WALIDACJA TECHNIKI PCR dr inż. Krystyna Pappelbaum WSSE Bydgoszcz

WALIDACJA TECHNIKI PCR dr inż. Krystyna Pappelbaum WSSE Bydgoszcz

ZASADY TECHNIKI PCR Technika PCR (ang. Polymerase Chain Reaction) opiera się na prowadzeniu łańcuchowej reakcji polimerazy DNA (temostabilnego enzymu wyizolowanego, np. z termofilnej bakterii Thermus aquaticus), która pozwala na powielenie dowolnie wybranego fragmentu DNA o specyficznej sekwencji nukleotydów (np. obcej sekwencji DNA w badanym materiale) do

ogromnej liczby kopii zależnej od warunków reakcji. Produkty PCR (kopie powielonej sekwencji DNA) identyfikuje się przy pomocy elektroforezy w żelach. Technika wynaleziona w 1983 roku przez Kary'ego Mullisa i współpracowników z kalifornijskiej firmy Cetus. Za pracę w tej dziedzinie Kary Mullis otrzymał w roku 1993 Nagrodę Nobla.

Do przeprowadzenia reakcji PCR niezbędne są następujące czynniki: matryca DNA, zawierająca powielaną sekwencję; przynajmniej para tzw. starterów (ang. primer) [zdefiniowane sekwencje DNA (oligonukleotydy), komplementarne do końców powielanego fragmentu]; trifosforany deoksynuleozydów dntp jako substraty reakcji polimeryzacji (datp, dgtp, dctp, dttp) termostabilna polimeraza DNA (np. Taq wyizolowana z Thermus aquaticus lub inne);

bufor (10 x Taq bufor+kcl bez MgCl 2, 10 x Taq bufor+(nh 4 ) 2 SO 4 bez MgCl 2 ); MgCl 2 termocykler, tzn. wyspecjalizowany reaktor z termostatem.

Reakcja PCR wymaga trzech etapów: 1. Denaturacja termiczna (topnienie) dupleksu DNA w temperaturze 92-96 0 C, otrzymujemy jednoniciową matrycę DNA. 2. Dołączanie primerów do miejsca komplementarnego matrycy w temperaturze 37-72 0 C (ang. anneling). 3. Wydłużanie primerów od końca 3 - OH przez sukcesywne dosyntetyzowanie dntp (trifosforany deoksynukleozydów) w temperaturze 72 0 C, proces ten katalizowany jest przez polimerazę DNA.

Te trzy etapy reakcji, trwające przez określony czas nazywa się cyklem. Powtórzenia takich cykli prowadzi w efekcie do amplifikacji DNA. Jeśli dwa primery każdy selektywnie wiążący się do jednej z komplementarnych nici są wydłużane w cyklu amplifikacji, to nowo syntetyzowana nić DNA będzie zawierać miejsce wiązania dla następnego primera. W ten sposób, każda nowa nić DNA staje się matrycą w następnym cyklu amplifikacji i teoretycznie prowadzi do wzrostu ilości odpowiednich fragmentów DNA w postępie wykładniczym.

WYBÓR METODY Nie ma uniwersalnej metody na wykrywanie techniką PCR poszczególnych patogenów. Metodę, którą chcemy zastosować dla określonych patogenów np. Salmonella spp., Listeria monocytogenes, Campylobacter spp., E. coli O157:H7 czy Yersinia enterocolitica musimy zaadaptować do naszych warunków na podstawie publikacji lub innych dostępnych materiałów. Należy pamiętać, że w publikacjach poszczególne odczynniki podane są w stężeniach i trzeba przeliczyć je na µl.

EKSTRAKCJA DNA I WYKONANIE PCR Listeria monocytogenes Jedną kolonię (klon) wyrosłą na podłożu selektywnym, przenieść do 5 ml bulionu BHI i inkubować w temperaturze 37±1 0 C od 18 do 24 godz. Po inkubacji pobrać 1 ml hodowli i przenieść do probówki Eppendorf o poj. 1,5 ml. Wypłukać z płytki z selektywnym podłożem wyrosłe charakterystyczne kolonie przy pomocy 1,5 ml 0,01M Trizma - HCl i przenieść do probówki Eppendorf o poj. 1,5 ml.

