowe. Czas pomiędzy zakażeniem a pojawieniem się wykrywalnych prze- DIAGNOSTYKA LABORATORYJNA ZAKA ENIA WIRUSEM HIV-1 I AIDS 35

2 ciwciał wynosi około 3 tygodnie. Opisywane są w tym względzie znaczne różnice osobnicze. Testy IV generacji, dodatkowo wykrywające antygen p24, znacznie skracają okres okienka serologicznego. Jednocześnie wykazują wyższą niż generacja III swoistość diagnostyczną. Najnowszy wariant testów IV generacji pozwala określić przyczynę wyniku dodatniego obecność wyłącznie antygenu lub także przeciwciał. Charakterystykę testów przedstawia tabela 1. Testy przesiewowe z natury swojej mogą wykazywać wyniki fałszywie dodatnie, zależne od np. chorób współistniejących; inną przyczyną, szacowaną na 0,0005% badań, mogą być wewnątrzlaboratoryjne błędy techniczne. Dlatego, zgodnie z regulacjami obowiązującymi również w Polsce, dodatni wynik testu przesiewowego winien być zweryfikowany testem potwierdzenia, w przeciwnym razie nie może być wydany pacjentowi. Testy potwierdzenia wykrywają przeciwciała przeciwko różnym grupom antygenów HIV, wykorzystując technologię EIA. Najczęściej stosowane są testy WB (western blot), zawierające białka antygenowe zlizowanych wirionów HIV-1 lub testy LIA (line immunoassay), zawierające peptydy syntetyczne oraz białka uzyskane drogą rekombinacji. Skład antygenów w testach WB jest różny, zależny od producenta. Zawsze są to jednak antygeny kodowane przez trzy różne regiony: rdzenia (gag p18, p24, p55), polimerazy (pol p34, p52, p68) oraz otoczki (env gp41, gp120, gp160). Testy LIA zawierają dodatkowo antygeny otoczki HIV-2 (gp36, sgp105), umożliwiające rozróżnienie i wykrycie zakażenia tym wirusem. Te antygeny są również obecne w najnowszych wariantach testów WB. Tabela 1. Wybrane w³aœciwoœci testów serologicznych Generacja U yte antygeny W³aœciwoœci testu I lizaty wirusa niska specyficznoœæ i powtarzalnoœæ 6 tygodni II syntetyczne i rekombinacyjne poprawienie powy szych parametrów, swoiste wobec HIV-1 oraz HIV-2 III syntetyczne zwiêkszona czu³oœæ, dodatkowo wykrywa przeciwcia³a przeciwko antygenom grupy 0 HIV-1 IV syntetyczne dodatkowo zawiera przeciwcia³a wykrywaj¹ce antygen p24 HIV-1 IV usprawniona syntetyczne jw., dodatkowo rozró nia Ÿród³o sygna³u obecnoœæ przeciwcia³ lub antygen p24 Okres okienka serologicznego 5 tygodni 4 tygodnie 2 tygodnie jw. 36 HIV/AIDS PODRÊCZNIK DLA LEKARZY I STUDENTÓW

3 Za wynik dodatni testu potwierdzenia najczęściej, zawsze zgodnie z zaleceniami producenta, uznaje się reakcję przeciwciał z co najmniej dwoma białkami różnych regionów. Brak jakiejkolwiek reaktywności to wynik ujemny. Niepełna reaktywność, reakcja jednego antygenu lub dwu z tej samej grupy uważana jest za wynik nieokreślony. Jego przyczyną mogą być błędy wykonania, ale też wczesna faza serokonwersji, zakażenie HIV-2 lub innymi retrowirusami. W wypadku weryfikacji wyników testów IV generacji testy WB i LIA nie są przydatne w pierwszych stadiach zakażenia, przed serokonwersją. Dlatego przyjęto, że potwierdzenie może być dokonane testami genetycznymi identyfikującymi materiał genetyczny HIV lub testem wykrywającym antygenemię p24 (w Polsce stosowanym sporadycznie). Obecnie stosowane testy serologiczne zapewniają diagnostykę tanią, szybką, wykazując czułość diagnostyczną i specyficzność