GENOMIKA FUNKCJONALNA Jak działają geny i genomy? Poziom I: Analizy transkryptomu
Adnotacja (ang. annotation) pierwszy etap po uzyskaniu kompletnej sekwencji nukleotydyowej genomu analiza bioinformatyczna (in silico) identyfikacja genów (ORF), sekwencji regulatorowych i przypisywanie im funkcji (hipotetycznych)
Komputerowa analiza sekwencji nie może być ostatecznym dowodem na istnienie genu Analiza bioinformatyczna musi być potwierdzona eksperymentalnie Jednym ze sposobów stwierdzenia, że dany odcinek DNA jest rzeczywiście genem jest zbadanie transkryptomu komórki, czyli sprawdzenie: czy w komórce znajduje się transkrypt danego (hipotetycznego) genu, a jeśli tak to: ile jest jego kopii? kiedy (tj. w jakich warunkach: czas, miejsce, czynniki zewnętrzne), dany transkrypt się pojawia?
Analiza trankryptomu komórki (globalna czy dotycząca wybranych genów) dostarcza nam wielu cennych informacji dotyczących sposobu działania genomu: 1. pozwala zmapować we fragmencie DNA pozycje transkrybowane czyli mówi nam, że w konkretnym regionie znajduje się gen (a nie np. pseudogen) 2. umożliwia lokalizację granicy intron-ekson w przypadku genów nieciągłych 3. pozwala pokazać różnice w poziomie i czasie ekspresji genów
Test hybrydyzacyjny typu northern najprostsza metoda potwierdzenia, że odcinek DNA, który podejrzewamy, że jest genem rzeczywiście nim jest 1. Ekstrakcja RNA z komórki (Uwaga na RNAzy) Stosunkowo trudna w przypadku bakterii (szybka degradacja transkryptów mrna, krótki okres półtrwania) Łatwa w przypadku eukariontów obecność ogonka Poly(A) 2. Elektroforeza w warunkach denaturujących (żel agarozowy z formaldehydem zapobiega tworzeniu się struktur dsrna)
3. Transfer na membranę zasada analogiczna jak w przypadku hybrydyzacji Southerna różnice dotyczą warunków samego transferu 4. Przygotowanie sondy- najczęściej wyznakowany fragment DNA, który podejrzewamy, że jest genem 5. Hybrydyzacja i detekcja
Alternatywą dla hybrydyzacji typu northern jest RT-PCR
Analiza klonów biblioteki cdna umożliwia zmapowanie w sekwencji genomowej genów, które w danych warunkach uległy ekspresji (jest to przykład na tzw. globalną analizę trnaskryptomu, ponieważ analizujemy zbiór klonów cdna) Etapy analizy biblioteki cdna: 1. Konstrukcja biblioteki cdna 2. Sekwencjonowanie biblioteki cdna 3. Porównanie uzyskanych sekwencji cdna z sekwencją genomową
Real-Time PCR (qpcr) Reakcja PCR z wykrywaniem produktów w czasie rzeczywistym Polimeraza (z aktywnością egzonukleazy 5-3 ) dntp bufor, MgCl 2 Matryca - DNA Denaturacja nici, przyłączanie Starterów Wydłużanie nici
Real-Time PCR (qpcr) Dzięki użyciu np. sond fluorescencyjnych reakcja ma 1. Bardzo dużą czułość 2. Daje możliwość oznaczenia ilości powielanego odcinka DNA
W metodzie qpcr wydajność amplifkacji obserwujemy poprzez pomiar fluorescencji Intensywność świecenia jest skorelowana z ilością odłączanego znacznika (sondy) a zatem ilością powstającego produktu to z kolei zależy od wyjściowej ilości kopii cząsteczek matrycy np. ilości kopii mrna danego genu qrt-pcr (ang. quantitative reverse transcriptase real-time PCR), pierwszym etapem jest przepisanie RNA na cdna przy pomocy odwrotnej transkryptazy W reakcji można wykorzystywać kilka sond wyznakowanych różnymi fluorochromami, co umożliwia obserwację amplifikacji różnych fragmentów cdna (dla różnych genów)
Reakcja qrt-pcr umożliwia zbadanie różnic w ilości mrna Różnych genów w tej samej tkance, komórce Tego samego genu w różnych warunkach (np. tkankach zdrowych i zmienionych chorobowo) u różnych pacjentów z tą samą chorobą i wiele innych..
