Techniki w badaniu hematologicznym

Techniki w badaniu hematologicznym UKŁAD CZERWONOKRWINKOWY ŚREDNIA OBJĘTOŚĆ KRWI CZŁOWIEK - 5-5,5 l =7%= ok. 70 ml/kg m.c. PIES - ok. 90 ml/kg m.c. KOT - ok. 60 ml/kg m.c.! Prawidłowy skład krwi pies / kot osocze: 55 / 63 % objętości - ponad 90 % woda - niecałe 10 % białka komórki: 45 / 37 % objętości - 99 % erytrocyty - 1 % leukocyty i płytki

ROZMIESZCZENIE SZPIKU CZERWONEGO ERYTROCYTY Długośćżycia: pies 110 dni, kot 70 dni Średnica: pies 7 µm, kot 5,8 µm Dwuwklęsły dysk - b. duża powierzchnia w stosunku do objętości komórki Błona komórkowa utrzymując kształt umożliwia znaczne odkształcanie się komórki Bez jądra; bez organelli; hemoglobina > 95% s.m. Najważniejszy sygnał regulujący produkcję - stężenie tlenu we krwi po 2 WE KRWI p0 2 WE KWI NERKA blablab PRODUKCJI bbbbbb b ERYTROCYTÓW (po 3 4 dniach) STĘŻENIA ERYTROPOETYNY SZPIK CZERWONY

Dojrzewanie erytrocytów W trakcie erytropoezy komórki utkania czerwonokrwinkowego w szpiku dzielą się 3 4-krotnie z 1 komórki 16 32 erytrocyty komórki gromadzą hemoglobinę stopniowo tracą rybosomy (RNA) produkujące białka zagęszcza się chromatyna jądrowa komórki zmniejszają się, zmniejsza się też wielkość jądra w stosunku do objętości cytoplazmy jądro jest usuwane RETIKULOCYT ERYTROCYT KOMÓRKA MACIERZYSTA PROERYTROBLAST ERYTROBLAST ZASADOCHŁONNY ERYTROPOETYNA ERYTROCYT RETIKULOCYT ERYTROBLAST KWASOCHŁONNY ERYTROBLAST WIELOBARWLIWY ERYTROPOETYNA działanie hamowane w: zapaleniach (IL-1, TNF) niedoczynności kory nadnerczy niedoczynności tarczycy u psów

Usuwanie erytrocytów W miarę starzenia się dochodzi do aktywności enzymów glikolitycznych mniej energii zaburzone odkształcanie się komórek Usuwają - makrofagi śledziony (głównie) - wątroby niewiele - szpiku Każdego dnia wymianie na nowe ulega 1% erytrocytów Usuwanie erytrocytów - terminy Hemoliza zewnątrznaczyniowa makrofagi gł. w śledzionie, też w wątrobie i w szpiku niszczenie 90% erytrocytów: Fe do szpiku, globina i aminokwasy do wątrobowej puli aminokwasów, hemowy pierścień porfirynowy bilirubina usuwana Hemoliza wewnątrznaczyniowa - niszczone 5-10% erytrocytów Błędy przy liczeniu erytrocytów Wynik fałszywie zaniżony przy: - aglutynacji erytrocytów - obecności skrzepów krwi (zlepione krwinki liczone jako pojedyncze lub nie liczone wcale) Wynik fałszywie zawyżony przy: - krańcowej leukocytozie (powyżej 100 tys./µl - rzadko)