bliskie 100%. Diagnostyka genetyczna Testy genetyczne bezpośrednio wykrywają materiał genetyczny HIV- -genomowy RNA obecny w wirionach lub komplementarny DNA (cdna) w zakażonych komórkach. Właściwie każda duża firma biotechnologiczna oferuje takie testy. Stosowane są dwie grupy testów, różniące się zastosowaną technologią. Grupa dominująca to testy wykrywające wybraną sekwencję materiału genetycznego HIV, następnie fragment ten powielające nawet miliony razy. Są to tzw. technologie NAAT (nucleic acid amplification tests). Należą do nich testy PCR (polymerase chain reaction), NASBA (nucleic acid sequence-based amplification) oraz TMA (transcription mediated amplification). Druga grupa wykorzystuje technologię rozgałęzionego DNA (bdna branched DNA), w której do wykrytego materiału genetycznego jest dołączany syntetyczny DNA, zawierający kilkaset miejsc przyłączenia sondy wyznakowanej barwnikiem chemiluminescencyjnym. Jest to technologia wzmocnienia sygnału. Najnowszą technologią jest system mikromacierzy DNA (DNA chips). Jego elementem podstawowym jest płytka szklana lub membrana nylonowa, na której są osadzone setki, a nawet tysiące sond oligonukleotydów. Do nich w procesie hybrydyzacji przyłączają się komplementarne kwasy nukleinowe. Technologia ta umożliwia całościową ocenę badanego materiału genetycznego. Obecnie za złoty standard diagnostyczny uznaje się technologię PCR z jej wynikami są porównywane rezultaty uzyskane innymi metodami. DIAGNOSTYKA LABORATORYJNA ZAKA ENIA WIRUSEM HIV-1 I AIDS 37

4 Sondy i primery, stosowane w powyższych technikach, są syntezowane na podstawie informacji uzyskanych poprzez sekwencjonowanie genomu HIV. Powszechnie stosuje się opublikowaną w 1977 roku metodę Sangera i wsp. Wykorzystuje ona zasadę przerywania wydłużania (terminacji elongacji) potomnej nici DNA przez wbudowanie dwudeoksynukleotydu. Sekwencjonowanie jest jednym z podstawowych narzędzi współczesnej genetyki. Jest stosowane w badaniach podstawowych do charakteryzowania badanych genomów lub ich fragmentów. Umożliwia także poznanie genetycznych podstaw chorobotwórczości patogenów. Jednocześnie w ostatnich latach sekwencjonowanie stało się samodzielną metodą diagnostyczną, na przykład w diagnostyce HIV służy identyfikacji wariantów genetycznych w dochodzeniach epidemiologicznych lub częściej wykrywaniu mutacji warunkujących lekooporność (patrz niżej: Oznaczanie lekooporności HIV-1). Wyniki sekwencjonowania umożliwiają również syntezę peptydów stosowanych np. w testach serologicznych lub szczepionkach. Testy genetyczne umożliwiają najszybsze wykrycie zakażenia. Teoretycznie już po kilku godzinach od ekspozycji można wykryć RNA wirusa HIV. Ich czułość i swoistość diagnostyczna jest porównywalna z właściwościami testów serologicznych IV generacji. Dużym ryzykiem ich stosowania jest możliwość kontaminacji próbki produktami poprzednich reakcji, dlatego narzucają one znacznie wyższe standardy pracy. Diagnostyka cytometryczna ocena uk³adu odpornoœciowego Podstawową metodą oceny oddziaływania zakażenia HIV na układ odpornościowy jest pomiar ilości limfocytów T CD4+ (pomocniczych) i ich stosunek liczbowy do T CD4+ (supresorowych/cytotoksycznych). Uznane normy fizjologiczne wynoszą: T CD4+ u dzieci od 1. do 6. roku życia >1000/mm³, dorośli /mm³, a stosunek T CD4+/CD8+ odpowiednio 1,05 1,75 oraz 1,30 2,60. Spadek ilości limfocytów T CD4+ jest podstawowym, obok wiremii, znacznikiem postępu zakażenia, czynnikiem uzasadniającym inicjację terapii. Natomiast wzrost ilości T CD4+ jest bezpośrednim wyznacznikiem skuteczności leczenia. W połączeniu z obecnością zakażeń oportunistycznych lub ich brakiem liczba T CD4+ definiuje kategorie zakażenia HIV. Oznaczenia liczby T CD4+ dokonuje się w krwi pełnej pobranej do probówki z dowolnym antykoagulantem. Wymagana jest niewielka ( μl) ilość krwi. Badania cytometryczne umożliwiają ocenę innych markerów pobudzenia immunologicznego CD3+, CD19+ (limfocyty T i B) oraz CD16/56+ (komórki NK). 38 HIV/AIDS PODRÊCZNIK DLA LEKARZY I STUDENTÓW

5 Fazy diagnozowania zaka enia HIV Diagnostyka laboratoryjna HIV składa się z kilku etapów. W każdym z nich stosowane testy odpowiadają na inne pytania. Wykrycie zakażenia HIV, śledzenie rozwoju zakażenia oraz monitorowanie leczenia wymusza zastosowanie różnych testów. Czas pojawiania się markerów wykorzystywanych w diagnozowaniu zakażenia HIV-l pokazano na rycinie 1. Diagnostyka przesiewowa w kierunku HIV Podstawowe badania w kierunku HIV to metody serologiczne. Z pobranej próbki krwi jest uzyskiwane osocze, następnie dzielone na próbkę 1. i 2. Wynik dodatni próbki 1. wywołuje konieczność powtórzenia oznaczenia w próbce 2. Wynik dodatni próbki 2. bezwzględnie musi być zweryfikowany testem potwierdzenia. Wynik dodatni testu potwierdzenia jest wydawany lekarzowi zlecającemu badanie. W wypadku wyniku dodatniego próbki 1. oraz ujemnego w 2. zaleca się ponowne pobranie krwi i powtórzenie badania. Wynik ujemny próbki 1. traktuje się jako prawdziwy. Zaleca się jednak konsultację z pacjentem, ocenę ryzyka zakażenia oraz dyskusję o zapobieganiu ryzykownym zachowaniom. W trakcie okienka serologicznego wirus replikuje bardzo intensywnie, ilość kopii wirusa jest najwyższa w całym przebiegu choroby. Pozwala to stê enie T CD4+ HIV-RNA (RT PCR) w osoczu ENV-Ab RNA p24ag GAG-Ab p24ag IgM HIV-DNA (PCR) w PBMC czas zaka enie tygodnie/miesi¹ce miesi¹ce/lata 1 3 lat ostre zaka enie okres bezobjawowy objawy Rycina 1. Pojawianie siê znaczników diagnostycznych w zaka eniu HIV-l DIAGNOSTYKA LABORATORYJNA ZAKA ENIA WIRUSEM HIV-1 I AIDS 39

6 na wykrycie zakażenia poprzez wykazanie obecności antygenu p24 HIV. W tym celu stosuje się testy IV generacji lub wykrywające jedynie antygen p24. W uzasadnionych wypadkach, np. wysokiego prawdopodobieństwa zakażenia, zasadne i dopuszczalne jest wykonanie pierwszego diagnozowania testem genetycznym. Jego wynik uważa się za ostateczny. Pacjent nie może otrzymać niepotwierdzonego dodatniego wyniku testu przesiewowego. W praktyce reguła ta jest nagminnie łamana. Diagnostyka poekspozycyjna u dzieci matek HIV-dodatnich Wczesna diagnostyka umożliwia wykrycie zakażenia HIV wkrótce po kontakcie z materiałem zakaźnym ryzykownym zachowaniu seksualnym, intencjonalnych próbach zakażenia lub wówczas, gdy inne metody są niestosowalne, np. u noworodków i niemowlaków matek zakażonych HIV. U dzieci przeciwciała odmatczyne mogą przetrwać nawet do 18. miesiąca życia. W metodzie tej materiałem badanym jest krew pełna pobrana na antykoagulant. Wymagane jest około 5 ml krwi, w wypadku badania