Katedra i Zakład Mikrobiologii i Wirusologii Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej Mikrobiologia ogólna Biotechnologia medyczna II rok / I o Instrukcja do ćwiczeń Temat: Woda jako środowisko życia mikroorganizmów. Analiza sanitarna wody Cz.1/Cz.2/Cz.3 Wody powierzchniowe są drugim po glebie naturalnym środowiskiem bytowania mikroorganizmów. W wodach dominują bakterie, ale również występują w nich grzyby i ich zarodniki, wirusy i bakteriofagi. Ścieki komunalne, a także niektóre rodzaje ścieków przemysłowych, np. z rzeźni, garbarni, mleczarni wnoszą do zbiorników wodnych poza mikroorganizmami saprofitycznymi wirusy i bakterie chorobotwórcze. Pochodzą one przede wszystkim z odchodów ludzkich i zwierzęcych. Najbardziej groźnymi chorobami wirusowymi są: choroba Heinego-Medina, zapalenie opon mózgowordzeniowych, zapalenie mięśnia sercowego u noworodków, zapalenie jelita grubego, zapalenie wątroby. Najczęstszymi chorobami pochodzenia bakteryjnego, szerzącymi się przez zanieczyszczone wody są: tyfus i paratyfus wywołany przez bakterie z rodzaju Salmonella, czerwonka wywołana przez pałeczki Shigella, gruźlica Mycobacterium tuberculosis i cholera Vibrio cholerae. Zakażenia te mogą się szerzyć drogą wodno-pokarmową, ale także przez bezpośredni kontakt z osobami chorymi. Bakterie chorobotwórcze dostaja się do wody z wydalinami chorego. Przeżywalność tych bakterii w wodzie i ściekach zależy głównie od rodzajów mikroorganizmów, a także od warunków fizycznych i chemicznych. Waha się ona od kilku do kilkunastu dni, a przetrwalników nawet do kilkudziesięciu lat. Zakres analizy bakteriologiczno sanitarnej wody obejmuje następujące badania: 1. Oznaczanie ogólnej liczby mikroorganizmów zdolnych do wzrostu metodą posiewu na agarze odżywczym wg. PN-EN ISO 6222: 2004 2. Oznaczanie liczby bakterii z grupy coli, bakterii z grupy coli typ fekalny i Escherichia coli metodą filtracji membranowej wg PN-EN ISO 9308-1: 2004 metodą fermentacyjną probówkową wg. PN-75/C-04615/05: 1975 metodą fermentacyjną probówkową wg. PN-77/C-04615/07: 1977 3. Oznaczanie liczby enterokoków kałowych metodą filtracji membranowej wg PN-EN ISO 7899-2: 2004 metodą probówkową wg. PN-82/C-04615/25: 1982 4. Oznaczanie liczby Clostridium perfringens na podłożu m-cp metodą filtracji membranowej wg Dyrektywy 98/83/WE z dn. 3.11.1998r i PN-ISO 8199: 2001 1
OZNACZANIE OGÓLNEJ LICZBY MIKROORGANIZMÓW ZDOLNYCH DO WZROSTU METODĄ POSIEWU NA AGARZE ODŻYWCZYM wg. PN-EN ISO 6222:2004 (Jakość wody. Oznaczanie ilościowe mikroorganizmów zdolnych do wzrostu. Określanie ogólnej liczby kolonii metodą posiewu na agarze odżywczym). Wykonać rozcieńczenia wody: (płyn do rozcieńczeń - roztwór fizjologiczny z peptonem) - woda pitna z sieci wodociągowej: bez rozcieńczeń - woda ze studni: bez rozcieńczenia + 10-1 - woda powierzchniowa: rozcieńczenia od 10-1 do 10-5 - ścieki: rozcieńczenia od 10-1 do 10-8 Wykonać posiew wgłębny (po 1 ml próbki wody przenieść na 2 płytki Petriego (dla każdej temperatury) i zalać ostudzonym agarem odżywczym Inkubacja: - temp. 36 o C ± 2 o C przez 44 h ± 4 h - temp. 22 o C ± 2 o C przez 68 h ± 4 h Przedstawić wyniki jako liczbę jednostek tworzących kolonie na ml (jtk/ml) próbki dla każdej temperatury. Jeśli obserwuje się brak wzrostu kolonii na płytkach zaszczepionych określonymi objętościami nie rozcieńczonej próbki, wynik przedstawić jako nie wykryto w 1 ml. Jeżeli na płytkach zaszczepionych najwyższymi rozcieńczeniami jest ponad 300 kolonii, wynik przedstawić jako > 300 lub jedynie przybliżony. Uwaga! Oznaczenie na agarze odżywczym bakterii psychrofilnych (22 o C ± 2 o C) świadczy o zanieczyszczeniu wody substancjami organicznymi łatwo ulegającymi rozkładowi, natomiast bakterie mezofile (36 o C ± 2 o C), oznaczone na podłożu agarowym informują o zanieczyszczeniu wody fekaliami, a więc o możliwości zakażenia wody bakteriami chorobotwórczymi. 2
