WOLNE RODNIKI: test FORT 0344 Test wolnych rodników tlenowych (ang. Free Oxygen Radicals Testing) Przeznaczenie Pakiet odczynników do samodzielnej diagnostyki in vitro służy do ilościowego oznaczania stresu oksydacyjnego w krwi pełnej. Ocena wskaźnika oksydoredukcyjnego (REDOKS), jest możliwa w połączeniu z badaniem FORD (kod AD-12136 i/lub AD-12139). Wstęp Wolne rodniki to cząsteczki posiadające niesparowane elektrony, co czyni je niestabilnymi, z krótkim okresem półtrwania. Są wysoce reaktywne, co powoduje, że wyzwalają reakcję łańcuchową. Każdy rodnik mający w składzie tlen można nazwać reaktywną formą tlenu (ang. Reactive Oxygen Species - ROS). Wszystkie fizjologiczne reakcje biochemiczne zachodzące w komórkach polegają na przenoszeniu elektronów i tworzeniu się wolnych rodników. Tak więc, ROS są naturalnym produktem metabolizmu biologicznego i mają działanie korzystne (np. czynność mitochondriów i odpowiedź immunologiczna), lecz jeśli występują w nadmiarze są bardzo szkodliwe i atakują składniki komórkowe, w szczególności tłuszcze, białka i DNA. Na szczęście, żywe komórki wyposażone są w liczne substancje ochronne, określane mianem przeciwutleniaczy (antyoksydantów). W normalnych warunkach organizm neutralizuje wolne rodniki, lecz jeśli przeciwutleniacze nie są dostępne, ich działanie jest zaburzone lub produkcja wolnych rodników jest zbyt intensywna, może dojść do uszkodzeń oksydacyjnych. Ich wynikiem jest wystąpienie stresu oksydacyjnego. Pojęcie to dotyczy stanu zakłóconej równowagi pomiędzy utleniaczami i przeciwutleniaczami. Uszkodzenia spowodowane przez wolne rodniki są komponentą większości chorób występujących u człowieka, a także są silnie powiązane z procesami starzenia się. Zasada testu FORT jest oznaczeniem kolorymetrycznym, opierającym się na zdolności metali przejściowych, takich jak żelazo, do katalizowania (w obecności wodoronadtlenków -ROOH) reakcji tworzenia wolnych rodników (reakcje 1-2), które zostają następnie wyłapane przez pochodną aminową CrNH 2. Amina reaguje z wolnymi rodnikami tworząc barwny, stosunkowo trwały kation rodnikowy, wykrywalny przy długości światła 505 nm (reakcja 3). Intensywność barwy jest bezpośrednio skorelowana z ilością związków rodnikowych oraz stężeniem wodoronadtlenków, a w konsekwencji, ze statusem oksydacyjnym w próbce, zgodnie z prawem Lamberta-Beera. 1. R-OOH + Fe 2+ RO + OH - + Fe 3+ 2. R-OOH + Fe 3+ ROO + H + + Fe 2+ 3. RO + ROO + 2CrNH 2 ROO - + RO - + [CrNH 2 + ] fioletowy Warunki pracy Długość fali: 505 nm Długość optyczna: 1cm Czas reakcji: 6 minut Typ reakcji: kinetyczna Temperatura reakcji: 37 C/98,6 F Objętość próbki: 20 μl krwi pełnej Ostrzeżenia i środki ostrożności Dokładnie zapoznać się z instrukcją użytkowania. Ustawić czynnik K, znajdujący się na zewnątrz opakowania. Strona 1
Nie używać odczynników po dacie ważności podanej na opakowaniu. Nie używać składników zestawu do żadnego innego celu, niż opisany w rozdziale "Przeznaczenie". Zastosować konieczne środki ostrożności wymagane podczas posługiwania się wszelkimi substancjami chemicznymi: stosować jednorazowe rękawiczki; dokładnie zamykać kuwety i probówki zawierające próbki materiału biologicznego; nie jeść, nie pić i nie palić podczas wykonywania testu. Nie używać nadtlenku wodoru (H 2 O 2 ) do dezynfekcji. Usuwać odpady, postępując zgodnie z wymaganiami obowiązującego prawa miejscowego. Karty charakterystyki