Stężenie hemoglobiny [g/dl, g/l, mmol/l] [g/dl = 1,611 x mmol/l] Oznaczane kolorymetrycznie po lizie erytrocytów - metoda cyjanmethemoglobinowa (tradycyjna) Stężenie w krwinkach fałszywie zawyżone przy: - lipemii - hemolizie wewnątrznaczyniowej - nasilonej żółtaczce (hiperbilirubinemii) - obecności licznych ciałek Heinza - leukocytozie (powyżej 50 tys./µl) HEMATOKRYT Oznaczany tradycyjnie (kapilara, wirówka) DODATKOWE ZALETY: - umożliwia ocenę zmian w wyglądzie osocza - pozwala na oszacowanie liczby leukocytów krwi - można oznaczyć przy pacjencie! WADY praktycznie mało nieistotne - nieco zawyżony przez uwięzione osocze (do 1%) - zaniżony przy nadmiarze EDTA w próbce (2-4%) HEMATOKRYT Z ANALIZATORA Wyliczany na podstawie liczby erytrocytów oraz średniej objętości krwinki czerwonej (MCV) Dokładny wynik, gdy analizator dostosowywany do wielkości krwinek zwłaszcza kotów; jeżeli nie fałszywe wyniki!! Problem z dokładnością przy fałszywie zaniżonej liczbie erytrocytów, przy znacznym odwodnieniu lub przewodnieniu, zwłaszcza u kotów (dodatkowym problemem - fizjologiczna anizocytoza)

HEMATOKRYT Wartości referencyjne: [ % l/l ] PSY: 0,37 0,55 (0,45) l/l, ale! - charty angielskie (greyhound): 0,55 0,65 (0,60) l/l, a - włoskie, afgańskie, perskie (saluki), rosyjskie (borzoj) i whippety: 0,48 0,58 (0,54) l/l KOTY: 0,26 0,47 (0,37) l/l NASILENIE NIEDOKRWISTOŚCI NASILENIE NIEDOKRWISTOŚCI HEMATOKRYT (l/l) PSY KOTY PRAWIDŁOWO 0,37 0,55* 0,26 0,47 ŁAGODNE 0,30 0,36 0,20 0,25 ŚREDNIE 0,20 0,29 0,15 0,19 CIĘŻKIE 0,13 0,19 0,10 0,14 BARDZO CIĘŻKIE poniżej 0,13 poniżej 0,10 ZAWSZE RETIKULOCYTY! Poniżej 0,30 - psy Poniżej 0,20 - koty ZAWSZE W KIERUNKU PASOŻYTÓW KRWI Dlaczego BIAŁKO CAŁKOWITE? Wielkość podstawowych parametrów opisujących stan układu czerwonokrwinkowego: - liczba erytrocytów - stężenie hemoglobiny - hematokryt zależy od stanu gospodarki wodnej pacjenta Stężenie białka całkowitego jest najprostszym laboratoryjnym wykładnikiem stanu nawodnienia

ODWODNIENIE ZAGĘSZCZENIE KRWI (haemoconcentratio) ZAGĘSZCZENIE ERYTROCYTÓW ZAGĘSZCZENIE OSOCZA Ht RBC Hb stężenia białka całkowitego PRZEWODNIENIE (gł. u kotów) ROZCIENCZENIE KRWI ROZCIEŃCZENIE ERYTROCYTÓW ROZCIEŃCZENIE OSOCZA Ht RBC Hb stężenia białka całkowitego HEMATOKRYT PODWYŻSZONY NORMA OBNIŻONY BIAŁKO CAŁKOWITE PODWYŻSZONE NORMA OBNIŻONE PODWYŻSZONE NORMA OBNIŻONE PODWYŻSZONE NORMA OBNIŻONE INTERPRETACJA Odwodnienie Skurcz śledziony (zespół białego fartucha) Nadkrwistość pierwotna lub wtórna Odwodnienie maskowane hipoproteinemią Skurcz śledziony + hipoproteinemia Niedokrwistość maskowana odwodnieniem Wzrost stężenia globulin (zapalenie przewlekłe) NORMA Znaczna utrata białek (nerki, przew. pokarmowy) Obniżona produkcja białek (choroby wątroby) Znaczna niedokrwistość + odwodnienie Szczenięta, kocięta fizjologicznie; ciąża (rzadko) Zwiększony rozpad krwinek Zmniejszona produkcja krwinek Przewlekła utrata krwi ( niedobór Fe) Przewodnienie Krwotoki zewnętrzne ostre i przewlekłe