Wykonać ekstrakcję DNA 1 ml hodowli bulionowej lub 1 ml popłuczyn odwirować w wirówce z chłodzeniem przez 5 min. przy 7000 obr/min (4000 x g). Po wirowaniu zlać ostrożnie płyn z nad powstałego osadu. Do osadu dodać 100 μl 0,01M Trizma - HCl i 400 μl 2,5% Chelex 100. Rozpuścić osad przez vortexowanie. Probówki przenieść do termostatu i ogrzewać w temperaturze 99 0 C przez 10 min. Następnie odwirować w wirówce z chłodzeniem przez 10 sek. przy 13.000 obr/min (15 000 x g). Ostrożnie pobrać 100 μl supernatantu, który jest chromosomalnym DNA i przenieść do sterylnych

probówek Eppendorf o poj. 0,5 ml. Przechowywać w zamrażarce w -20 0 C. Istnieje możliwość wykonania PCR L. monocytogenes z bulionu LEB (Listeria Enrichment Broth), ale nie z bulionu Fraser, ponieważ zawiera on w swoim składzie substancje hamujące reakcję PCR. Listeria monocytogenes

Oznaczenie genu kodującego białko p60 (iap-gen) metodą multiplex PCR. Białko Iap o masie 60 kda, kodowane przez gen iap (invasion-associated protein), jest produktem zewnątrzkomórkowym wszystkich gatunków Listeria. Występuje również na powierzchni komórek. Porównanie sekwencji aminokwasów tego białka wykazało pewne różnice pomiędzy gatunkami. Ciężar molekularny białka Iap L. monocytogenes wynosi 60 kda, podczas gdy jest on w zakresie 50 65 kda dla innych gatunków Listeria.

Bazując na tym porównaniu, kombinacja 5 różnych starterów pozwoliła na wykrycie i zróżnicowanie gatunków Listeria w pojedynczej reakcji multiplex PCR. Jeden starter pochodził z zachowawczego końca 3 i był specyficzny dla wszystkich gatunków Listeria. Cztery inne startery były specyficzne dla L. monocytogenes, L. innocua, L. grayi i dla trzech zgrupowanych gatunków L. ivanovii, L. seeligeri i L. welshimeri. Listeria grayi daje produkt amplifikacji 480 pz, L. monocytogenes 660 pz, L. innocua 870 pz, a trzy zgrupowane gatunki L. ivanovii, L. seeligeri i L.welshimeri 1.2 kpz.

Tabela 1. Przygotowanie roztworu mastermix do reakcji multiplex PCR dla L. monocytogenes Odczynniki i kolejność dodawania Roztwór podstawowy Końcowe stężenie Ilość odczynnika w μl H 2 O - - 3,7 μl Bufor reakcyjny 10 x stężony 1 x stężony 2.5 μl MgCl 2 25 mm 1.5 mm 1.5 μl dntp mix 1 mm 200 μm 5.0 μl Primer Lis1B Primer Siwi2 Primer Ino2 Primer Mono Primer MurgaI DNA polimeraza Taq 10 μm 10 μm 10 μm 10 μm 10 μm 0,8 μm 0,8 μm 0,8 μm 0,8 μm 0,8 μm 2.0 μl 2.0 μl 2.0 μl 2.0 μl 2.0 μl 5 U/ μl 1.5 U/ μl 0,3 μl Mastermix - - 23,0 μl DNA - - 2,0 μl Razem - - 25,0 μl

Parametry reakcji PCR Denaturacja wstępna Denaturacja 94 0 C/2 min 94 0 C/30 s Przyłączanie oligonukleotydów 56 0 C/30 s 30 cykli Wydłużanie (elongacja) 72 0 C/30 s Końcowe wydłużanie (elongacja) 72 0 C/5 min Przechowywanie próbek po reakcji PCR 4 0 C/