noworodków lub niemowlaków dopuszczalne jest przesłanie 1 ml. Po pobraniu probówki przechowuje się w temperaturze pokojowej, a czas transportu nie powinien przekraczać 24 godzin. W laboratorium komórki jednojądrzaste są izolowane w gradientach wielocukrów i hodowane. Komórki są pobudzane fitohemaglutyniną, a po 3 dniach dodatkowo IL-2. Po 10 dniach hodowli ocenia się obecność antygenu p24 w nadsączu oraz RNA HIV-l w płynie hodowlanym metodą RT PCR. W lizacie komórek można również poszukiwać prowirusowego cdna metodą PCR. W diagnostyce noworodków zaleca się wykonanie badania w pierwszych 5 dniach życia oraz powtórzenie badania w 3. i 5. miesiącu w celu wykluczenia zakażenia okołoporodowego. Przedstawiona metoda jest jedną z najczulszych. Jedyną niedogodnością jest czas badania. Ocena rozwoju zaka enia HIV Przebieg zakażenia jest oceniany przez pomiar ilości limfocytów T CD4+ i proporcji do T CD8+ oraz pomiar wiremii HIV-1. Ocena profilu immunologicznego, mimo że jest zależna także od innych czynników, wydaje się metodą dokładniej opisującą przebieg zakażenia. Ocena ilościowa wiremii jest mniej podatna na proceduralne zafałszowania i fizjologiczne fluktu- 40 HIV/AIDS PODRÊCZNIK DLA LEKARZY I STUDENTÓW

7 acje, ale jest znacznie droższa. Wskazany jest równoczesny pomiar obu markerów. W Polsce przyjęto konsensus zalecający wykonanie jednoczesne obu testów dwa razy w roku. W celu oznaczenia wiremii HIV należy pobrać krew pełną w ilości 4,5 ml do probówek z K 3 EDTA. Warunki pobrania, przechowywania i transportu są identyczne jak w badaniu cytometrycznym. Obydwa rodzaje badań mogą być wykonane z tego samego pobrania. Najczęściej oznacza się wiremię HIV metodą RT PCR, znacznie rzadziej rozgałęzionego DNA (b-dna). Najważniejsze laboratoria polskie stosują wariant RT PCR czasu rzeczywistego (real time RT PCR). Metoda ta jest bardzo czuła dolny próg detekcji wynosi około 40 kopii/ml; jednocześnie zapewnia bardzo szeroki zakres liniowości pomiaru nawet do 1 x 10 7 kopii/ml. Czas oczekiwania na wynik zależy od liczby otrzymywanych próbek, ponieważ ekonomicznie uzasadnione jest wykonywanie serii oznaczeń. W praktyce jest nie dłuższy niż 4 dni. Monitorowanie przebiegu zakażenia HIV wykazało, że są osoby, u których utrzymuje się stale niska wiremia, nie postępuje uszkadzanie układu odpornościowego i najprawdopodobniej nie rozwija się pełnoobjawowy AIDS. Osoby takie (long-time nonprogresors) posiadają najczęściej mutacje genów kodujących koreceptory CXCR4 lub CCR5. Receptory te są wykorzystywane przez HIV podczas inwazji komórek gospodarza powstająca mutacja chroni komórkę przed zakażeniem. Obecnie możliwe jest identyfikowanie większości takich mutacji. Ocena skutecznoœci leczenia antyretrowirusowego Monitorowanie skutecznego leczenia nie różni się od śledzenia rozwoju zakażenia. Ocenia się skuteczność hamowania replikacji wirusa stan pożądany to spadek wiremii do poziomów niewykrywalnych (poniżej około 40 kopii/ml) oraz rekonstrukcję układu odpornościowego efekt oczekiwany to wzrost liczby limfocytów T CD4+ i poprawa proporcji do T CD8+. W Polsce bada się dwukrotnie w ciągu roku pacjentów poddanych terapii. Wyjątek stanowią dzieci, u których ze względu na większą labilność oznaczenia wykonuje się cztery razy w roku lub zgodnie z zaleceniem lekarza prowadzącego. Niepowodzenie leczenia definiuje się jako: niepowodzenie wirusologiczne wzrost wiremii do poziomu >1000 kopii/ml po początkowym spadku poniżej poziomu detekcji, niepowodzenie immunologiczne brak wzrostu liczby T CD4+, nieskuteczność kliniczną. DIAGNOSTYKA LABORATORYJNA ZAKA ENIA WIRUSEM HIV-1 I AIDS 41

