Ćwiczenie VII. Reaktywne formy tlenu (RFT)

Podobne dokumenty
CHARAKTERYSTYKI SPEKTRALNE UTLENIONEJ I ZREDUKOWANEJ FORMY CYTOCHROMU C

Antyoksydanty pokarmowe a korzyści zdrowotne. dr hab. Agata Wawrzyniak, prof. SGGW Katedra Żywienia Człowieka SGGW

Ćwiczenie nr 5 - Reaktywne formy tlenu

Badanie aktywności enzymów z klasy oksydoreduktaz. Oznaczenie witaminy C

Badanie oddziaływania polihistydynowych cyklopeptydów z jonami Cu 2+ i Zn 2+ w aspekcie projektowania mimetyków SOD

Wolne rodniki w komórkach SYLABUS A. Informacje ogólne

Wykazanie obecności oksydoreduktaz w materiale biologicznym

Biochemia Ćwiczenie 4

Spektrofotometryczna metoda oznaczania aktywności peroksydazy

STRES OKSYDACYJNY WYSIŁKU FIZYCZNYM

Program zajęć z biochemii dla studentów kierunku weterynaria I roku studiów na Wydziale Lekarskim UJ CM w roku akademickim 2013/2014

BADANIE WŁASNOŚCI KOENZYMÓW OKSYDOREDUKTAZ

Laboratorium 8. Badanie stresu oksydacyjnego jako efektu działania czynników toksycznych

KREW: 1. Oznaczenie stężenia Hb. Metoda cyjanmethemoglobinowa: Zasada metody:

3. Badanie kinetyki enzymów

Oznaczanie żelaza i miedzi metodą miareczkowania spektrofotometrycznego

Oznaczanie mocznika w płynach ustrojowych metodą hydrolizy enzymatycznej

KINETYKA REAKCJI ENZYMATYCZNYCH

SEMINARIUM 8:

Tlen pierwiastek życia i śmierci. Zakład Chemii Medycznej Pomorski Uniwersytet Medyczny

Część 1: Strategia ataku 15

Wykrywanie obecności enzymów.

Aktywuj geny młodości. Badanie genetyczno-biochemiczne dotyczące własnych możliwości organizmu do spowolnienia procesów starzenia.

Laboratorium 5. Wpływ temperatury na aktywność enzymów. Inaktywacja termiczna

Biochemia Ćwiczenie 7 O R O P

Sprawozdzanie z ćwiczenia nr 3 - Kinetyka enzymatyczna

Przemiana materii i energii - Biologia.net.pl

Dr Paweł Krzyczmonik. Pracownia Elektrochemii i Korozji UŁ. 13 marzec 2013

Biochemia Oddychanie wewnątrzkomórkowe

CHEMIA. Wymagania szczegółowe. Wymagania ogólne

Reaktywne formy tlenu. Zakład Chemii Medycznej Pomorski Uniwersytet Medyczny

OZNACZANIE ŻELAZA METODĄ SPEKTROFOTOMETRII UV/VIS

Bliskie spotkania z biologią METABOLIZM. dr hab. Joanna Moraczewska, prof. UKW. Instytut Biologii Eksperymetalnej, Zakład Biochemii i Biologii Komórki

Mechanizmy działania i regulacji enzymów

data ĆWICZENIE 8 KINETYKA RERAKCJI ENZYMATYCZNEJ Wstęp merytoryczny

Ćwiczenie 3 Ilościowe oznaczanie glutationu (GSH) metodą Ellmana

Laboratorium 4. Określenie aktywności katalitycznej enzymu. Wprowadzenie do metod analitycznych. 1. CZĘŚĆ TEORETYCZNA

Kryteria oceniania z chemii kl VII

LABORATORIUM Z KATALIZY HOMOGENICZNEJ I HETEROGENICZNEJ WYZNACZANIE STAŁEJ SZYBKOŚCI REAKCJI UTLENIANIA POLITECHNIKA ŚLĄSKA WYDZIAŁ CHEMICZNY

Połączenia międzykomórkowe i macierz zewnątrzkomórkowa. Połączenia międzykomórkowe. Połączenia międzykomórkowe. zapewniają : uszczelnienie komórek

Krew należy poddać hemolizie, która zachodzi pod wpływem izotonicznego odczynnika Drabkina.