Średnia objętość krwinki czerwonej MCV (mean corpuscular volume) Średnia (!) wielkość erytrocytów MCV = Ht [%] 10 RBC [mln/µl] [µm 3 = fl] przez analizatory oznaczana bezpośrednio Średnia objętość krwinki czerwonej (MCV) Wartości referencyjne: PSY: 60 77 fl KOTY: 39 55 fl Wzrost wartości MCV MAKROCYTOZA Spadek wartości MCV MIKROCYTOZA Podwyższona wartość MCV (makrocytoza) Retikulocytoza pojawia się 4-5 dnia, ale MCV wzrasta dopiero na jej szczycie (7-14 dzień) Zakażenie FeLV (koty) najczęściej Zbyt długo przechowywana krew (obrzęk komórek) Autoaglutynacja erytrocytów (autoimmunologiczna niedokrwistość hemolityczna) Dziedziczna stomatocytoza (malamuty alaskańskie i sznaucery miniaturowe) Dziedziczna makrocytoza (pudle miniaturowe i toy)

Obniżona wartość MCV (mikrocytoza) Akita, shar-pei, chow-chow - cecha rasowa Niedobór/utrata żelaza Przewlekłe choroby wątroby (zwykle z zespoleniem obocznym wrotno-głównym) Krańcowa sferocytoza przy autoimmunologicznej niedokrwistości hemolitycznej (b. rzadko) Nadmiar EDTA w próbce krwi ( obkurczenie krwinek) Wskaźnik anizocytozy RDW (red cell distribution width) Współczynnik zmienności (%) opisujący rozrzut objętości erytrocytów wokół średniej (MCV), czyli nasilenie anizocytozy Wartości referencyjne (producent!): PSY: 14 19 % KOTY: 14 31 % Zwiększenie wartości RDW wskazuje na istotną: makrocytozę lub mikrocytozę konieczność jakościowej oceny erytrocytów w rozmazie! Średnie stężenie Hb w krwince MCHC (mean corpuscular Hb concentration) Najdokładniejszy wskaźnik czerwonokrwinkowy! MCHC = Hb [g/l] x 10 Ht [%] Wartości referencyjne: PSY: 32-36 g/dl [g/dl] KOTY: 30-36 g/dl Wzrost MCHC = fizjologicznie niemożliwy! Spadek MCHC = niedobarwliwość (hipochromazja)

Średnie stężenie Hb w krwince (MCHC) Zwiększenie wartości MCHC: - hemoliza wewnątrznaczyniowa (lub in vitro!) - lipemia - nasilona żółtaczka (hiperbilirubinemia) - obecność licznych ciałek Heinza (gł.koty) - leukocytoza (powyżej 50 tys./µl), Zmniejszenie wartości MCHC: - znaczna retikulocytoza (niedokończona synteza Hb) - niedobór/utrata żelaza MCV i MCHC - ograniczenia Są to wartości średnie dopiero znaczna makrocytoza, mikrocytoza lub niedobarwliwość krwinek przesuwa te wskaźniki poza zakres wartości referencyjnych Posługiwanie się jedynie tymi wskaźnikami do klasyfikacji rodzaju niedokrwistości uniemożliwia wykrycie wczesnych lub łagodnych zmian w krwinkach czerwonych Konieczna weryfikacja na podstawie rozmazu! WIDOCZNA HEMOLIZA Wolna Hb we krwi b. groźna dla nerek!! Fe ++ Haptoglobina α-globulina osocza wytwarzana w wątrobie wiąże wolną Hb w naczyniach w duży kompleks niepokonujący progu nerkowego Kompleks Hb-haptoglobina w wątrobie bilirubina przedostaje się swobodnie do moczu, ale niegroźna dla nerek nie zawiera Fe