8 Lekarz prowadzący winien rozważyć wszystkie możliwe przyczyny niepowodzenia, przede wszystkim nieregularne przyjmowanie leków, ale również selekcję mutantów lekoopornych i narastanie subpopulacji opornych na stosowane leki. Oznaczanie lekoopornoœci HIV-1 Stworzenie grup leków antyretrowiusowych skutecznie zmniejszających replikację HIV spowodowało, podobnie jak wprowadzenie antybiotykoterapii zakażeń bakteryjnych, selekcjonowanie wariantów genetycznych HIV o obniżonej podatności na leki. Powstanie lekoopornego mutanta jest wynikiem wysokiego tempa replikacji wirusa i niskiej wierności wirusowej odwrotnej transkryptazy. W efekcie dziennie powstaje około 1 5 x 10 9 wirionów zmutowanych w regionach kodujących odwrotną transkryptazę i proteazę. Pojawiające się mutanty wykazują na ogół niższą wydajność replikacyjną niż warianty dzikie. Inicjacja terapii wprowadza jednak silną presję selekcyjną i mutanty lekooporne bardzo szybko stają się populacją dominującą. Najnowsze wytyczne WHO zalecają testowanie w kierunku lekooporności u pacjentów z niepowodzeniem leczenia, u osób zaczynających leczenie (jeżeli transmisja szczepów opornych jest stwierdzana u ponad 10% populacji) oraz kobiet ciężarnych przed inicjacją profilaktycznego podawania leków. Podobne zalecenia przyjęto w Polsce. Selekcjonowanie i przenoszenie się szczepów opornych HIV staje się jednym z głównych powodów niepowodzenia leczenia. Wykazano również obecność typowych mechanizmów oporności krzyżowej, gdy pojedyncza mutacja warunkuje oporność na kilka leków z danej grupy. Ocena oporności HIV-1 w Polsce wykazała, że ponad 14% nieleczonych pacjentów jest zakażonych szczepami o obniżonej wrażliwości na leki. Jest to odsetek wysoki, uzasadniający powszechne testowanie zgodne z powyższymi zaleceniami. Do identyfikacji mutantów opornych stosuje się dwie technologicznie różne grupy metod genotypowanie i fenotypowanie. Genotypowa analiza opornoœci Genotypowa analiza lekooporności opisuje oporność pośrednio, poprzez wykrycie mutacji powiązanych z klinicznie obserwowaną obniżoną lub zniesioną wrażliwością na lek. Mutacje te pojawiają się w genach kodujących odwrotną transkryptazę i proteazę HIV oraz w wypadku najnowszej grupy leków hamujących wejście wirusa do komórki, w genach kodujących białka gp41 i gp120 HIV. Stosowane są dwie metody genotypowania 42 HIV/AIDS PODRÊCZNIK DLA LEKARZY I STUDENTÓW

9 sekwencjonowanie i hybrydyzacja. W obu pierwszy etap to namnożenie badanych fragmentów genomu HIV w reakcji RT PCR. W teście hybrydyzacji uzyskany jednoniciowy DNA łączy się fragmentami komplementarnymi z sondami naniesionymi na stały nośnik, najczęściej pasek nitrocelulozy lub nylonu, swoistymi dla wcześniej wybranych mutacji. Uzyskany wzór reagujących sond umożliwia identyfikację mutacji i ostatecznie ocenę lekooporności. W teście sekwencjonowania ustala się kolejność wszystkich nukleotydów w badanych fragmentach. Oddziaływanie wykrywanych