bezpieczeństwa dostępne są na życzenie. Skład Odczynnik R1 Odczynnik R2 Chromogen Roztwór buforu ph 5,0 Stabilizator Przygotowanie i przechowywanie odczynników Wszystkie odczynniki są w postaci gotowej do użytku. Odczynniki zachowują stabilność do daty wskazanej na opakowaniu, pod warunkiem przechowywania w temperaturze pokojowej (15-30 C/59-86 F) i w zamkniętym opakowaniu aluminiowym. Należy zapoznać się z informacjami zawartymi na etykiecie i po użyciu dokładnie zamykać aluminiowe opakowanie. Zawartość opakowania Kod AD-12107-A: 1 blister zawierający 30 FORT R2; 3 blistry zawierające po 10 FORT R1 z kodem paskowym; 1 fiolka z CZARNYM korkiem zawierająca kapilary 20μl; ulotka. Kod AD-12133-A: 1 blister zawierający 5 FORT R2 + 5 FORT R1 z kodem paskowym; 1 fiolka z korkiem BEZBARWNYM zawierająca kapilary 20μl; ulotka. Kod AD-12107-B: 1 blister zawierający 30 FORT R2; 3 blistry zawierające po 10 FORT R1 bez kodu paskowego; 1 fiolka z CZARNYM korkiem zawierająca kapilary 20μl; ulotka. Kod AD-12133-B: 1 blister zawierający 5 FORT R2 + 5 FORT R1 bez kodu paskowego; 1 fiolka z korkiem BEZBARWNYM zawierająca kapilary 20μl; ulotka. Materiały pakowane osobno Następujące materiały są dostępne odrębnie, na zamówienie: Roztwór kontrolny FORT Kontrola jakości Użytkownicy powinni wprowadzić program kontroli jakości (QC) w celu weryfikacji sprawności instrumentu i odczynników, z zastosowaniem zalecanych kontroli. Materiały do kontroli jakości dostarczane są przez firmę Callegari S.p.A. na żądanie. Należy zapoznać się z ulotką znajdującą się w każdym opakowaniu kontroli, aby dowiedzieć się, w jaki sposób ich używać i jak je przechowywać. Wartości uzyskane w toku kontroli jakości powinny mieścić się w dopuszczalnych zakresach określonych przez producenta i podanych na opakowaniu odczynników kontrolnych. Jeśli kontrole nie dają oczekiwanych wyników, test należy powtórzyć, dopilnowując, aby wszelkie procedury i instrukcje posługiwania się były ściśle przestrzegane. W razie wątpliwości, wartości zmierzonych dla próbek pacjenta nie należy podawać. Strona 2
W razie konieczności należy skontaktować się z Działem obsługi klienta firmy Callegari S.p.A. Próbka 20 μl świeżej krwi włośniczkowej lub krwi żylnej pobranej na heparynę. Próbkę krwi włośniczkowej należy badać niezwłocznie, podczas gdy próbkę krwi żylnej można badać w okresie trzech godzin, pod warunkiem jej przechowywania w temperaturze 2-8 C. Akcesoria konieczne do przeprowadzenia testu Spektofotometr Callegari S.p.A. Wirówka. Rękawiczki, gazik namoczony alkoholem, jałowy suchy gazik - Stosować wyłącznie alkohol lub podobne środki. Jednorazowe, jałowe nakłuwacze (lancety) - Używać wyłącznie wyrobów posiadających znak CE. Szczypce do obsługi kapilar (w zestawie). Kapilary (dostarczane z odczynnikami). Odpowiednie pojemniki na odpady biologiczne. Pobieranie próbki krwi włośniczkowej 1. Należy wybrać miejsce z boku opuszka jednego z środkowych palców dowolnej dłoni. Aby wspomóc przepływ krwi, palce i dłoń powinny być ciepłe w dotyku. 2. Przetrzeć gazikiem miejsce nakłucia i odczekać aż alkohol wyparuje. 3. Należy nacisnąć opuszek palca, przyłożyć lancet do skóry i przycisnąć do momentu kliknięcia. (Ostrzeżenie: używać wyłącznie urządzenie do nakłuwania oznaczone znakiem CE) 4. Delikatnie ucisnąć palec i usunąć suchym gazikiem pierwszą kroplę krwi, ponieważ może się w niej znajdować płyn tkankowy. 