OZNACZANIE LICZBY BAKTERII Z GRUPY COLI, BAKTERII Z GRUPY COLI TYP FEKALNY I ESCHERICHIA COLI W WODZIE METODĄ FILTRACJI MEMBRANOWEJ wg PN-EN ISO 9308-1:2004 (Jakość wody. Wykrywanie i oznaczanie ilościowe Escherichia coli i bakterii grupy coli. Część 1: Metoda filtracji membranowej) BADANIA WSTĘPNE przygotować określone objętości próbek wody do przefiltrowania: - woda uzdatniona, dezynfekowana: 100 ml - woda uzdatniona, niedezynfekowana: 100 ml - woda ze studni: 100 ml i 10 ml - wody powierzchniowe: 10 ml i 1 ml - wody silnie zanieczyszczone: 1 ml i 0,1 ml Uwaga! W przypadku filtracji próbek wody o obj. 10 i 1 ml do aparatu filtracyjnego wlać dodatkowo 20-50 ml jałowego płynu Ringera - czterokrotnie rozc. i dokładnie wymieszać zawartość leja filtracyjnego przefiltrować próbki wody przez sterylny filtr membranowy (0,45 mm) TEST STANDARDOWY przenieść filtr membranowy na podłoże agarowe z laktozą (agar laktozowy TTC) temp. 36 o C±2 o C przez 21±3 h (można przedłużyć do 44±4 h ) kolonie, które na podłożu pod filtrem maja żółte zabarwienie (bakterie kaktozo-dodatnie) test na oksydazę test na indol TEST SZYBKI przenieść filtr membranowy na podłoże agarowe z kazeiną (agar TSA) temp. 36 o C±2 o C przez 4-5 h przenieść filtr na podłoże zaw. kazeinę (tryptyczny wyciąg kazeinowy) i sole żółci agar TBA temp. 44 o C±0,5 o C przez 19-20 h przenieść przynajmniej 3 kolonie przenieść przynajmniej 3 kolonie przenieść filtr i umieścić na agar TSA na bulion tryptofanowy na krążku bibułowym nasączonym odczynnikiem do testu na wyrywanie indolu temp. 36 o C±2 o C przez 21±2 h wykonać test na oksydazę cytochromową temp. 44 o C±0,5 o C przez 21±3 h dodać 0,2-0,3 ml odczynnika Kovacsa czerwony pierścień wystawić na działanie lampy UV przez 10-30 minut wszystkie czerwone kolonie policzyć jako E. coli Uwaga! W przypadku oznaczania liczby bakterii z grupy coli typ fekalny należy kolonie oksydazo-ujemne przesiać na podłoże Endo i przeprowadzić inkubację w temperaturze 44 o C±1 o C przez 24±2 h. Jako należy uznać wzrost w postaci ciemnoczerwonych kolonii charakteryzujących się często zielonozłotych metalicznym połyskiem. Wynik końcowy podać zgodnie z normą PN-EN ISO 9308-1:2004 (Jakość wody. Wykrywanie i oznaczanie ilościowe Escherichia coli i bakterii grupy coli. Część 1: Metoda filtracji membranowej) jako liczbę bakterii z grupy coli lub bakterii z grupy coli typ fekalny lub Escherichia coli w 100 ml próbki wody. 3
OZNACZANIE LICZBY BAKTERII Z GRUPY COLI W WODZIE METODĄ FERMENTACYJNĄ PROBÓWKOWĄ wg. PN-75/C-04615/05:1975 (Woda i ścieki. Badania mikrobiologiczne. Oznaczanie bakterii grupy coli metodą fermentacyjną probówkową) BADANIA WSTĘPNE posiać podane objętości próbek wody na podłoże Eijkmana (LPB) + rurki Durhama: a) woda uzdatniona, dezynfekowana: - 5 x po 10 ml na (2x)LPB - 1 x po 50 ml na (2x)LPB b) woda uzdatniona, niedezynfekowana woda ze studni, wody powierzchniowe i ścieki - 2/3 x 10 ml na (2x)LPB - 2/3 x 1 ml na (1x)LPB - 2/3 x 1 ml na (1x)LPB z rozcieńczeń: 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5 Uwaga! W przypadku rozcieńczania próbek wody użyć jałowego płynu do rozcieńczeń temp. 37 o C przez 24-48 h (po 24 h obejrzeć hodowle) obecność