Imię i nazwisko Uzyskane punkty Nr albumu data /3 podpis asystenta ĆWICZENIE 4 ANALIZA JAKOŚCIOWA AMINOKWASÓW Wstęp merytoryczny Aminokwasy (kwasy aminowe) to grupa organicznych związków zawierających dwie charakterystyczne grupy funkcyjne: grupę aminową NH 2 i grupę karboksylową COOH. Grupa aminowa w aminokwasach spotykanych w świecie Ŝywym znajduje się zwykle w pozycji α w stosunku do grupy karboksylowej. Z wyjątkiem glicyny wszystkie aminokwasy są optycznie czynne (atom węgla α jest asymetryczny). Występujące w białkach aminokwasy naleŝą do szeregu L. W roztworach wodnych grupy funkcyjne aminokwasów są zjonizowane. W zaleŝności od ph roztworu aminokwasy występują jako kationy (środowisko kwaśne), aniony (środowisko zasadowe) lub jako jony dwui wielobiegunowe. Wartość ph, przy którym aminokwas występuje w postaci jonu obojnaczego, zwana jest punktem izoelektrycznym tego aminokwasu (pi). Jony obojnacze aminokwasów są rodzajem soli wewnętrznych (amfolitami), dlatego mają wiele właściwości typowych dla soli: są substancjami krystalicznymi o wysokich temperaturach topnienia, wykazują duŝe momenty dipolowe, są rozpuszczalne w wodzie, ale nierozpuszczalne w węglowodorach. Obie grupy funkcyjne aminokwasów wykazują charakterystyczną dla siebie reaktywność. Grupa karboksylowa ( COOH) moŝe tworzyć pochodne estrowe (z grupą OH alkoholi) i amidowe (z grupą aminową). W reakcji z zasadami tworzy ona sole, moŝe być takŝe dodatkowo aktywowana przez przeprowadzenie w chlorki i bezwodniki kwasowe. W wyniku reakcji grupy karboksylowej z grupą aminową kolejnego aminokwasu tworzy się wiązanie peptydowe. Grupa aminowa ( NH 2 ), reagując z kwasami nieorganicznymi tworzy sole, zaś z kwasami karboksylowymi i sulfonowymi - amidy. Grupa aminowa aminokwasu moŝe reagować z ninhydryną tworząc zasadę Schiffa, która ulega następczej dekarboksylacji. Ze szkieletu węglowego aminokwasu powstaje aldehyd o mniejszej o 1 liczbie atomów węgla w stosunku do wyjściowego aminokwasu oraz wydziela się amoniak. Druga cząsteczka aminokwasu reaguje z kolejną cząsteczką ninhydryny dając niebieski barwnik. Reakcja z ninhydryną jest reakcją barwną słuŝącą do wykrywania aminokwasów w roztworach oraz na fazie stacjonarnej po rozdziale chromatograficznym (wywoływanie chromatogramu). Stosowana moŝe być równieŝ do ilościowego oznaczania aminokwasów metodą kolorymetryczną (intensywność barwy) oraz gazometryczną na podstawie ilości wydzielonego CO 2, a takŝe do degradacji α-aminokwasów w celu wydzielenia węgla grupy karboksylowej. Grupa α-aminowa w obecności kwasu azotowego(iii) przekształcana jest do pochodnej hydroksylowej z wydzieleniem cząsteczki N 2. Ilość wydzielonego azotu moŝna oznaczyć metodą van Slyke a, przy czym azot pochodzi w połowie od kwasu azotowego(iii) i w połowie z wolnych grup α-aminowych aminokwasów, peptydów i białek. Grupa aminowa wolnego aminokwasu (lub aminokwasu N-końcowego w łańcuchu polipeptydowym) reaguje ilościowo z 1-fluoro-2,4-dinitrobenzenem (odczynnik Sangera) dając Ŝółto zabarwione pochodne 2,4-dinitrofenyloaminokwasy, które oznacza się spektrofotometrycznie. N-końcowa grupa aminowa moŝe być sprzęgnięta z fenyloizotiocyjanianem w procesie degradacji Edmana. Powstałą pochodną oznacza się następnie metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej - HPLC. Metoda ta pozwala ustalać sekwencję aminokwasową w polipeptydzie począwszy od N-końca. Występujące w cząsteczkach aminokwasów grupy: fenylowe, indolowe, imidazolowe, -OH i -SH, determinują swoiste właściwości posiadających je aminokwasów, pozwalając na wykorzystanie specyficznych reakcji barwnych w celu ich identyfikacji i ilościowego oznaczenia. W celu oznaczenia ilościowego białka w roztworze moŝna stosować metody turbidymetryczne, kolorymetryczne (biuretowa, Folina-Ciocalteu), spektrofotometryczne, wykorzystujące zdolność absorpcji światła o długości fali λ = 280 nm przez aminokwasy aromatyczne oraz metody gazometryczne. Rozdział aminokwasów otrzymanych w wyniku np. hydrolizy białek moŝna przeprowadzić metodami chromatograficznymi (bibułowa, cienkowarstwowa, jonowymienna) czy elektroforetycznymi. Celem ćwiczenia jest poznanie właściwości chemicznych aminokwasów oraz wykorzystanie wybranych reakcji charakterystycznych do identyfikacji nieznanego aminokwasu. Aminokwasy, które moŝna zidentyfikować str. 1
w oparciu o wybrane reakcje charakterystyczne to: glicyna, prolina, tyrozyna, tryptofan, histydyna, arginina, cysteina, metionina. Ćwiczenie wykonywane jest w parach, ale kaŝdy student dokonuje identyfikacji swojego aminokwasu. Cel: Wykrywanie wybranych aminokwasów 1.1. Reakcja ninhydrynowa CZĘŚĆ I WYKRYWANIE AMINOKWASÓW Doświadczenie 1 Wolne grupy aminowe α-aminokwasów tworzą z ninhydryną o charakterystycznym niebieskofioletowym zabarwieniu. ninhydryna zredukowana ninhydryna ninhydryna zredukowana ninhydryna barwny (purpura Ruhemanna) Uwolniony amoniak wchodzi w reakcję z ninhydryną oraz powstałą w wyniku ogrzewania zredukowaną pochodną ninhydryny tworząc barwny produkt - purpurę Ruhemanna. Dodatni odczyn reakcji dają takŝe inne związki: białka, peptydy, amoniak oraz aminy i aminocukry. Intensywność zabarwienia jest zaleŝna od stęŝenia aminokwasu w analizowanym roztworze co wykorzystuje się do oznaczania ilościowego aminokwasów metodą kolorymetryczną. Prolina tworzy z ninhydryną o innej budowie, o zabarwieniu Ŝółtopomarańczowym. Z kolei hydroksyprolina tworzy kompleks o barwie róŝowej. Do 0,5 cm 3 roztworów wzorcowych aminokwasów (glicyna, prolina), analizowanego aminokwasu, białka oraz wody (w sumie 5 probówek) dodać 3-4 krople 1% roztworu alkoholowego ninhydryny, delikatnie zamieszać i ogrzewać we wrzącej łaźni przez 1 minutę. Obserwować zmianę barwy roztworu. 0,1% roztwory: glicyny, proliny, białka, nieznanego aminokwasu 1% roztwór ninhydryny w etanolu Próbę wykonaj takŝe dla ch roztworów nieznanych aminokwasów! str. 2
1.2. Reakcja z kwasem azotowym (III) van Slyke a Wolne aminokwasy reagują z kwasem azotowym (III) z wydzieleniem stechiometrycznych ilości azotu w wyniku deaminacji. Reakcja ta jest podstawą oznaczania ilościowego azotu aminokwasowego metodą van Slyke a. Nietrwały kwas azotowy (III) wytwarza się in situ w wyniku reakcji azotanu (III) sodu oraz kwasu octowego. Do 4 probówek dodać po 1 cm 3 10% NaNO 2 oraz 1 cm 3 2M CH 3 COOH, zamieszać i poczekać, aŝ przestaną wydzielać się pęcherzyki gazu. Do probówek dodać następnie odpowiednio po 1 cm 3 roztworu glicyny, białka, analizowanego aminokwasu oraz wody. Obserwować zachodzące zmiany. 0,1% roztwory: glicyny, białka, nieznanego aminokwasu 10% roztwór NaNO 2 2M roztwór CH 3 COOH Próbę wykonaj takŝe dla ch roztworów nieznanych aminokwasów! Cel: Wykrywanie aminokwasów aromatycznych 2.1. Reakcja ksantoproteinowa Doświadczenie 2 Aminokwasy zawierające w cząsteczce pierścień aromatyczny ulegają reakcji nitrowania stęŝonym kwasem azotowym tworząc Ŝółte pochodne nitrowe. Dodatek NaOH pogłębia barwę do pomarańczowej (tworzenie soli).tyrozyna i tryptofan łatwo ulegają reakcji ksantoproteinowej. Trudny do zaobserwowania jest efekt dodatni tej reakcji dla fenyloalaniny. str. 3
Do 0,5 cm 3 roztworów wzorcowych aminokwasów (glicyna, tyrozyna, tryptofan), analizowanego aminokwasu, roztworu białka oraz wody (w sumie 6 probówek) dodać po 0,5 cm 3 stęŝonego HNO 3, zamieszać i ogrzewać przez ok. 10 minut we wrzącej łaźni wodnej. Po oziębieniu do prób dodać ostroŝnie po 1 cm 3 20% NaOH. Obserwować zmiany barwy. 0,1% roztwory: tyrozyny, tryptofanu, glicyny, białka, nieznanego aminokwasu stęŝony kwas azotowy (pod wyciągiem) 20% roztwór NaOH Próbę wykonaj takŝe dla ch roztworów nieznanych aminokwasów! 2.2. Wykrywanie tryptofanu metodą Voiseneta W środowisku kwaśnym związki zawierające pierścień indolowy (m.in. tryptofan) reagują z aldehydami, dając fioletowe produkty kondensacji. Jako aldehydu najczęściej uŝywa się glioksalu lub aldehydu mrówkowego. Do 0.5 cm 3 roztworów wzorcowych aminokwasów (tryptofan, glicyna), roztworu białka, analizowanego aminokwasu oraz wody (w sumie 5 probówek) dodać 1 kroplę roztworu aldehydu mrówkowego oraz 1 cm 3 stęŝonego HCl, zamieszać i pozostawić na 5 min. Po tym czasie dodawać powoli kroplami roztwór azotanu (III) sodu i obserwować zmianę barwy. 0.1% roztwory: tryptofanu, glicyny, białka, nieznanego aminokwasu 2.5% roztwór aldehydu mrówkowego (pod wyciągiem) 0.05% roztwór NaNO 2 Próbę wykonaj takŝe dla ch roztworów nieznanych aminokwasów! str. 4
2.2. Wykrywanie tyrozyny metodą Millona Wykrywanie tyrozyny przy uŝyciu odczynnika Millona (mieszanina jonów rtęci (I) i (II) oraz jonów azotanowych (III) i (V)), polega na powstaniu w środowisku stęŝonego kwasu azotowego (V) w temperaturze 100 C nitropochodnej tyrozyny, która z jonami rtęci (II) i rtęci (I) tworzy czerwony produkt. Reakcji ulegają równieŝ inne związki zawierające pierścień fenolowy. Reakcja Millona jest podstawą ilościowego oznaczania tyrozyny. Próba nie nadaje się do oznaczania tyrozyny w moczu, gdyŝ znajdujące się w nim sole powodują rozkład odczynnik. Do 0,5 cm 3 roztworów wzorcowych aminokwasów, analizowanego aminokwasu, roztworu białka oraz wody (6 probówek) dodać 1 krople odczynnika Millona i delikatnie zamieszać. Mieszaniny ogrzewać przez 1 minutę we wrzącej łaźni wodnej. Obserwować zmiany barwy. 0,1% roztwory: tyrozyny, tryptofanu, glicyny, białka, nieznanego aminokwasu odczynnik Millona (pod wyciągiem) Próbę wykonaj takŝe dla ch roztworów nieznanych aminokwasów! str. 5
Doświadczenie 3 Cel: Wykrywanie aminokwasów siarkowych 3.1. Wykrywanie cysteiny i cystyny Podczas ogrzewania w środowisku silnie alkalicznym związków zawierających grupy sulfhydrylowe (np. wolnej lub związanej w białku cysteiny czy cystyny) uwalnia się siarka w postaci jonów siarczkowych, które w reakcji z solami ołowiu (II) tworzą czarny osad siarczku ołowiu. Inny aminokwas siarkowy, metionina, w której siarka tworzy ugrupowanie tioeterowe, nie daje dodatniego wyniku reakcji. Do 0.5 cm 3 roztworów wzorcowych aminokwasów, analizowanego aminokwasu, roztworu białka oraz wody (w sumie 6 probówek) dodać po 1 cm 3 30% roztworu NaOH i 0.25 cm 3 5% roztworu octanu ołowiu i delikatnie zamieszać. Mieszaniny ogrzewać przez kilkanaście minut we wrzącej łaźni wodnej i obserwować zmiany. 0.1% roztwory: cysteiny, metioniny, glicyny, białka, nieznanego aminokwasu 30% roztwór NaOH 5% roztwór (CH 3 COO) 2 Pb Próbę wykonaj takŝe dla ch roztworów nieznanych aminokwasów! str. 6
3.2. Wykrywanie metioniny metodą McCarthy-Sullivana Siarka zawarta w cząsteczkach metioniny nie ulega uwolnieniu w środowisku alkalicznym. Metioninę wykrywa się przy uŝyciu nitroprusydku sodu w obecności glicyny (tworzy się o nieustalonej budowie). Pojawiające się róŝowo-łososiowe zabarwienie świadczy o obecności metioniny. Do 1.25 cm 3 roztworów wzorcowych aminokwasów, analizowanego aminokwasu, roztworu białka oraz wody (w sumie 6 probówek) dodać po 0.25 cm 3 30% roztworu NaOH, 0.25 cm 3 0,1% roztworu glicyny i 2 krople 2% roztworu nitroprusydku sodu, delikatnie zamieszać. Mieszaniny ogrzewać przez 10 minut w temperaturze ok. 60 o C - 80 o C (nie dopuścić do wrzenia). Następnie próby oziębić i dodać po ok. 0.25 cm 3 stęŝonego HCl. Obserwować zmiany. 0.1% roztwory: cysteiny, metioniny, glicyny, białka, nieznanego aminokwasu 30% roztwór NaOH 2% roztwór nitroprusydku sodu stęŝony HCl (wyciąg) Próbę wykonaj takŝe dla ch roztworów nieznanych aminokwasów! Cel: Wykrywanie histydyny metodą Pauly ego Doświadczenie 4 Związki zawierające pierścień imidazolowy (np. histydyna) oraz związki aromatyczne posiadające w pierścieniu podstawnik hydroksylowy lub aminowy (np. tyrozyna) ulegają w środowisku zasadowym sprzęganiu z solami diazoniowymi, dając barwne produkty (barwniki azowe). Histydyna tworzy w tej reakcji produkt o czerwonym, zaś tyrozyna o Ŝółto-pomarańczowym (herbacianym) zabarwieniu. Odczynnik Pauly ego składa się z trzech roztworów: kwasu sulfanilowego, azotanu (III) sodu oraz węglanu sodowego, których zmieszanie prowadzi do powstania, w wyniku reakcji diazowania, kwasu diazobenzenosulfonowego. str. 7
W probówce przygotować mieszaninę 1 cm 3 1% roztworu kwasu sulfanilowego oraz 1 cm 3 5% roztworu azotanu (III) sodu. Zawartość probówki wstrząsać przez kilka minut, jednocześnie chłodząc ją pod bieŝącą zimną wodą. Następnie do 6 probówek rozdzielić po 0.25 cm 3 powyŝszego odczynnika, dodać po 0.5 cm 3 10% roztworu węglanu sodu i po 0.25 cm 3 roztworów wzorcowych aminokwasów, analizowanego aminokwasu, roztworu białka i wody. Obserwować zmianę barwy. 0.1% roztwory: histydyny, tyrozyny, glicyny, białka, nieznanego aminokwasu 1% roztwór kwasu sulfanilowego w 1 M HCl 5% roztwór NaNO 2 10% roztwór Na 2 CO 3 Próbę wykonaj takŝe dla ch roztworów nieznanych aminokwasów! Cel: Wykrywanie argininy metodą Sakaguchiego Doświadczenie 5 Arginina (wolna lub związana w białku) posiada ugrupowanie guanidynowe, które reaguje z α-naftolem w obecności utleniacza bromianu (I) sodu tworząc pomarańczowoczerwony barwnik. Obecny w mieszaninie nadmiar bromianu (I) utlenia amoniak do wolnego azotu, który pod postacią pęcherzyków wydziela się z mieszaniny reagującej. W przypadku pozostawienia reakcji na dłuŝej, barwny produkt reakcji utlenia się, co powoduje odbarwienie roztworu. Do 0.5 cm 3 roztworów wzorcowych aminokwasów, analizowanego aminokwasu, roztworu białka oraz wody (5 probówek) dodać 0.25 cm 3 10% NaOH, 2 krople etanolowego roztworu α-naftolu oraz 1 kroplę 10% roztworu NaOBr. Wymieszać i obserwować zmianę barwy. str. 8
0.1% roztwory: argininy, glicyny, białka, nieznanego aminokwasu 10% roztwór NaOH 1% etanolowy roztwór α-naftolu 10% roztwór NaOBr Próbę wykonaj takŝe dla ch roztworów nieznanych aminokwasów! CZĘŚĆ II ANALIZA NIEZNANYCH AMINOKWASÓW Na podstawie prób wykonanych dla nieznanych roztworów dokonaj ich identyfikacji. ninhydrynowa van Slyke a ksantoprot einowa Voiseneta Millona z Pb 2+ McCarthy- Sullivana Pauly ego Sakaguchi ego glicyna + + - - - - - - - prolina + Ŝółty + - - - - - - - tyrozyna + + + - + - - tryptofan + + + + - - - - - + herba ciany - cysteina + + - - + - - - metionina + + - - - + - - histydyna + + - - - - - + czer wony - arginina + + - - - - - - + białko + - + + słabo + + + + + Numer badanej próbki Wnioski: str. 9