Reakcje chemiczne. Typ reakcji Schemat Przykłady Reakcja syntezy

CZYNNIKI WPŁYWAJĄCE NA SZYBKOŚĆ REAKCJI CHEMICZNYCH. ILOŚCIOWE ZBADANIE SZYBKOŚCI ROZPADU NADTLENKU WODORU.

Czy można zastosować ultradźwięki do niszczenia tkanki nowotworowej?

data ĆWICZENIE 12 BIOCHEMIA MOCZU Doświadczenie 1

Chemia klasa VII Wymagania edukacyjne na poszczególne oceny Semestr II

WŁASNOŚCI SPEKTRALNE NUKLEOTYDÓW PIRYDYNOWYCH (NAD +, NADP + ) OZNACZANIE AKTYWNOŚCI TRANSAMINAZY ALANINOWEJ

Zadanie 2. [2 pkt.] Podaj symbole dwóch kationów i dwóch anionów, dobierając wszystkie jony tak, aby zawierały taką samą liczbę elektronów.

Ćwiczenie 8 Wyznaczanie stałej szybkości reakcji utleniania jonów tiosiarczanowych

Dr Paweł Krzyczmonik. Zakład Elektroanalizy i Elektrochemii UŁ. 23 październik 2013

PRACOWNIA CHEMII. Równowaga chemiczna (Fiz2)

X / \ Y Y Y Z / \ W W ... imię i nazwisko,nazwa szkoły, miasto

Biochemia zadymionych komórek

Równowaga kwasowo-zasadowa. Zakład Chemii Medycznej Pomorski Uniwersytet Medyczny

Zn + S ZnS Utleniacz:... Reduktor:...

Opracowała: mgr inż. Ewelina Nowak

EKSTRAHOWANIE KWASÓW NUKLEINOWYCH JAK ZMIERZYĆ ILOŚĆ KWASÓW NUKLEINOWYCH PO IZOLACJI? JAK ZMIERZYĆ ILOŚĆ KWASÓW NUKLEINOWYCH PO IZOLACJI?

Wymagania edukacyjne na poszczególne roczne oceny klasyfikacyjne z przedmiotu chemia dla klasy 7 w r. szk. 2019/2020

Bliskie spotkania z biologią. METABOLIZM część II. dr hab. Joanna Moraczewska, prof. UKW

OKSYDOREDUKTAZY WPROWADZENIE

REAKTYWNE FORMY TLENU

SZCZEGÓŁOWE KRYTERIA OCENIANIA Z CHEMII DLA KLASY II GIMNAZJUM Nauczyciel Katarzyna Kurczab

Opracowała: mgr inż. Ewelina Nowak

Reaktywne formy tlenu. Zakład Chemii Medycznej Pomorski Uniwersytet Medyczny

WYBRANE SKŁADNIKI POKARMOWE A GENY

KINETYKA REAKCJI ENZYMATYCZNYCH Wyznaczenie stałej Michaelisa i maksymalnej szybkości reakcji hydrolizy sacharozy katalizowanej przez inwertazę.

CHEMIA klasa 1 Wymagania programowe na poszczególne oceny do Programu nauczania chemii w gimnazjum. Chemia Nowej Ery.

Mechanizm działania buforów *

Ćwiczenie 1: Wyznaczanie warunków odporności, korozji i pasywności metali

SPIS TREŚCI OD AUTORÓW... 5

MECHANIZM NEUROHORMONALNY

ĆWICZENIE 3. I. Analiza miareczkowa mocnych i słabych elektrolitów

TYPY REAKCJI CHEMICZNYCH

Oddychanie komórkowe. Pozyskiwanie i przetwarzanie energii w komórkach roślinnych. Oddychanie zachodzi w mitochondriach Wykład 7.