WIDOCZNA HEMOLIZA umiarkowana hemoliza OSOCZE czerwone MOCZ jasno-żółty Haptoglobina związała wolną Hb, a powstały kompleks nie przechodzi do moczu po stwierdzeniu hemolizy zawsze wykonywać WIDOCZNA KONTROLNE BADANIE HEMOLIZA MOCZU! nasilona hemoliza OSOCZE czerwone MOCZ ciemno-czerwony do brązowego Haptoglobina całkowicie związana przez Hb, nadmiar wolnej Hb przechodzi do moczu Niedokrwistości hemolityczne - psy Retikulocytoza najczęściej powyżej 10 % Hemoliza krew pobrana w czasie hemolizy!! Żółtaczka (bilirubinemia) gdy krew pobrana już po masywnej hemolizie wewnątrznaczyniowej (b. rzadko po zewnątrznaczyniowej) Powiększenie śledziony - po wewnątrznaczyniowej Sferocytoza po hemolizie zewnątrznaczyniowej

WIDOCZNA LIPEMIA Znacznie obniża oporność osmotyczną erytrocytów jeżeli nie wykonano badania natychmiast możliwa hemoliza in vitro = zaniżenie Ht i liczby erytrocytów Fałszywie zawyża stężenie Hb oraz (b. znacznie) MCHC Fałszywie zawyża wyniki oznaczeń biochemicznych (białko całkowite, albuminy, bilirubina i inne)* Hemolityczna niedokrwistość tła immunologicznego Pierwotna (idiopatyczna) lub wtórna (po podaniu leków, odpowiedź zapalna, pasożyty krwi, nowotwory, zakażenia wirusowe, po użądleniu przez pszczoły, poszczepienna?) Immunoglobuliny (IgG, IgM) i/lub dopełniacz przyłączają się do błony erytrocytów bezpośrednio lub pośrednio: - bezpośrednio - przez antygeny będące częścią błony erytrocytów - pośrednio - via antygeny absorbowane na błonie erytrocytów (leki, pasożyty) Hemolityczna niedokrwistość tła immunologicznego 1. Po połączeniu się z erytrocytami makrofagi śledziony mogą: fagocytować całą krwinkę brak charakterystycznych objawów przy nasilonej fagocytozie fagocytować duży fragment błony komórkowej we krwi cienie krwinek

Hemolityczna niedokrwistość tła immunologicznego (c.d.) usuwać niewielki fragment błony komórkowej sferocyty (dopiero później wychwytywane przez śledzionę i w niej fagocytowane) 2. Gdy do opłaszczonych erytrocytów dołączy się dopełniacz hemoliza wewnątrznaczyniowa Hemolityczna niedokrwistość tła immunologicznego Hemoliza odbywa się najczęściej poza naczyniami hemoliza zewnątrznaczyniowa hemoliza wewnątrz naczyń = zawsze gorsze rokowanie! obie formy hemolizy mogą wystąpić jednocześnie (np. przy babeszjozie psów, przy zatruciu czosnkiem lub cebulą) Autoaglutynacja Antyerytrocytarne IgM Bardzo wysokie stężenie antyerytrocytarnego IgG We krwi zlepy erytrocytów o wyglądzie winogron

USZKODZENIA TLENOWE Substancje silnie utleniające mogą uszkadzać błony erytrocytów. Uszkodzenia te są nieodwracalne! Najbardziej wrażliwe koty. Uszkodzenie błony komórkowej ekscentrocyty Uszkodzenie globiny ciałka Heinza Utlenienie hemu (Fe 2+ Fe 3+ ) methemoglobina - > 10% czekoladowo-brązowa barwa krwi - > 40% + bardzo silne objawy hipoksji - > 60% śmierć łącznie lub nie Zagrożenie niedokrwistość hemolityczna Przyczyny uszkodzeń tlenowych KOTY paracetamol (+ hemoliza zewnątrz- i wewnątrznaczyniowa, methb-emia + ciałka Heinza + późniejsza martwica wątroby) błękit metylenowy i DL-metionina (w urologii) benzokaina tylko methb-emia! witamina K 3 ponad 1 mg/kg m.c./dzień (wit. K 1 nie!) czosnek, cebula (zwłaszcza suszone od 0,3 % s.m.!) glikol propylenowy dodatek do odżywek dla dzieci Przyczyny uszkodzeń tlenowych PSY czosnek, cebula (zwłaszcza suszona) paracetamol (w dawkach większych niż u kotów) benzokaina (methb-emia + ciałka Heinza) miedź (spichrzanie miedzi u bedlington terierów) cynk (połykanie monet przez szczenięta) Naftalina (szczenięta)

ODCZYN BIERNACKIEGO (OB) Szybkość opadania (sedymentacji) erytrocytów, opad OPAD PRAWIDŁOWY OPAD PRZYŚPIESZONY - kwas sialowy (ładunek ujemny) + fibrynogen (białko ostrej fazy) Te same komórki, dwie nazwy Polichromatofile: względnie zasadochłonnie barwiące się erytrocyty w rutynowo barwionych rozmazach MGG polichromatofile Retikulocyty: pozostałości RNA (polirybosomy) wybarwione w erytrocytach przez tzw. barwniki przyżyciowe* * - błękit brylantowo-krezylowy lub nowy błękit metylenowy Erytrocyty jądrzaste we krwi POLICHROMATOFIL Obecność jądrzastych erytrocytów we krwi nie jest równoznaczne z rozpoznaniem niedokrwistości regeneratywnej! Zawsze musi towarzyszyć im retikulocytoza!

Erytrocyty jądrzaste we krwi Erytroblast... zasadochłonny wielobarwliwy kwasochłonny Erytrocyty jądrzaste we krwi ZE zwiększoną liczbą retikulocytów - zwiększone uwalnianie ze szpiku przy niedokrwistości regeneratywnej - erytropoeza pozaszpikowa (śledziona) BEZ wzrostu liczby retikulocytów - uszkodzenie bariery szpik:krew (ołowica!) - początkowa, ostra odpowiedź na erytropoetynę (do 4. dnia) - po złamaniach kości - splenektomia, zaburzona czynność śledziony - białaczka Odczyn Coombsa Można wykonywać u psów w celu potwierdzenia rozpoznania niedokrwistości hemolitycznej tła immunologicznego tylko wtedy, gdy nie stwierdzi się sferocytozy i/lub aglutynacji erytrocytów (objawy potwierdzające rozpoznanie!) Erytrocyty psa opłaszczone własnymi przeciwciałami + Królicze przeciwciała przeciwko przeciwciałom psa opłaszczającym erytrocyty AGLUTYNACJA

Odczyn Coombsa Próba niezbyt swoista dodatni wynik tylko w 60 70% przypadków niedokrwistości tła immunologicznego ujemne wyniki testu nie wykluczają choroby! Fałszywie dodatnie wyniki testu Coombsa mogą pojawić się u zwierząt bez klinicznych objawów choroby na skutek zakażeń wirusowych, po niektórych lekach, etc. (np.: zakażenie FeLV u kotów) Dodatni wynik testu potwierdza immunologiczne tło niedokrwistości hemolitycznej tylko przy obecności objawów klinicznych! Odczyn Coombsa dużo wyników fałszywie ujemnych, gdy przed wykonaniem próby krwinki były płukane rozcieńczenie autoprzeciwciał wynik ujemny przy niskim poziomie przeciwciał w osoczu wyniki fałszywie ujemne, gdy przed badaniem u pacjenta stosowano kortykosteroidy! wyniki fałszywie ujemne przy zbyt małym rozcieńczeniu króliczych przeciwciał używanych w teście