gazu w rurkach Durhama i zmiana barwy pożywki z fioletowej na żółtą (probówki bez widocznych zmian inkubować do 48 h) BADANIA POTWIERDZAJĄCE posiew na podłoże Endo lub Endo wg ISO z każdej dodatniej hodowli po 24 h oraz hodowli dodatnich i wątpliwych po 48 h przenieść ezą zawiesinę bakterii (posiew redukcyjny) na podłoże Endo kolonie ciemnoczerwone z metalicznym zielonozłotym połyskiem (obecność grupy coli) temp. 37 o C przez 24 h wynik wątpliwy kolonie czerwone lub różowe bez połysku BADANIA UZUPEŁNIAJĄCE 1. przeszczepić kolonie nietypowe do probówek 2. kolonie nietypowe przeszczepić 3. test na oksydazę z pożywkę laktozową na skosy agarowe ze wsk. Andrade (5 ml) + rurki Durhama temp. 37 o C przez 24 h temp. 37 o C przez 48 h : gaz w rurkach Durhama i różowe zabarwienie podłoża (obecność grupy coli) wykonać 2 preparaty barwione metodą Grama Wynik końcowy odczytać z tablic podanych w Normie PN-75 C-04615/05 - Woda i ścieki. Badania mikrobiologiczne. Oznaczanie bakterii grupy coli metodą fermentacyjną probówkową i podać jako NPL bakterii z grupy coli w 100 ml próbki wody. 4
OZNACZANIE LICZBY BAKTERII Z GRUPY COLI TYP FEKALNY I ESCHERICHIA COLI W WODZIE METODĄ FERMENTACYJNĄ PROBÓWKOWĄ wg. PN-77/C-04615/07:1977 (Woda i ścieki. Badania mikrobiologiczne: Oznaczanie bakterii grupy coli typu kałowego (fekalnego) metodą fermentacyjną probówkową). 4. Przebieg procedury BADANIA WSTĘPNE posiać podane objętości próbek wody na podłoże Eijkmana (LPB) + rurki Durhama: c) woda uzdatniona, dezynfekowana: - 5 x po 10 ml na (2x)LPB - 1 x po 50 ml na (2x)LPB d) woda uzdatniona, niedezynfekowana woda ze studni, wody powierzchniowe i ścieki - 2/3 x 10 ml na (2x)LPB - 2/3 x 1 ml na (1x)LPB - 2/3 x 1 ml na (1x)LPB z rozcieńczeń: 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5 Uwaga! W przypadku rozcieńczania próbek wody użyć jałowego płynu do rozcieńczeń temp. 44 o C przez 24-48 h (po 24 h obejrzeć hodowle) obecność gazu w rurkach Durhama i zmiana barwy pożywki z fioletowej na żółtą (probówki bez widocznych zmian inkubować do 48 h) posiew na podłoże Endo wg ISO posiew na podłoże z zielenią lub posiew na bulion tryptofanowy brylantową + rurki Durhama + rurki Durhama temp. 44 o C przez 24 h temp. 44 o C przez 24 h temp. 44 o C przez 24 h kolonie ciemnoczerwone zmętnienie podłoża zmętnienie podłoża z metalicznym zielonozłotym połyskiem + gaz + gaz (obecność grupy coli typu fekalnego i czerwony pierścień domniemanych E. coli) potwierdzenie przynależności domniemanych E. coli do E. coli po dodaniu od. Kovacsa posiew na bulion tryptofanowy temp. 44 o C przez 24 h dodać 0,2-0,3 ml odczynnika Kovacsa czerwony pierścień Wynik końcowy odczytać z tablic podanych w Normie PN-75/C-04615/05 - Woda i ścieki. Badania mikrobiologiczne. Oznaczanie bakterii grupy coli metodą fermentacyjną probówkową i podać jako NPL bakterii z grupy coli typ fekalny lub Escherichia coli w 100 ml próbki wody w 100 ml próbki wody. 5
OZNACZANIE LICZBY ENTEROKOKÓW KAŁOWYCH W WODZIE METODĄ FILTRACJI MEMBRANOWEJ wg PN-EN ISO 7899-2:2004 (Jakość wody. Wykrywanie i oznaczanie ilościowe enterokoków kałowych. Część 2: Metoda filtracji membranowej). Przygotować określone objętości próbek wody do przefiltrowania: - woda uzdatniona, dezynfekowana: 100 ml - woda uzdatniona, niedezynfekowana: 100 ml - woda ze studni: 100 ml i 10 ml - wody powierzchniowe: 10 ml i 1 ml - wody silnie zanieczyszczone: 1 ml i 0,1 ml Uwaga! W przypadku filtracji próbek wody o obj. 10 i 1 ml do aparatu filtracyjnego wlać dodatkowo 20-50 ml jałowego płynu