Połączenia międzykomórkowe i macierz zewnątrzkomórkowa

1. Określ, w którą stronę przesunie się równowaga reakcji syntezy pary wodnej z pierwiastków przy zwiększeniu objętości zbiornika reakcyjnego:

Nukleotydy w układach biologicznych

Dlaczego jeszcze warto suplementować się ORAColem?

Ćwiczenie 7. Wyznaczanie stałej szybkości oraz parametrów termodynamicznych reakcji hydrolizy aspiryny.

Reakcje zachodzące w komórkach

1. PRZYGOTOWANIE ROZTWORÓW KOMPLEKSUJĄCYCH

Równowaga kwasowo-zasadowa. Zakład Chemii Medycznej PUM

JAK ZMIERZYĆ ILOŚĆ KWASÓW NUKLEINOWYCH PO IZOLACJI? JAK ZMIERZYĆ ILOŚĆ KWASÓW NUKLEINOWYCH PO IZOLACJI?

Mechanizmy obrony przed RFT. Zakład Chemii Medycznej Pomorski Uniwersytet Medyczny

WOJEWÓDZKI KONKURS PRZEDMIOTOWY Z CHEMII DLA UCZNIÓW GIMNAZJÓW - rok szkolny 2016/2017 eliminacje wojewódzkie

d[a] = dt gdzie: [A] - stężenie aspiryny [OH - ] - stężenie jonów hydroksylowych - ] K[A][OH

Konkurs przedmiotowy z chemii dla uczniów dotychczasowych gimnazjów 24 stycznia 2018 r. zawody II stopnia (rejonowe)

data ĆWICZENIE 7 DYSTRYBUCJA TKANKOWA AMIDOHYDROLAZ

Spis treści. Właściwości fizyczne. Wodorki berylowców. Berylowce

RÓWNOWAGI REAKCJI KOMPLEKSOWANIA

PRACOWNIA CHEMII. Kinetyka reakcji chemicznych (Fiz1)

SPEKTROFOTOMETRYCZNA ANALIZA

Wymagania przedmiotowe do podstawy programowej - chemia klasa 7

Nazwy pierwiastków: A +Fe 2(SO 4) 3. Wzory związków: A B D. Równania reakcji:

Metody fosforylacji. Schemat 1. Powstawanie trifosforanu nukleozydu

Źródła energii dla mięśni. mgr. Joanna Misiorowska

Spektroskopia molekularna. Ćwiczenie nr 1. Widma absorpcyjne błękitu tymolowego

Konkurs przedmiotowy z chemii dla uczniów gimnazjów 13 stycznia 2017 r. zawody II stopnia (rejonowe)

KONKURS CHEMICZNY DLA UCZNIÓW GIMNAZJUM W ROKU SZKOLNYM 2012/2013

Zadanie 1. [ 3 pkt.] Uzupełnij zdania, wpisując brakującą informację z odpowiednimi jednostkami.

Transkrypt:

Ćwiczenie VII Reaktywne formy tlenu (RFT) (1) Porównanie widm absorpcyjnych utlenionej i zredukowanej formy cytochromu c (2) Wytwarzanie i usuwanie anionorodnika ponadtlenkowego ZAGADIEIA D PRZYGTWAIA: 1. Źródła powstawania reaktywnych form tlenu (RFT) w komórce 2. Mechanizmy obronne komórki przed działaniem RFT 3. Rola oksydazy ksantynowej w powstawaniu anionorodnika ponadtlenkowego w procesie degradacji puryn WPRWADZEIE Tlen jest jednym z pierwiastków niezbędnych do utrzymania życia na Ziemi. Jednak tlen i jego zwiazki w niektórych warunkach mogą okazać się toksyczne i powodować uszkodzenie tkanek i narządów. koło 5% wdychanego 2 przekształca się w reaktywne formy tlenu jest to około 2 kg rocznie. W organizmie reaktywne formy tlenu (RFT lub RS - reactive oxygen species) mogą powstawać w wyniku działania zewnętrznych czynników, takich jak np. promieniowanie jonizujące. Jednakże znacznie bardziej istotne jest powstawanie RFT wynikające z jednoelektronowego utleniania wielu związków zarówno endo- jaki egzogennych przez tlen cząsteczkowy. Głównym źródłem wolnych rodników w warunkach fizjologicznych są procesy oddechowe w mitochondriach, gdzie poprzez czteroelektronową redukcję cząsteczki 2 powstaje woda, ale wskutek nieszczelności układu może dochodzić do wycieku elektronów i tylko częściowej redukcji tlenu. W reakcji jednoelektronowej redukcji tlenu powstaje anionorodnik ponadtlenkowy 2. Szczególną rolę w wytwarzaniu RFT pełnią limfocyty, monocyty i makrofagi. becność w organizmie ognisk zapalnych stymuluje gwałtowny wzrost zużycia tlenu ( wybuch tlenowy ) przez fagocytujące komórki. Podczas fagocytozy obserwuje się wzmożone wytwarzanie 2, w reakcji katalizowanej przez oksydazę ADP usytuowaną w błonie granulocytów: ADP + 2 2 ADP + + + + 2 RFT powstają także w wyniku autooksydacji związków endo- i egzogennych, reakcji katalizowanych przez oksydazy oraz przez jony metali przejściowych. W większości przemian biologicznych jako pierwszy wytwarzany jest anionorodnik ponadtlenkowy (2 ), którego pojawienie się pociąga za sobą powstawanie następnych RFT,

np. nadtlenku wodoru czy rodnika hydroksylowego. Do najważniejszych reaktywnych form tlenu zalicza się: Rodnikowe pochodne tlenu: 2 anionorodnik ponadtlenkowy jest produktem jednoelektronowej redukcji tlenu; rodnik raczej mało reaktywny, powstaje: jako produkt uboczny łańcucha oddechowego, w procesach katalizowanych przez rożne oksydazy (np. ksantynową), oraz wytwarzany jest celowo przez oksydazę ADP. 2 rodnik wodoronadtlenkowy jest bardziej reaktywny. rodnik hydroksylowy charakteryzuje się bardzo dużą reaktywnością i toksycznością; reaguje z większością cząsteczek występujących w organizmie; należy do najmocniejszych biologicznych utleniaczy, może utlenić praktycznie wszystkie biologicznie ważne związki w organizmie. ierodnikowe (toksyczne) pochodne tlenu: 2 2 nadtlenek wodoru powstaje z anionorodnika ponadtlenkowego w reakcji enzymatycznej katalizowanej przez dysmutazę ponadtlenkową (SD) oraz jest produktem licznych oksydaz. W komórkach może być metabolizowany przez peroksydazę glutationową lub przez katalazę. Mimo, że nie jest wolnym rodnikiem odgrywa ważną rolę w procesach oksydacyjnych. Może przenikać przez błony komórkowe. Jest głównym substratem reakcji wytwarzających silnie toksyczny rodnik hydroksylowy. 1 2 tlen singletowy forma singletowa tlenu jest formą wzbudzoną, o wyższej energii. Cząsteczka niewzbudzona tlenu jest w stanie trypletowym (2 elektony walencyjne w cząsteczce tlenu rozmieszczone są, zgodnie z regułą unda, na dwóch orbitalach cząsteczkowych, tworząc 2 niesparowane elektrony). W tlenie singletowym eletrony te są rozmieszczone niezgodnie z regułą unda). Tlen singletowy jest jedną z głównych toksycznych form tlenu w żywych organizmach. ddziałuje z innymi cząsteczkami na dwa sposoby: przechodząc w stan trypletowy, przekazuje energię wzbudzenia lub wchodzi z cząsteczkami w reakcję chemiczną Mechanizm tworzenia wolnych rodników przy udziale jonów metali grup przejściowych przedstawiają reakcje Fentona (1, 2) i abera-weissa (3). Fe 2+ + 2 2 Fe 3+ + + (1) Utleniony metal pełni rolę katalizatora (może być on później zredukowany): Fe 3+ + 2 Fe 2+ + 2 (2) ba te mechanizmy można przedstawić w reakcji abera-weissa: Fe 2+ /Fe 3+ 2 + 2 2 2 + + (3) Działanie RFT prowadzi m.in. do utleniania związków niskocząsteczkowych (glutation, askorbinian), degradacji kolagenu, depolimeryzacji kwasu hialuronowego, utleniania hemoglobiny, inaktywacji enzymów, inaktywacji białek transportowych, pęknięć nici DA, uszkodzenia zasad DA, uszkodzeń chromosomów, peroksydacji lipidów błon (powodującej m.in. lizę (rozpad) erytrocytów), zaburzeń wewnątrzkomórkowej homeostazy Ca 2+, modyfikacji właściwości antygenowych komórek, agregacji płytek krwi, zmian morfologii komórek, powstawania mutacji, transformacji nowotworowej komórek.