mutacji jest interpretowane przez program komputerowy zintegrowany z systemem. Istnieje co najmniej dziewięć różnych algorytmów interpretujących, sporadycznie zdarzają się interpretacje rozbieżne. Po uwzględnieniu różnic między obiema technologiami w aktualnych zaleceniach zasugerowano stosowanie hybrydyzacji jako systemu wczesnego ostrzegania, wykrywającego pojawiające się w czasie leczenia mutanty lekooporne. Z kolei sekwencjonowania powinno używać się jako dokładnego instrumentu wykrywania nowych zmian w genomie HIV. W Polsce początkowo stosowano testy hybrydyzacji. Obecnie 1 2 laboratoria stosują technikę sekwencjonowania. Do wykonania badania niezbędna jest wiremia >1 x 10 3 kopii/ml. Pobiera się krew pełną na K 3 EDTA; wymagana objętość wynosi 2 ml. Zasady pobrania i przesyłania są takie same jak do badań cytometrycznych. Badanie trwa około 3 7 dni. Raport zawiera rozpoznane mutacje warunkujące lekooporność oraz ich interpretację: leki skuteczne, o zmniejszonej skuteczności oraz nieskuteczne. Możliwe jest udostępnianie klinicystom wyniku pierwotnego, sekwencji, do oceniania innymi algorytmami. Fenotypowa analiza opornoœci Fenotypowa analiza oporności ocenia bezpośrednio wpływ leku na wydajność replikacji HIV podczas hodowli w zakażonych komórkach. Opisuje różnicę wrażliwości badanego izolatu HIV na dany lek w porównaniu ze szczepem dzikim. Miarą tej różnicy jest wzrost stężenia leku hamującego replikację wirusa, najczęściej opisywany jako IC 50 lub IC 95 (IC inhibitory concentration). Jest to stężenie leku hamujące replikację HIV odpowiednio o 50% lub 95%, wyrażone w μm lub μg/ml. Ostateczny wynik jest podawany jako wskaźnik oporności (WO), będący ilorazem IC izolatu badanego wobec IC szczepu dzikiego. Klinicznie najistotniejszą wadą fenotypowania jest nieustalona dotychczas wartość WO jednoznacznie definiująca izolaty jako wrażliwe lub oporne. Obecnie obserwuje się zmniejszanie początkowo stosowanych DIAGNOSTYKA LABORATORYJNA ZAKA ENIA WIRUSEM HIV-1 I AIDS 43

10 wartości WO. Jednym z zasadnych wniosków jest ten, że poprzednie raporty nie doszacowywały lekooporności badanych izolatów. Inną wadą fenotypowania jest nierozróżnianie obecnych w badanej próbce subpopulacji różniących się lekoopornością. Dlatego uzyskiwany wynik jest uśrednieniem tej cechy. Większość leków nowych już w fazie projektowania lub wstępnych badań laboratoryjnych ma ocenianą potencjalną barierę genetyczną lub wrażliwość na oporność krzyżową. Dlatego też wiele leków nie wykazuje większej skuteczności inhibowania replikacji HIV niż leki generacji poprzednich, natomiast ich przewagą jest mniejsza zdolność selekcji szczepów opornych lub niepodatność na mechanizmy oporności krzyżowej. Przedstawione metody oznaczania lekooporności HIV są znacznym osiągnięciem diagnostyki wirusologicznej. Jednocześnie, w odróżnieniu od metod opisujących wiremię i profil immunologiczny, są najmniej doskonałym elementem diagnostyki zakażeń HIV. W wypadku metod genetycznych nie są poznane wszystkie mutacje powiązane z lekoopornością; nie zidentyfikowano wszelkich powiązań funkcjonalnych między współistniejącymi mutacjami, zawierających się między oddziaływaniami supresorowymi a synergistycznymi. Nie są do końca poznane oddziaływania mutacji na klinicznie obserwowany