do rozcieńczeń i dokładnie wymieszać zawartość leja filtracyjnego przefiltrować próbki wody przez sterylny filtr membranowy (0,45 mm) przenieść filtr membranowy na podłoże Slanetza i Bartleya : temp. 36 o C ± 2 o C przez 44 ± 4h : kolonie 0,2-1 mm, (obserwować pod lupą) koloru czerwonego, czerwonawego z ciemniejszym środkiem lub różowym lub barwy kasztanowej przenieść filtr nie odwracając go na wstępnie ogrzane do 44 o C podłoże agarowe z żółcią, eskuliną i azydkiem temp. 44 o C ± 0,5 o C przez 2h policzyć kolonie wokół których podłoże przybiera barwę brązową do czarnej Wynik końcowy podać zgodnie z normą PN-EN ISO 7899-2:2004 (Jakość wody. Wykrywanie i oznaczanie ilościowe enterokoków kałowych. Część 2: Metoda filtracji membranowej) jako liczbę enterokoków kałowych w 100 ml próbki wody. 6
OZNACZANIE ENTEROKOKÓW KAŁOWYCH W WODZIE METODĄ PROBÓWKOWĄ wg. PN- 82/C-04615/25:1982 (Woda i ścieki. Badania mikrobiologiczne: Oznaczanie paciorkowców kałowych metodą filtrów membranowych (FM) i metodą probówkową). BADANIE WSTĘPNE posiać podane objętości próbek wody na podłoże (APB z azydkiem i purpurą bromokrezolową) e) woda uzdatniona, dezynfekowana: - 5 x po 10 ml na (2x) APB - 1 x po 50 ml na (2x) APB f) woda uzdatniona, niedezynfekowana woda ze studni, wody powierzchniowe i ścieki - 2/3 x 10 ml na (2x) APB - 2/3 x 1 ml na (1x) APB - 2/3 x 1 ml na (1x) APB z rozcieńczeń: 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5 Uwaga! W przypadku rozcieńczania próbek wody użyć jałowego płynu do rozcieńczeń temp. 37 o C przez 24-48 h : zmętnienie podłoża i zmiana zabarwienia z czerwonej na żółtą Badania potwierdzające przenieść trzykrotnie ezą z dodatnich hodowli na podłożu APB materiał do probówek z 5 ml podłoża z azydkiem sodowym i fioletem etylowym (AFE) temp. 37 o C przez 48 h (odczyt zrobić już po 24 h) Wynik dodatni: niebieski osad bakterii na dnie probówki Wynik końcowy odczytać z tablic podanych w Normie PN-82/C-04615/25: 1982 - Woda i ścieki. Badania mikrobiologiczne: Oznaczanie paciorkowców kałowych metodą filtrów membranowych (FM) i metodą probówkową i podać jako NPL bakterii z grupy coli w 100 ml próbki wody. 7
OZNACZANIE LICZBY CLOSTRIDIUM PERFRINGENS W WODZIE NA PODŁOŻU m-cp METODĄ FILTRACJI MEMBRANOWEJ wg Dyrektywy 98/83/WE z dn. 3.11.1998r i PN-ISO 8199: 2001 (Jakość wody. Ogólne wytyczne oznaczania liczby bakterii metodą hodowl). Filtracja: Przefiltrować przez filtr membranowy określoną objętość badanej próbki wody (zazwyczaj 100 ml). W przypadku wód silniej zanieczyszczonych przefiltrować dodatkowo 10 i 1 ml próbki i do tego celu użyć sterylnego płynu do rozcieńczeń w ilości od 20 do 50 ml. W przypadku oznaczania liczby spor Clostridium perfringens próbkę wody przed filtracją należy ogrzać w temperaturze 60±2 o C przez 15 min ±1 min. Przenieść filtr membranowy na agar m-cp w taki sposób aby pod filtrem nie powstawały pęcherzyki powietrza. Następnie płytki odwrócić i poddać inkubacji. Inkubacja: 44 o C±1 o C / 21±3 h w warunkach beztlenowych Odczyt: Po określonym czasie inkubacji policzyć wyrosłe kolonie. Za domniemane Clostridium perfringens należy uznać wszystkie rosnące na agarze m-cp w postaci żółtych kolonii. Podłoże pod filtrem przyjmuje zabarwienie żółte. Potwierdzenie: Umieścić otwarta płytkę z filtrem membranowym w pojemniku z oparami wody amoniakalnej. Po 20-30 s dokonać odczytu. Za należy uznać te kolonie, które zmieniły barwę z żółtej na różową Wynik podać jako liczbę Clostridium perfringens lub liczbę spor Clostridium perfringens w 100 ml próbki wody. 8