W organizmie funkcjonuje wiele mechanizmów chroniących przed działaniem RFT. Do najważniejszych antyoksydantów w ustroju zalicza się niskocząsteczkowe przeciwutleniacze, takie jak: glutation, witaminy E i C (kwas askorbinowy), kwas moczowy, bilirubina, flawonoidy. Enzymy usuwające RFT to: dysmutaza ponadtlenkowa, katalaza, peroksydaza glutationowa. Rola oksydazy ksantynowej w powstawaniu anionorodnika ponadtlenkowego w procesie degradacji puryn: Końcowym produktem degradacji nukleotydów purynowych, w organizmach ssaków jest kwas moczowy. Jednym z enzymów prowadzących do jego powstania jest oksydaza ksantynowa, która katalizuje reakcję utleniania hipoksantyny do ksantyny oraz reakcję utleniania ksantyny do kwasu moczowego. Występuje m.in. w wątrobie, śluzówce jelita i w mleku. Przebieg reakcji katalizowanej przez oksydazę ksantynową przedstawia schemat: oksydaza ksantynowa oksydaza ksantynowa 2 + 2 2 2 2 + 2 2 2 hipoksantyna ksantyna kwas moczowy W cząsteczce oksydazy ksantynowej, poza dwiema cząsteczkami FAD znajdują się dwa jony molibdenu (VI) oraz osiem jonów żelaza tworzących centra żelazo-siarkowe. Podczas reakcji katalizowanej przez oksydazę ksantynową działa miniaturowy łańcuch transportu elektronów z utlenianego substratu na tlen: e Substrat Mo 6+ e e e FAD kompleks Fe-S 2 iedobór molibdenu w diecie może doprowadzić do obniżenia aktywności oksydazy ksantynowej w wątrobie. Częściej jednak opisywane są schorzenia wynikające z nadmiernej syntezy kwasu moczowego lub z upośledzenia wydalania tego związku. Stężenie kwasu moczowego w osoczu krwi kobiet wynosi 150-360 μmoli/l, w osoczu krwi mężczyzn 200-480 μmoli/l. admierne wytwarzanie kwasu moczowego może powodować chorobę atakującą stawy i nerki, określaną mianem skazy lub dny moczanowej albo podagry. W tym schorzeniu stężenie moczanu w osoczu i w moczu wzrasta. Kryształy soli moczanowych osadzają się w stawach i w nerkach. W leczeniu dny moczanowej, dla zahamowania aktywności oksydazy ksantynowej, stosuje się analog hipoksantyny allopurynol. Allopurynol jest substratem reakcji katalizowanej przez oksydazę ksantynową, lecz produkt jego utlenienia, alloksantyna, wiąże się bardzo silnie z centrum katalitycznym enzymu, hamując jego aktywność. Jest to przykład samobójczego działania produktu reakcji katalizowanej na enzym. oksydaza ksantynowa 2 + 2 2 2 allopurynol alloksantyna W biologicznych reakcjach utleniania-redukcji, które przebiegają z udziałem flawoprotein często - jako produkt uboczny jednoelektronowej redukcji tlenu cząsteczkowego - powstaje anionorodnik ponadtlenkowy ( 2 ). ukleotyd flawinowy