Primer Siwi2 Ino2 MonoA MurgaI Lis1B Sekwencja (5 3 ) TAA CTG AGG TAG CGA GCG AA ACT AGC ACT CCA GTT GTT AAA C CAA ACT GCT AAC ACA GCT ACT CCA GCA GTT TCT AAA CCT GCT TTA TAC GCG ACC GAA GCC AAC Sekwencja primerów dla oznaczenia genu iap

Przygotować żel agarozowy 1,5% z dodatkiem bromku etydyny (5 µl bromku na 100 ml żelu), osadzając w nim grzebień. Po zestaleniu grzebień usunąć, a żel umieścić w komorze do elektroforezy zawierającej ok. 1,5 L buforu 1x TBE. Nanieść do pierwszego i ostatniego dołka 10 μl markera wielkości, a do pozostałych dołków 10 lub 20 μl (w zależności od wielkości dołka) próbki po reakcji PCR, uprzednio dodając 5 μl buforu obciążającego.

Multiplex PCR iap- gen 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 1,2 kpz 870 pz 660 pz 480 pz Poz. 1-5 i 12 Listeria monocytogenes, poz. 6 11 Listeria innocua, poz. 13 zanieczyszczony szczep L. monocytogenes, poz. 14 wzorzec L. grayi, poz. 15 wzorzec L. monocytogenes, poz. 16 wzorzec L. innocua, poz. 17 wzorzec L. ivanovii, poz. 18 kontrola negatywna, poz. 1 i 20 markery wielkości.

Oznaczenie genu kodującego listeriolizynę O (hlya) Listeriolizyna, główny i najdokładniej scharakteryzowany czynnik wirulencji Listeria monocytogenes, jest białkiem o masie 58 kda (produkt genu hlya). Wytwarzana jest ona również przez L. ivanovii i L. seeligeri. Dla identyfikacji rodzaju Listeria, zaprojektowano dwa specyficzne startery w oparciu o sekwencję 16S rrna, która jest bardzo zachowawcza dla poszczególnych bakterii.

Natomiast dla identyfikacji L. monocytogenes zaprojektowano dwa inne startery w oparciu o sekwencję genu kodującego listeriolizynę O. Listeria spp. dają pojedyńczy produkt amplifikacji 938 pz wskazujący na obecność zachowawczej sekwencji 16S rrna typowej dla rodzaju, podczas gdy szczepy L. monocytogenes dają nie tylko produkt 938 pz, ale również produkt 750 pz, w wyniku amplifikacji wewnątrz regionu genu kodującego listeriolizynę O (hlya).

Starter U1 L11 LM1 LM2 Sekwencja (5 3 ) CAG CAG CCG CGG TAA TAC CTC CAT AAA GGT GAC CCT CCT AAG ACG CCA ATC GAA AAG CAC TTG CAA CTG CTC Sekwencja primerów dla oznaczenia genu hlya

Oznaczenie genu kodującego listeriolizynę (hly A gen) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 938 pz 750 pz Poz. 2 8 L. monocytogenes, poz. 9 E. feacalis, poz. 10 wzorzec L. innocua, poz. 11 wzorzec L. monocytogenes, poz. 12 kontrola negatywna, poz. 1 i 13 marker wielkości.

Wykrywanie i identyfikacja Salmonella spp. 1 ml hodowli na ZWP odwirować przy 10.000 rpm przez 5 min. Usunąć płyn znad osadu. Osad rozpuścić w 300 µl 6% roztworu Chelex 100 wymieszać (Vortex). Inkubować w temp. 56 0 C przez 15-20 min., a następnie inkubować przez 8 min w 100 0 C (termoblok). Wmieszać przez vortexowanie i schłodzić w lodzie. Odwirować przy 14.000 rpm przez 5 min. Supernatant (100 µl) przenieść do nowej probówki. Używać 5 µl supernatantu (DNA) do reakcji PCR.

Primery zwalidowane dla genu inva (kodującego cechy wirulencji) charakterystycznego dla Salmonella spp. 139: 5 -TG AAA TTA TCG CCA CGT TCG GGC AA-3 142: 5 -TCA TCG CAC CGT CAA AGG AAC C-3 Salmonella spp.

Tabela 2. Przygotowanie roztworu mastermix do reakcji pojedynczego PCR dla Salmonella spp. Odczynniki i kolejność dodawania Roztwór podstawowy Końcowe stężenie Ilość odczynnika w μl H 2 O - - 8.85 μl Bufor reakcyjny 10 x stężony 1 x stężony 2.5 μl MgCl 2 25 mm 1.5 mm 1.5 μl dntp mix 1 mm 200 μm 5.0 μl Primer 139 Primer 141 10 μm 10 μm 0.4 μm 0.4 μm 1.0 μl 1.0 μl DNA polimeraza Taq 5 U/ μl 0.75 U/ μl 0.15 μl Mastermix - - 20.0 μl DNA - - 5.0 μl Razem - - 25.0 μl

Reakcja PCR Denaturacja wstępna 95 0 C 1 min Denaturacja 95 0 C 30 s Przyłączanie 64 0 C 30 s 38 cykli Wydłużanie 72 0 C 30 s Koocowe wydłużanie 72 0 C 4 min Elektroforeza 1.8% żel agarozowy, napięcie 5V/cm Produkt PCR 284 pz

1 2 3 4 5 6 7 8 284 pz Ścieżka 1: marker wielkości 100-pz, 2: S. Seftenberg, 3: S. Dublin. 4: S. Typhimurium, 5: S. Agona, 6: S. Braenderup H9812, 7: Kontrola negatywna, 8: marker wielkości 100-pz.

WALIDACJA TECHNIKI PCR Walidację (sprawdzenie) przeprowadzić zgodnie z PN-EN ISO 16140:2004 Mikrobiologia żywności i pasz. Protokół walidacji metod alternatywnych. Badanie należy wykonać zarówno na próbkach rzeczywistych, jak i kontaminowanych. Kontaminacja powinna być na trzech poziomach: próba ślepa, niskim (5 do 10 jtk) i wysokim (50 do 100 jtk). Równolegle prowadzimy badania metodą referencyjną, dla danego patogenu docelowego. Na każdym poziomie powinno być zbadanych minimum 30 próbek, najlepiej 50 próbek.

Następnie oceniamy zebrane wyniki obliczając zgodnie z Tabelą 3: Tabela 3. Reakcje Metoda referencyjna - pozytywne Metoda referencyjna - negatywne Metoda alternatywna - pozytywne +/+ pozytywna zgodność (PA) -/+ pozytywne odchylenie (PD) Metoda alternatywna - negatywne +/- negatywne odchylenie (ND) -/- negatywna zgodność (NA)

Względna dokładność: AC = (PA + NA)/N x 100% (1) Względna specyficzność: SP = NA/N- x 100% (2) Względna czułość: SE = PA/N+ x 100% (3) Powtarzalność, w %, - (zgodność wyników badania tej samej próbki w warunkach powtarzalności) Odtwarzalność, w % - wewnątrz laboratoryjna (zgodność wyników badania tej samej próbki w warunkach odtwarzalności)

Precyzja metody Powtarzalność i odtwarzalność w %, wyliczona ze stosunku par wyników zgodnych / do liczby wszystkich podwójnie wykonanych badań (zgodnych i niezgodnych) x 100%.

WEWNĘTRZNE STEROWANIE JAKOŚCIĄ BADAŃ Na program sterowania składa się: Kontrola pozytywna procesu: negatywna próbka zanieczyszczona patogenem docelowym. Próbka przetwarzana jest przez cały proces. Kontrola negatywna procesu: negatywna próbka zanieczyszczona organizmem niedocelowym. Próbka jest przetwarzana przez cały proces.

Kontrola negatywna PCR: wszystkie odczynniki PCR, ale nie kwasy nukleinowe poza primerami. Kontrola pozytywna PCR: wszystkie odczynniki PCR i dodatkowo wyizolowane DNA patogenu docelowego.

Wykrywanie i identyfikacja Campylobacter spp. W celu wykrycia Campylobacter spp. zaprojektowano dwa specyficzne startery w oparciu o sekwencję 16S rrna, która jest bardzo zachowawcza. I primer OT1559: 5 - CTG CTT AAC ACA AGT TGA GTA GG - 3 II primer 18-1: 5 - TTC CTT AGG TAC CGT CAG AA - 3 Produkt PCR 287 pz.

Campylobacter spp. 287 pz

Primery dla różnych gatunków Campylobacter w multiplex PCR. Primer Produkt PCR Sekwencja gen CJF 323 5 -ACT TCT TTA TTG CTT GCT GC-3 C. jejuni hipo CJR 5 -GCC ACA ACA AGT AAA GAA GC-3 CCF 126 5 -GTA AAA CCA AAG CTT ATC GTG A-3 C. coli glya CCR 5 -TCC AGC AAT GTG TGC AAT G-3 CLF 251 5 -TAG AGA GAT AGC AAA AGA GAA-3 C. lari glya CLR 5 -TAC ACA TAA TAAT CCC ACC C-3 CUF 204 5 -AAT TGA AAC TCT TGC TAT CC-3 C. upsaliensis glya CUR 5 -TCA TAC ATT TTA CCC GAG CT-3 CFF 435 5 -GCA AAT ATA AAT GTA AGC GGA GAG-3 C. fetus sapb2 CFR 5 -TGC AGC GGC CCC ACC TAT-3 23SF 650 5 -TAT ACC GGT AAG GAG TGC TGG AG-3 C. jejuni 23S rrna 23SR 5 -ATC AAT TAA CCT TCG AGC ACC G-3

FIG. 1. Wykrywanie i identyfikacja gatunków Campylobacter metodą multiplex PCR. Lanes 1 and 9: 123-pz marker; lane 2: C. coli NCTC 11353, 126-pz fragment; lane 3: C. upsaliensis ATCC 43954, 204-pz fragment; lane 4: C. lari NCTC 11352, 251-pz fragment; lane 5: C. jejuni NCTC 11168, 323-pz fragment; lane 6: C. fetus subsp. fetus ATCC 27374, 435-pz fragment; lane 7: C. sputorum biovar fecalis ATCC 33711, 650-pz fragment of 23S rrna (który występuje we wszystkich Campylobacter spp., Arcobacter and Helicobacter testowanych izolatów); and lane 8: PCR-pozytywna kontrola z mieszaniną DNA.

Wykrywanie i identyfikacja Yersinia enterocolitica Dwa zestawy primerów (primery A1 i A2 oraz primery Y1 i Y2) zastosowano w multiplex PCR. Primery A1 (5'-TTA ATG TGT ACG CTG GGA GTG-3') A2 (5'-GGA GTA TTC ATA TGA AGC GTC-3') bezpośrednio dla genu ail pałeczek Y. enterocolitica, który zawierają tylko szczepy chorobotwórcze. Produkt PCR 425 pz.

Dla specyficznej amplifikacji genu 16S rrna Y. enterocolitica, zastosowano drugi zestaw Y1 (5'-AAT ACC GCA TAA CGT CTT CG-3') Y2 (5'-CTT CTT CTG CGA GTA ACG TC-3'), który dał produkt PCR 330 pz.

Poz. 1 Marker wielkości, poz. 2 Y. enterocolitica O:5, biotyp 1A; poz. 3 Y. enterocolitica O:8, biotyp 1A poz. 4 Y. enterocolitica O:5,27, biotyp 2; poz. 5 Y. enterocolitica O:9, biotyp 2; poz. 6 Y. enterocolitica O:1,2,3, biotyp 3; poz. 7 Y. enterocolitica O:3, biotyp 4; poz. 8 Y. enterocolitica O:2,3, biotyp 5; poz. 9 Y. bercovieri; poz. 10 Y. frederkseni;

Primery użyte w multiplex PCR dla identifikacji i określenia wirulencji chorobotwórczych Yersinia spp. wyizolowanych z żywności Primer a Sequence (5'-3') Produkt PCR (pz) 9A, ail GTT TAT CAA TTG CGT CTG TTA ATG TGT ACG 454 10A CTA TCG AGT TTG GAG TAT TCA TAT GAA GCG 11A, virf AAG GTT GTT GAG CAT TCA CAA GAT GG 700 12A TTT GAG TGA AAT AAG ACT GAC TCG AGAACC rfbca, rfbc CGC ATC TGG GAC ACT AAT TCG 405 rfbcb CCA CGA ATT CCA TCA AAA CCA CC Pr2a, yst AAT GCT GTC TTC ATT TGG AGC 145 Pr2c ATC CCA ATC ACT ACT GAC TTC a ail, for attachment invasion locus; virf, for virulence regulatory functions located on the virulence plasmid; rfbc, of unknown function, located within the rfb cluster responsible for the biosynthesis of the O side chain of Y. enterocolitica O:3; yst, for Yersinia heat-stable toxin.

Multiplex PCR targeting genes encoding four virulence-associated properties: yst (145 (bp), rfbc (405 bp), ail (454 bp), and virf (700 bp). Lanes: 1, 2, and 3, Y. enterocolitica 4/O:3; 4, Y. enterocolitica O:8; 5, Y. pseudotuberculosis; M, 100-bp ladder as the DNA size control.

Werotoksyczne Escherichia coli PCR primers Sekwencja primerów (5 3 ) Specyficzność a Produkt PCR (pz) stx1f ATAAATCGCCATTCGTTGACTAC nt 454 633 of A subunit coding region of stx 1 180 stx1r AGAACGCCCACTGAGATCATC stx2f GGCACTGTCTGAAACTGCTCC nt 603 857 of A subunit coding region of stx 2 (including stx 2 variants) 255 stx2r TCGCCAGTTATCTGACATTCTG eaeaf GACCCGGCACAAGCATAAGC EPEC and STEC) eaear CCACCTGCAGCAACAAGAGG nt 27 410 of eaea (this region is conserved between 384 hlyaf GCATCATCAAGCGTACGTTCC nt 70 603 of EHEC hlya 534 hlyar AATGAGCCAAGCTGGTTAAGCT a nt, nucleotide;

Characterization of reference STEC strains by multiplex PCR assay. Lanes: M, DNA size markers; 1, negative control; 2, O157:H strain 96/2998 (stx 1+ stx 2+ eaea + EHEC hlya + ); 3, O157 strain 94-8628 (stx 2 + eaea + EHEC hlya + ); 4, O157 strain 96/0052 (stx 1+ stx 2+ eaea + ); 5, O48:H21 strain 94CR (stx 1+ stx 2+ EHEC hlya + ); 6, O128 strain 95AS1 (stx 1+ stx 2+ ); 7, O91 strain 95HE4 (stx 1+ EHEC hlya + ); 8, O113 strain MW10 (stx 2+ EHEC hlya + ); 9, OX3:H21 strain O31 (stx 2+ ).

Inhibitory PCR 1. Krew: immuglobina G, hemoglobina i laktoferyna 2. Fekalia: sole żółci, złożone polisacharydy 3. Mleko: proteinazy, jony wapnia 4. Mocz: mocznik 5. Odczynniki: fenol, formamid, detergenty jonowe 6. Kwasy nukleinowe, matryca DNA badanego produktu 7. Talk z rękawic gumowych 8. Matryca żywnościowa

Dziękuję za uwagę