Badanie promotorów i innych sekwencji regulatorowych, które regulują poziom transkrypcji genów z użyciem tzw. genów reporterowych Geny reporterowe możemy zastosować aby określić gdzie (np. w jakiej tkance), kiedy (w jakich warunkach, w jakim okresie życia) na jakim poziomie interesujący nas gen ulega ekspresji Gen reporterowy to taki, którego ekspresję można łatwo zaobserwować i zmierzyć ilościowo
Zasada działania i konstrukcji tzw. fuzji transkrypcyjnych Aby gen reporterowy mógł wiarygodnie wskazywać gdzie i kiedy badany gen ulega ekspresji, trzeba zastąpić promotor genu reporterowego, promotorem genu badanego tworząc tzw. fuzję tranksrypcyjną W takim układzie gen reporterowy będzie miał taki wzór ekspresji jak gen badany, a aktywność reportera można łatwo wykryć i zmierzyć ilościowo
Przykłady genów reporterowych XhoI BglII EcoRI KpnI XbaI PstI lacz -galaktozydaza: umożliwia badania promotorów (głównie bakteryjnych) detekcja: test histochemiczny uida glukuronidaza (GUS) oznaczenia enzymatyczne szczególnie w komórkach i ekstraktach roślinnych (brak naturalnego tła GUS w roślinach), detekcja: test histochemiczny oriv orit trfa MCS lacz pmp220 (104000 pz) Tet
Lux lucyferaza, która katalizuje utlenianie lucyferyny, lux badanie aktywności promotorów zarówno bakteryjnych jak i eukariotycznych, detekcja: chemiluminescencja świetliki Phausis splendidula Photobacterium phosphoreum
GFP białko zielonej fluoresencencji (green fluorescent protein), detekcja fluorescencja GFP wyizolowane z genomu meduza Aequoria victoria (obecnie dostępne w różnych odmianach, różniących się kolorem świecenia: EGFP (ang. enhanced green fluorescent protein białko wzmocnionej zielonej fluorescencji), (blue, BFP), (cyan, CFP), (yellow, YFP). )
Globalne (czyli dotyczące dużej liczby genów) analizy transkryptomu macierze DNA Macierz DNA - gęsto ułożone cząsteczki DNA, umieszczone na stałym podłożu (nośniku: np. szkle, plastiku, membranie nylonowej) reprezentujące a) cały genomu b) kodujące odcinki genomu, czyli geny (najczęściej wszystkie, albo dużą ich część) badanego organizmu Tego typu układy przeznaczone są do równoległych analiz hybrydyzacyjnych, za pomocą których możemy pokazać np.: wyrażanie się genów w komórce oraz różnice w poziomie ich ekspresji (transkrypcji)
Nazewnictwo inne niż w tradycyjnych technikach hybrydyzacyjnych: probe - sonda - kwas nukleinowy o znanej sekwencji, unieruchomiony na nośniku target - wolny kwas nukleinowy, zwykle wyznakowany, który poddajemy badaniu, jest to cała populacja cząsteczek np. całkowite mrna komórkowe czyli transkrypty wszystkich genów
Macierze są opisywane w wersji makro i mikro. Różnica dotyczy pojemności macierzy tj. liczby unieruchomionych na stałej powierzchni odcinków DNA Makromacierze mała gęstość sond na dużej powierzchni, mała pojemność jeśli chodzi o reprezentację genów z danego genomu Mikromacierze duża gęstość sond, łatwo zmieścić wszystkie geny genomu
Istnieją dwa podstawowe warianty mikromacierzy DNA które różnią się: rodzajem sondy - rodzajem kwasu nukleinowego umieszczonego na stałej powierzchni przeznaczeniem (zastosowaniem) Format I: mikromacierz oligonukleotydowa chip genowy, chip DNA sondy reprezentujące geny z genomu umieszczone są na stałej powierzchni w postaci bardzo krótkich odcinków DNA długości 20~80 nt (oligonukleotydów) Ten typ mikromacirzy z syntezą in situ został opracowany przez firmę Affymetrix, Inc. Format II: mikromacierz cdna sondy reprezentujące geny z genomu umieszczone są na stałej powierzchni w postaci odcinków cdna długości 500~5,000 pz
Zasadnicze zastosowanie macierzy oligonukleotydowych (Format I) : (1) Oznaczenie ilości mrna genów w pojedynczej (tej samej) próbce Macierz oligonukleotydowa ma ogromną specyficzność wiązania i wykrywania targetu (na chipie jest kilkanaście kopii sond danego genu) co czyni ją bardziej użyteczną przy monitorowaniu ekspresji genów w genomach, w których mrna ulega dojrzewaniu
W eksperymentach z chipami oligonukloetydowymi do jednego chipa hybrydyzowana jest tylko jedna próbka typu target. Etapy przygotowania targetu 1. Ekstrakcja mrna 2. Odwrotna transkrypcja do cdna 3. Znakowanie (np. biotyną) z transkrypcją cdna do crna Po wyznakowaniu crnas hybrydyzuje się z chipem, a następnie wybarwia w celu uwidocznienia hybrydyzacji i określenia intensywności wiązania do sondy
Mikromacierze cdna (Format II) Podstawowe zastosowanie macierzy cdna to porównywanie poziomu ekspresji genów pomiędzy różnymi próbkami Eksperyment z macierzą cdna obejmuje najczęściej przygotowanie dwóch próbek targetów : kontrolnej i badanej (np. tkanki zdrowej i zmienionej nowotworowo). Przygotowanie dwóch targetów Z dwóch różnych próbek izoluje się mrna poddaje się je odwrotnej transkrypcji do cdna w czasie której próbki znakuje się fluorescencyjnym barwnikiem np. próbkę kontrolną barwnikiem zielonym (Cy3), a badaną czerwonym (Cy5). Dzięki temu można je użyć równocześnie do hybrydyzacji do tej samej macierzy.
Macierz cdna jest bardzo przydatna przy globalnych analizach ekspresji całego genomu polegających na równoczesnym porównywaniu ekspresji genów komórek rosnących w dwu różnych warunkach (stanach fizjologicznych) Co się wtedy stanie? Dwie próbki kompetycyjnie wiążą się do macierzy a próbka, która zawiera więcej specyficznego cdna (tzn. wyjściowo zawierała więcej mrna czyli poziom ekspresji określonych genów był wyższy) wygra to współzawodnictwo. Jeśli np. w tzw. próbce kontrolnej jest więcej mrna dla danego genu w porównaniu z tzw. próbką badaną (czyli ekspresja danego genu w próbce badanej jest zmniejszona) więcej DNA wyznakowanego Cy3 (zielony barwnik) zwiąże się z sondą i plamka będzie świecić na zielono. Jeśli będzie odwrotnie plamka będzie świecić na czerwono.
Globalna analiza transkryptomu typu RNA-seq z wykorzystaniem techniki NGS Systemy NGS są w stanie: 1. Wydajnie sekwencjonować cząsteczki DNA 2. Policzyć cząsteczki kwasów nukleinowych