(FAD) może w tych reakcjach przyjmować jeden elektron (powstaje rodnik semichinonowy) lub dwa elektrony (powstaje wtedy forma zredukowana nukleotydu flawinowego FAD 2 ). ( + + e) - Flawina utleniona (FAD) 2 (2 + + 2e) -. Flawina czesciowo zredukowana (FAD ) ` ` ( + + e) - Flawina zredukowana (FAD2) Zredukowana flawina, w kolejnej reakcji utleniania redukcji jest zdolna do przekazania, odpowiedniej cząsteczce akceptora, jednego bądź dwu elektronów. Jeżeli akceptorem tym jest tlen cząsteczkowy, to w wyniku jednoelektronowej reakcji powstaje anionorodnik ponadtlenkowy: Enz-FAD 2 + 2 Enz-FAD + 2 + + atomiast dwuelektronowa redukcja tlenu prowadzi do powstania nadtlenku wodoru: Enz-FAD 2 + 2 + 2e + 2 + Enz-FAD + 2 2 Zarówno anionorodnik ponadtlenkowy jak i nadtlenek wodoru ulegają reakcjom dysproporcjonowania (dysmutacji) (4, 5): 2 + 2 + 2 + 2 2 + 2 (4) 2 2 + 2 2 2 2 + 2 (5) w reakcjach spontanicznych lub w reakcjach katalizowanych enzymami o odpowiedniej specyficzności. Dysmutazy anionodników ponadtlenkowych (Super xide Dismutase, SD), czyli dysmutazy ponadtlenkowe są enzymami powszechnie występującymi w tkankach zwierzęcych. W cytoplazmie komórek ssaków znajduje się dysmutaza zawierająca jony miedzi i cynku (CuZnSD), w mitochondriach - dysmutaza ponadtlenkowa zawierająca jony manganu (MnSD), na powierzchni komórek zlokalizowana jest tzw. pozakomórkowa dysmutaza ponadtlenkowa (ECSD). Działanie tego enzymu polega na usuwaniu anionorodnika ponadtlenkowego (reakcja 4). Reakcja dysmutacji nadtlenku wodoru katalizowana jest przez katalazę, enzym zawierający układ hemowy. Katalaza występuje w niemal wszystkich tkankach zwierzęcych - przede wszystkim w wątrobie, erytrocytach i nerkach. Działanie tego enzymu usuwa nadtlenek wodoru, który powstaje podczas utleniania zredukowanych flawoprotein. (reakcja 5) Eksperymentalne tworzenie, wykrywanie i usuwanie anionorodnika ponadtlenkowego. W przeprowadzanych doświadczeniach student obserwuje przebieg reakcji przedstawionych na schemacie:

allopurynol 2 2 + ksantyna + 2 (II) (hamowanie aktywnosci enzymu) (I) oksydaza ksantynowa (FAD 2 /FAD). 2 + moczan + 2 2 (V) katalaza 2 + 1/ 2 2 (III) 2 + SD (VI) cytochrom c (Fe III) 2 2 +. + (IV) cytochrom c (Fe II) (A 550nm ) Schemat przedstawia model doświadczalny, w którym anionorodnik ponadtlenkowy powstaje w wyniku utlenienia ksantyny tlenem cząsteczkowym, w reakcji katalizowanej przez oksydazę ksantynową (reakcja I). Powstający anionorodnik ponadtlenkowy redukuje cytochrom c (reakcja III). Zredukowana forma cytochromu c wykazuje silną absorbancję przy długości fali 550 nm, a stężenie tej formy zależy od stężenia anionu ponadtlenkowego, który jest donorem elektronów w reakcji III. Jednakże ilościowe oznaczanie anionorodnika ponadtlenkowego komplikuje fakt, że w mieszaninie reakcyjnej powstaje także nadtlenek wodoru, który z jednej strony jest produktem reakcji katalizowanej przez oksydazę ksantynową (reakcja I) a z drugiej strony, może powstawać jako produkt spontanicznie przebiegającej reakcji dysmutacji anionorodnika ponadtlenkowego (proces analogiczny do reakcji VI, ale bez udziału enzymu). adtlenek wodoru powoduje reoksydację cytochromu c (reakcja IV). W efekcie, w miarę postępu reakcji katalizowanej przez oksydazę ksantynową obserwuje się, od pewnego momentu, zmniejszenie absorbancji przy 550 nm. Aby zapobiec utlenianu (reoksydacji) cytochromu c do mieszaniny reakcyjnej wprowadza się katalazę, która usuwa nadtlenek wodoru (reakcja V). Wówczas, cytochrom c jest końcowym akceptorem elektronów przekazywanych z anionorodnika ponadtlenkowego. a stężenie zredukowanej formy cytochromu c odpowiada stechiometrycznie stężeniu anionorodników ponadtlenkowych w badanej mieszaninie reakcyjnej. Stąd, pośrednio, na podstawie pomiaru absorbancji przy 550 nm, można określić w roztworze stężenie anionorodników ponadtlenkowych. Reakcja I hamowana jest przez allopurynol (reakcja II). Anionorodnik ponadtlenkowy w badanym układzie modelowym, usuwany jest w reakcji dysmutacji katalizowanej przez dysmutazę ponadtlenkową (SD)(reakcja VI). WYKAIE Studenci otrzymują następujące roztwory (wcześniej przygotowane i podpisane literami: A, D, E, F,, I, G): A. 50 mm bufor fosforanowy p 7,6 zawierający 0,1 mm EDTA (związek kompleksujący jony metali). D. Mieszanina ksantyny i utlenionej formy cytochromu c sporządzona przez zmieszanie roztworów B i C (v/v 1 : 10). Roztwór B: 1 mg ksantyny rozpuszczony w 10 ml 1 mm a

Roztwór C: 2,5 mg cytochromu c rozpuszczone w 10 ml roztworu A E. Roztwór oksydazy ksantynowej. F. Allopurynol (1mg/ml 1 mm a). Roztwór katalazy I. Roztwór dysmutazy ponadtlenkowej (SD) G. Kwas askorbinowy o stężeniu 2 mg/ ml roztworu A. I. Porównanie widm absorpcyjnych utlenionej i zredukowanej formy cytochromu c. 1. W trzech kuwetach spektrofotometrycznych przygotować roztwory zgodnie z tabelą 1: roztwór buforowy (kuweta I), utleniona forma cytochromu c (kuweta II), zredukowana forma cytochromu c (kuweta III). Zawartość kuwet przed pomiarem dobrze wymieszać. Tabela 1. Roztwory badane Roztwór A Roztwór D Roztwór G Kuweta I (próba odniesienia) 1,00 Kuweta II (utleniony cyt. c) 0,15 0,90 Kuweta III (zredukowany cyt. c) 0,10 0,90 0,05 2. Ustalić linię zerową spektrofotometru, w zakresie 500 560 nm, dla próby odniesienia (kuweta I). 3. Wykonać pomiary widm absorpcyjnych, w zakresie 500 560 nm: utlenionej formy cytochromu c (kuweta II), a następnie zredukowanej formy cytochromu c (kuweta III). Uzyskane widma wydrukować. 4. Wykonać pomiar widma różnicowego zredukowanej i utlenionej formy cytochromu c w następujący sposób: a) wstawić do spektrofotometru kuwetę zawierającą utlenioną formę cytochromu c (kuweta II), a następnie przeprowadzić pomiar linii zerowej w zakresie 500 560 nm, b) przeprowadzić pomiar widma absorpcyjnego,w zakresie 500 560 nm, zredukowanej formy cytochromu c (kuweta III). Uzyskany wykres wydrukować. c) określić długość fali dla najwyższej absorbancji w widmie różnicowym. II. Wytwarzanie i usuwanie anionorodnika ponadtlenkowego 1. Ustawić spektrofotometr na pomiar kinetyki reakcji i wybrać nastepujące parametry: temperatura 25 o C, długość fali 550 nm, czas trwania pomiaru 7 min, pomiar co 30 sekund. 2. W czterech kuwetach spektrofotometrycznych przygotować, zgodnie z tabelą 2, roztwory badane.