5. Ponownie, wolno i rytmicznie rozmasowywać nakłuty palec, aż do momentu pojawienia się kropli krwi. Nie uciskać palca zbyt mocno. 6. Dotknąć kapilarą kropli krwi, trzymając ją pod lekko opadającym kątem. Kapilara napełni się dzięki działaniu siły lepkości. Nie pobierać pęcherzyków powietrza. 7. Po pobraniu pełnej kapilary należy jej końcówką przesunąć po suchej skórze palca, w celu pozbycia się nadmiaru krwi. Procedura testu FORT 1. Umieścić kapilarę z próbką pełnej krwi (20 µl) w probówce z odczynnikiem FORT R2. 2. Delikatnie kilkukrotnie przechylić probówkę, aż kapilara zostanie opróżniona z krwi. 3. Przelać zawartość do kuwety z odczynnikiem FORT R1 i delikatnie przechylać przez kilka sekund. 4. Wirować przez 1 minutę przy około 3500 obrotów na minutę 1. Po zakończeniu wirowania, sprawdzić, czy płyn nadosadowy jest klarowny. 5. Umieścić aktywowaną kuwetę w komorze odczytowej. Test rozpocznie się automatycznie. Wynik jest dostępny po 6 minutach. Wartości referencyjne <310 jednostek FORT (<2,36 mmol/l równoważnika H 2 O 2 ). 1 jednostka FORT odpowiada w przybliżeniu 0,26 mg/l H 2 O 2. 1 Do wirowania użyć odpowiednią probówkę jako przeciwwagę. Strona 3
Charakterystyka skuteczności Liniowość 160-600 jednostek FORT (1,22-4,56 mmol/l H 2 O 2 ) Jeśli uzyskany wynik znajduje się poza zakresem liniowości, wyświetlany jest komunikat <X lub >Y (X oznacza granicę dolną, a Y granicę górną zakresu). Powtarzalność Powtarzalność rozumiana jako precyzja w obrębie pomiaru jest miarą zgodności pomiędzy wynikami niezależnych testów uzyskanymi dla identycznych próbek (pełnej krwi) przez tego samego analityka, używającego tej samej metody i tego samego urządzenia, w jednym laboratorium i w stosunkowo krótkim odstępie czasu, wynoszącym zwykle mniej niż 1 dobę. Zwykle wyraża się ją liczbowo w postaci współczynnika wariancji (CV) wyników niezależnych testów. Liczba testów Średnia (FORT U) % CV 20 350 <5 Precyzja Precyzję pomiędzy oznaczeniami ustalono w oparciu o wyniki niezależnych testów uzyskane dla identycznych próbek (pełna krew) przy zastosowaniu tej samej metody, w różnych warunkach doświadczenia, i w długim okresie czasu, zwykle wynoszącym kilka dni. Liczba testów Średnia (FORT U) % CV 40 350 <5 Dokładność Dokładność pomiaru to stopień zgodności pomiędzy wynikiem testu a wartością rzeczywistą. Liczbowo wyraża się ją w postaci ODCHYLENIA, czyli różnicy procentowej pomiędzy średnią wszystkich wyników testu a wartością referencyjną. Ponieważ ODCHYLENIE jest funkcją stężenia analitu, dokładność testu FORT określono poprzez wykonanie szeregu pomiarów roztworu zawierające znaną ilość mierzonego analitu (standardowego roztworu H 2 O 2 ). ODCHYLENIE < 4% dla 1,43 mm H 2 O 2 C 4,23 mm H 2 O 2 ODCHYLENIE < 7% dla C = 1,214 mm H 2 O 2 ODCHYLENIE < 12% dla C 4,74 mm H 2 O 2. Zakłócenia Zastosowanie dowolnych środków chelatujących żelazo i/lub sztucznych źródeł wodoronadtlenków lub antyoksydacyjnych środków konserwujących, takich jak EDTA, cytryniany, H 2 O 2, BHT, BHA, Desferal, kwas askorbinowy, powoduje uzyskanie fałszywie niskich wyników. Testy przeprowadzone u osób badanych, których hematokryt nie mieści się w zakresie 37-48% wykazują tendencję do odchyleń wobec testów przeprowadzonych na surowicy pochodzącej z tych samych próbek. Zaleca się sprawdzenie hematokrytu pacjentów. WSKAŹNIK REDOKS: równowaga oksydoredukcyjna Stres oksydacyjny występuje, gdy produkcja wolnych rodników przewyższa możliwości obronne przeciwutleniaczy, co prowadzi do uszkodzeń struktur komórkowych. Dlatego, status oksydoredukcyjny można określić mierząc swoiste pojedyncze markery uszkodzeń oksydacyjnych (np. test FORT) lub mierząc poziom obrony antyoksydacyjnej (np. test FORD). Strona 4
W niektórych przypadkach użytecznym jest połączenie tych pomiarów, obejmujących uszkodzenia oksydacyjne i czynniki przeciwutleniające, w celu uzyskania wyniku całościowego. W tym celu wprowadzono obliczenie wskaźnika (WSKAŹNIKA REDOKS), który odzwierciedla ogólną i całkowitą równowagę oksydoredukcyjną. Do obliczenia tego wskaźnika używane są stężenia FORT i FORD uzyskane dla każdej osoby badanej. Aby możliwe było uzyskanie syntezy obu parametrów, używających odmiennych jednostek pomiarowych oraz charakteryzujących się odmienną zmiennością analityczną, opracowano tabelę służącą krytycznemu porównaniu wartości FORT i FORD. W końcu, opracowano pięć głównych profili (oznaczanych literami od A do E), odpowiadających różnym stopniom statusu oksydacyjnego. Obliczenie wskaźnika REDOKS (Dla wersji oprogramowania 5.40 i nowszych) Wskaźnik REDOKS jest obliczany automatycznie po przeprowadzeniu pomiarów FORT i FORD (w okresie 1 godziny), zgodnie z procedurami określonymi w odnośnych instrukcjach użytkowania. Jeśli uzyskano więcej niż 2 wyniki tego samego parametru (np. dwa wyniki FORT) obliczenie odnosi się do ostatniego uzyskanego wyniku. Wartości wskaźnika REDOKS zapewniane są dopiero po wydrukowaniu biletu, i wyłącznie jeśli wyniki testów FORT i FORD mieszczą się w swoich zakresach liniowości. W przeciwnym razie wyświetlane jest ostrzeżenie "N/A!" (nie dotyczy). Wskaźnik wyrażany jest w postaci liczby (w zakresie od 0 do 100) wskazującej odpowiedni profil (A-E) oraz status równowagi oksydoredukcyjnej. FORT FORD Profil wskaźnika REDOKS Stopień Równowaga REDOKS <300 1,08 0-25 A Optymalna <300 1,07 25-50 B Utajony stres oksydacyjny 300-330 1,08 50-58,3 C Skompensowany stres oksydacyjny 300-330 1,07 58,3-66,6 D Osoba narażona na ryzyko oksydacji 331 0,25-3,00 66,6-100 E Trwający stres oksydacyjny Piśmiennictwo 1. Halliwell B and Gutteridge JMC, (Red.). Free radicals Biology and Medicine, Clarendon Press, Oxford, 1989. 2. Fulbert JC, Cals MJ. Pathologie Biologie 40: 66:-77, 1992. 3. Stohs SJ. Journal of Basic and Clinical Physiology and Pharmacology 6: 205:-228, 1995. 4. Kehrer JP. The Haber-Weiss reaction and mechanism of toxicity. Toxicology 149: 43:-50, 2000. 5. Verde V et al. Free Radical Research 36 (8): 869:-873, 2002. 6. Dal Negro R W et al. GIMT, Italian Journal of Chest Diseases 57 (3): 199:-209, 2003. 7. Gramignano et al. Nutrition 22: 136:-145, 2006. 8. Macciò A et al. Blood 106 (1): 362:-367, 2005. 9. Abramson JL et al. Atherosclerosis 178: 115:-121, 2005. 10. Mantovani et al. Cancer, Epidemiology, Biomarkers & Prevention 13: 1651:-1659, 2004. 11. Veglia F et al. Biomarkers 11 (6): 562:-573, 2006. Producent Callegari S.p.A. Via Adamello 2/A Parma - Italy Dystrybutor Cambridge Diagnostics Sp. z o.o. Walecznych 56/2 Warszawa - Polska Strona 5
Lista symboli Wyrób medyczny do diagnostyki in vitro Numer serii Data ważności 0344 Znak CE - W zgodzie z Dyrektywą WE 98/79 i późniejszymi poprawkami Dlgs 332/2000 Producent Uwaga - Patrz instrukcja użytkowania Temperatura przechowywania Zagrożenia biologiczne Strona 6