fenotyp, nie są także w pełni wyjaśnione mechanizmy oporności krzyżowej. Metody fenotypowe oceniają podatność na lek in vitro, kolejne etapy badania stwarzają liczne możliwości oceny artefaktu, nie zaś szczepu obecnego w organizmie pacjenta, są czasochłonne i drogie. Każdy z leków wykazuje też właściwą sobie barierę genetyczną liczbę i wagę mutacji niezbędnych do zmniejszenia lub zniesienia jego efektywności. Analiza filogenetyczna Uzyskane sekwencje HIV są dodatkowo wykorzystywane w badaniach epidemiologicznych: Identyfikacja subtypów HIV-1 w Europie, również w Polsce, obserwuje się zmiany wzorca subtypów. Dominujący subtyp B jest wypierany przez inne, tzw. non-b (other than B nowa propozycja). Proces ten może stać się czynnikiem utrudniającym diagnostykę, zwłaszcza genetyczną, gdyż większość testów jest optymalizowana (wykazuje najwyższe czułości i swoistości) wobec sekwencji subtypu HIV-1 B. Drzewka filogenetyczne ustalanie odległości genetycznych oraz pokrewieństwa między izolatami. Technika ta umożliwia śledzenie źródeł i dróg zakażeń, rozprzestrzenianie HIV oraz transmisję szczepów lekoopornych. 44 HIV/AIDS PODRÊCZNIK DLA LEKARZY I STUDENTÓW

11 Monitorowanie skutków ubocznych leczenia antyretrowirusowego Upowszechnianie terapii antyretrowirusowej oraz czas jej trwania zmuszają do śledzenia skutków ubocznych leczenia. Jedną z nowych metod, dostępną już w Polsce, jest ocena toksyczności mitochondrialnej leków z grupy NRTI. Wprowadzane są testy wykrywające uszkodzenie mt-dna lub oceniające wpływ leków na funkcjonowanie enzymów mitochondrialnych. Zakoñczenie Współczesna diagnostyka laboratoryjna zakażeń HIV i AIDS jest szybka, czuła i wiarygodna. Najważniejszym jej efektem jest ograniczanie szerzenia się infekcji. Dodatkowo usprawnia podejmowanie decyzji i dobór schematów leczenia i ułatwia dochodzenia epidemiologiczne. W efekcie poprawia jakość życia osób zakażonych HIV. Prawidłowy tok diagnostyczny powinien z wielu powodów minimalizować liczbę pobrań krwi. Liczne oznaczenia można wykonać z pojedynczych pobrań. Zaleca się, zgodnie z zasadami Dobrej Praktyki Laboratoryjnej (GLP), przechowywanie próbek zapasowych, wykorzystywanych do ponownych badań lub poszerzenia diagnostyki. Diagnostyka zakażeń HIV nie jest jeszcze doskonała. Usprawnień wymagają metody śledzenia lekooporności. Niezbędne są też wiarygodniejsze metody monitorowania uszkadzania układu odpornościowego oraz jego odbudowy w czasie terapii obecne oznaczanie liczby T CD4+ nie zawsze dokładnie opisuje rzeczywisty stan pacjenta. Udoskonaleń wymagają też stosowane testy potrzebne są nowe testy potwierdzenia, szersze zakresy pomiarów oraz testy wykrywające coraz częściej pojawiające się subtypy non-b. Najprawdopodobniej wraz z intensyfikacją i przedłużanym czasem leczenia kolejnym etapem usprawniania diagnostyki będzie upowszechnienie śledzenia działań niepożądanych leków. Piśmiennictwo: 1. Rekomendacje PTN AIDS, Warszawa, Saiki RK, Scharf S, Faloona F i wsp.: Enzymatic amplification of Beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia, Science 1985; 230: Sanger F, Coulson AR: A rapid method for determining sequences in DNA by primed synthesis with DNA polymerase, J Mol Biol 1975; 94: 441. DIAGNOSTYKA LABORATORYJNA ZAKA ENIA WIRUSEM HIV-1 I AIDS 45

12