Tabela 2 Roztwory badane Roztwór D Roztwór A Roztwór F Roztwór I Roztwór Kuweta 1 0,90 0,10 Kuweta 2 0,90 0,05 0,05 Kuweta 3 0,90 0,05 0,05 Kuweta 4 0,90 0,05 0,05 Wstawiać kolejno kuwety 1-4 do komory pomiarowej spektrofotometru i każdorazowo ustalić punkt zerowy pomiaru przy długości fali 550 nm. W każdej kuwecie inicjować reakcję przez dodanie 0,05 ml (50 μl) roztworu oksydazy ksantynowej (E). Dodany enzym szybko zamieszać w kuwecie. Przeprowadzić kolejno pomiary kinetyczne przebiegu reakcji. Uzyskane wykresy wydrukować.

Ćwiczenie VII DATA: REAKTYWE FRMY TLEU I. Porównanie widm absorbcyjnych utlenionej i zredukowanej formy cytochromu c 1. Wyznacz wartości długości fali, dla maksimum absorbancji ( max ) utlenionego i zredukowaneg cytochromu c oraz maksimum widma różnicowego obu form cytochromu c. Wyniki wpisz do Tabeli I. Tabela I. Maksimum absorbancji ( max ) utleniony cytochrom c zredukowany cytochrom c widmo różnicowe II. Powstawanie i eliminacja jonu ponadtlenkowego 1. aszkicuj przebieg krzywych kinetycznych w każdej z mieszanin reakcyjnych. 2. Przedstaw przy pomocy odpowiedniego schematu zachodzące przemiany (odpowiednie równania reakcji) w każdej z analizowanych mieszanin reakcyjnych oraz krótko omów obserwowane zmiany w widmach. I. Tworzenie anionu ponadtlenkowego ( 2 ) w reakcji katalizowanej oksydazą ksantynową: 2 2 + ksantyna + 2 oksydaza ksantynowa (FAD) 2 + 2 2 + moczan II. amowanie oksydazy ksantynowej allopurynolem: oksydaza ksantynowa (FAD) 2 2 + ksantyna + 2 allopurynol III. Dysmutacja nadtlenku wodoru katalizowana przez katalazę: katalaza 2 2 2 2 2 + 2 IV. Redukcja cytochromu c [Fe(III)] przez anion ponadtlenkowy: 2 + 2 2 + moczan 2 + cytochrom c [Fe (III)] cytochrom c [Fe (II)] + 2 WYSKA ABSRBACJA przy 550 nm V. Utlenianie cytochrome c [Fe(II)] przez nadtlenek wodoru : cytochrom c [Fe (II)] + 2 2 + + cytochrom c [Fe (III)] + WYSKA ABSRBACJA przy 550 nm + 2 VI. Dysmutacja anionu ponadtlenkowego przez dysmutazę ponadtlenkową : 2 + 2 + 2 (SD) + 2 2 + 2 dysmutaza ponadtlenkowa

Mieszanina reakcyjna 1: Mieszanina reakcyjna 2: Mieszanina reakcyjna 3: Mieszanina reakcyjna 4: Liczba punktów Test Wykonanie Data Suma pkt. Podpis asystenta: