Nr kat.: 10003388 Do celów mikrobiologicznych Zestaw przeznaczony jest do rutynowej identyfikacji gram-ujemnych niefermentujących bakterii znalezionych przede wszystkim w materiale klinicznym oraz umożliwia także identyfikację najczęściej spotykanych oksydazo-dodatnich pałeczek G-. Zestaw wystarcza do identyfikacji 40 szczepów, każdy za pomocą dwudziestu czterech testów biochemicznych. Testy umieszczone są we wgłębieniach na płytkach do mikromiareczkowania, trzy rzędy po osiem wgłębień do identyfikacji jednego szczepu. Identyfikację można uzupełnić testem paskowym OXItest (do oznaczania oksydazy cytochromowej) Zestaw zawiera: 10 paneli identyfikacyjnych (każdy do identyfikacji 4 szczepów) z wysuszaczem Instrukcję obsługi wraz z tabelą identyfikacyjną 10 PE torebek do inkubacji Torebkę do przechowywania przeznaczoną do ułożenia niezużytej reszty płytki, 1szt. 40 formularzy do wpisywania wyników Pokrywę Zalecany sposób postępowania dla Przechowywanie, termin ważności: Zestaw należy przechowywać w lodówce w temperaturze +2 do +8 C. Termin ważności podany jest na każdym opakowaniu. Materiały potrzebne do pracy z, które nie wchodzą w skład zestawu: Nośnik zawiesiny do (nr kat. 10003389 1op./20 oznaczeń) Odczynnik do testu INDOL (nr kat. 10003372 1op./360 oznaczeń) Odczynnik do testu FOSFATAZA (nr kat. 10003374 10op./360 oznaczeń) Odczynnik do testu AZOTANY (nr kat. 10003373 1op./180 oznaczeń/nitrates) Sterylizowany olej parafinowy (nr kat. 10003371 1op./120 oznaczeń) Szalki Petriego z pożywką (agar z krwia) Probówki 100 x 15 mm z 2,5 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej Densi-La-Meter II (nr kat. 50001529) Automatyczna mikropipeta 0,1 ml, sterylne końcówki Cieplarka 30 C Zwykły sprzęt laboratoryjny (ezy, markery, palnik) Do wykrywania oksydazy cytochromowej: OXItest (nr kat 10003324 1op./50 oznaczeń) Niezbędne pomoce identyfikacyjne, które nie wchodzą w skład zestawu: Porównawcza skala barw do (nr kat. 50001525) Książka kodów do (nr kat. 50001724) Program identyfikacyjny TNW Uwaga: Zestaw przeznaczony jest do profesjonalnego zastosowania Przestrzegaj zasad pracy z materiałem zakaźnym! Izolowanie kultury: Przygotowanie inokulum: Izolowanie kultury powinno zostać przeprowadzone tradycyjną techniką na agarze z krwią Przeprowadzić próbę oksydazową (OXItest) z czystej 24 godzinej hodowli, zapisać wynik do arkuszu do wpisywania wyników Sporządzić zawiesinę bakteryjną w roztworze soli fizjologicznej z czystej, 24-godzinnej hodowli. Zawiesina powinna wykazywać zmętnienie równe 2 w skali zmętnienia McFarlanda. Slabsza lub gęstsza zawiesina może powodować falszywe reakcje. Przygotowanie panelu zestawu : Otworzyć ALU torebkę poprzez odcięcie brzegu torebki obok miejsca spawu oraz wyjąć płytkę. Przy pomocy skalpela należy odciąć odpowiednią ilość pasków płytki, zgodnie z ilością badanych szczepów (3 rzędy, tj. 24 studzienek do identyfikacji jednego szczepu).
Odcięte paski należy wyjąć z panelu, zdjąć ochronną ALU folię, paski włożyć do pustej ramki. W przypadku pracy z zestawem MIKROLATEST po raz pierwszy i niedysponowaniem wolną ramką, należy wyjąć niezużyte studzienki z pierwszej pełnej ramki, ułożyć luzem w torebce do przechowywania a ramkę tej pierwszej płytki wykorzystać do inkubacji. Wpisać nr badanych kultur na odpowiednie paski. Resztę niezużytej płytki z wysuszaczem włożyć do dołączonej ALU torebki przeznaczonej do włożenia niezużytej płytki i całość następnie włożyć do lodówki do kolejnego użycia; plytkę należy chronić przed wilgocią. Zalecamy zużyć płytkę do 4 tygodni od pierwszego zastosowania. Inokulacja: Zhomogenizować dokładnie zawiesinę w roztworze soli fizjologicznej. Wykonać posiew 0,1 ml zawiesiny do wgłębień wszystkich kolumn H-E (tj. do wgłębień w lewej połowie płytki. Wgłębienia w lewej oraz prawej połowie płytki różnią się zabarwieniem suchych substratów w pojedynczych wgłębieniach) Pipetować 1 ml zawiesiny w roztworze soli fizjologicznej do fiolki z nośnikiem zawiesiny do NEFERMtest 24 (objętość 1 ml). Zhomogenizować dokładnie rozcieńczoną zawiesinę Wykonać posiew 0,1 ml rozcieńczonej zawiesiny do wgłębień wszystkich kolumn D-A (tj. do wgłębień w prawej połowie płytki). Po posiewie dodać olej parafinowy: - 1 rząd, wgłębienia H, G, F, E (próba IND, ARG, URE, LYS ) 2 krople oleju Uwaga: Pokrywa ramki płytki zawiera nadruk skrótów testów i symboli: (zakropić olejem parafinowym) i (dodać odczynnik). W przypadku wykorzystywania pokrywy w trakcie pracy do nakrycia płytki, należy przed zastosowaniem wewnętrzną stronę pokrywy zdezynfekować etanolem. Inkubacja: Umieścić ramkę z paskami w torebce z polietylenu. Założyć otwarty brzeg torebki pod płytkę, aby uniknąć wysychania podczas inkubacji. Inkubować płytkę w temp. 30 C przez 48 godziny. Ocena: Przed odczytem dodać odczynniki do następujących wgłębień : - 1 rząd, wgłębienie H (test INDOL) 2 krople odczynnika do INDOL - 2 rząd, wgłębienie H (test FOSFATAZA) 1 kropla odcz. do FOSFATAZA - 3 rząd, wgłębienie H (test AZOTANY) 1 kropla odczynnika do AZOTANY - 3 rząd, wgłębienie G (test AZOTYNY) 1 kropla odczynnika do AZOTANY Wymienione prawidłowe wgłębienia są oznakowane znakiem kropelki. Inkubować płytkę przez kolejne 10-15 minut w temperaturze laboratoryjnej Odczytać reakcje i zapisać wyniki na arkuszu. W przypadku testu AZOTANY (3 rząd, wgłębienie H) zapisać wynik wyłącznie w przypadku dodatniej reakcji (czerwone zabarwienie) Dosypać starannie sproszkowany cynk (ok. 5 mg, na końcówce ezy) do wgłębień z ujemną reakcją (bezbarwny, blado różowy kolor), następnie inkubować płytkę przez kolejne 10-15 minut w temperaturze laboratoryjnej. Odczytać reakcje i zapisać wyniki na arkuszu. Uwaga: Odczyt należy prowadzić przy pomocy Porównawczej skali barw do, tabeli Interpretacja reakcji oraz/lub zgodnie z reakcjami barwnymi szczepów kontrolnych. Identyfikacja: Podczas identyfikacji należy korzystać z Tabeli różnicującej lub Książki kodów (zalecane), odp. przeprowadzić identyfikację w komputerze stosując odpowiedni program (zalecane). Podczas identyfikacji należy uwzględnić wszystkie wyniki łącznie z dodatkowymi dostępnymi cechami charakterystycznymi, takimi jak pochodzenie szczepu, rodzaj kolonii, obserwacje mikroskopowe itd. Dla identyfikacji gram-ujemnych niefermentujących bakterii najważniejszymi charakterystycznymi cechami są pigment, fluorescencja, wzrost w 42 0 C, hemoliza, wzrost na agarze MacConkeya, katalaza, ruchliwość, żelatyna, O/F test do zróżnicowania fermentujących bakterii. W przypadku niezidentyfikowania szczepu należy ww. procedurę powtórzyć lub zastosować dodatkowe kolejne testy. Uwaga: Podczas identyfikacji przy pomocy Książki kodów arkusz do zapisywania wyników umożliwia łatwe utworzenie tak zwanego profilu, tj. kodu numerycznego, który umożliwia wyszukanie wyniku identyfikacji w książce kodów. Procedura tworzenia profilu jest opisana w książce kodów. Usuwanie wykorzystanych materiałów: Po zużyciu, wszystkie ampułki, końcówki i paski należy wysterylizować w autoklawie lub spalić. Papierowe oraz tekturowe opakowania należy przekazać do recyklingu. Najczęstsze przyczyny niepowodzenia Zanieczyszczona kultura. identyfikacji: Zastosowano inokulum o niewielkiej gęstości lub w małej ilości.
Inokulum zanieczyściło sąsiadujące paski. Odpowiednie próby nie zostały pokryte warstwą oleju parafinowego. Reagent wkroplono do sąsiedniego wgłębienia. Nieprzestrzeganie kolejnych etapów zalecanej procedury. Brak danych dla niektórych gatunków lub szczepów w Tabeli identyfikacyjnej lub Książce kodów. Właściwości zestawu: Zestaw został przetestowany z pomocą 78 szczepów. 76 % zidentyfikowano prawidłowo 5 % gatunków nie znajduje się w bazie danych 19 % nie zidentyfikowano, były to jednak mało klinicznie istotne szczepy Kontrola jakości : Jakość chemikaliów stosowanych do produkcji płytek sprawdzana jest przy użyciu standardowego sposobu testowania. Wyprodukowane partie płytek sprawdzane są także za pomocą standardowych referencyjnych kultur bakteryjnych. Do pracy z płytkami w Państwa laboratorium zalecamy zastosowanie szczepów kontrolnych wymienionych w tabeli Szczepy kontrolne. Także w celach rutynowej diagnostyki zalecamy zastosowanie tych standardowych szczepów kontrolnych do sprawdzenia prawidłowości sposobu postępowania, przebiegu testów i wyrażenia reakcji barwnych. Użycie szczepów kontrolnych zalecane jest w przypadku każdej serii nieznanych szczepów, w przypadku każdej nowej serii zestawu oraz zgodnie z systemem walidacji laboratorium. Do kontroli funkcyjności zestawu niezbędne są świeże izolaty szczepów kontrolnych. Uwaga szczepy te służą wyłącznie do kontroli funkcyjności zestawu, nie służą do kontroli prawidłowości lub powodzenia identyfikacji! Pseudomonas aeruginosa CCM 1960 (ATCC 10145) Myroides odoratus CCM3296 (ATCC 4651) Burkholderia cepacia CCM 3919 Enterobacter sakazakii CCM 3461 Szczepy dostarczane są w liofilizowanych ampułkach przez Czech Collection of Microorganisms, Tvrdého 16, 602 00 Brno, Republika Czeska, tel. (+420-5) 49 49 14 30, fax. (+420-5) 43 24 73 39, e-mail: ccm@sci.muni.cz Szczepy kontrolne Rząd H G F E D C B A 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 Pseudomonas aeruginosa CCM 1960 IND ARG URE LYS GLU FRU INO SUC + + + + PHS bga bgl NAG MAN XYL CEL GAL s + + + NO 3 NO 2 ESL ggt LAC MLT TRE SCI + + + + Myroides odoratus CCM 3296 IND ARG URE LYS GLU FRU INO SUC + PHS bga bgl NAG MAN XYL CEL GAL + + NO 3 NO 2 ESL ggt LAC MLT TRE SCI + Burkholderia cepacia CCM 3919 IND ARG URE LYS GLU FRU INO SUC s + + + + s PHS bga bgl NAG MAN XYL CEL GAL s + s + + s + + NO 3 NO 2 ESL ggt LAC MLT TRE SCI + s + + + + + Enterobacter sakazakii CCM 3461 IND ARG URE LYS GLU FRU INO SUC + + + + s + PHS bga bgl NAG MAN XYL CEL GAL s + + + + + + + NO 3 NO 2 ESL ggt LAC MLT TRE SCI + + + s + + + + Objaśnienia: + = reakcja dodatnia = reakcja ujemna s = słaba reakcja
TABELA IDENTYFIKACYJNA v. 1.0 Rząd 1 Rząd 2 Rząd 3 H G F E D C B A H G F E D C B A H G F E D C B A Identyfikacja OXI IND ARG URE LYS GLU FRU INO SUC PHS bga bgl NAG MAN XYL CEL GAL NO3 NO2 ESL ggt LAC MLT TRE SCI ( ) + + + + d + + Acinetobacter calcoaceticus/a. baumannii complex ( ) d (+) d d d + Acinetobacter haemolyticus ( ) d d d Acinetobacter Iwoffii/A. johnsonii/a. junii d + + + ( ) d (+) + + + ( ) + ( ) + + + Pseudomonas oryzihabitans (+) ( ) + + + d + + + + + + (+) + ( ) + + + Pseudomonas luteola ( ) (+) d d ( ) + d + d ( ) ( ) d + + ( ) (+) + Stenotrophomonas maltophilia d + ( ) + ( ) + d d d d d d + d ( ) + ( ) Burkholderia mallei (+) d (+) + + + (+) d (+) d + + + + + d d + + + + + Burkholderia cepacia (+) + + + d + + + + + + + + + + + ( ) Sphingomonas paucimobilis + + + + (+) + ( ) + + + (+) (+) + + (+) d + (+) (+) (+) ( ) Agrobacterium radiobacter + + + Alcaligenes faecalis subs. faecalis + + Alcaligenes faecalis type 2 + + + + Achromobacter piechaudii + + + d + Achromobacter xylosoxidans subsp. denitrificans + + + ( ) (+) (+) ( ) + Achromobacter xylosoxidans subsp. xylosoxidans + + + d ( ) ( ) Bergeyella zoohelcum + + + d + Bordetella bronchiseptica + ( ) + + Brevundimonas diminuta + (+) + ( ) ( ) (+) ( ) + d Brevundimonas vesicularis + d + + d + + + d + + + ( ) + Ralstonia pickettii + + d + + + d d + + (+) + + + ( ) + + + + + Burkholderia pseudomallei + ( ) + d + + + + Delftia acidovorans + ( ) d + + + Comamonas testosteroni + + (+) + ( ) ( ) ( ) (+) (+) Empedobacter brevis + + + (+) + + ( ) + (+) d + + (+) (+) (+) ( ) Chryseobacterium meningosepticum + + Moraxella nonliquefaciens + + + ( ) d (+) (+) Myroides sp. + d + + + + d d ( ) d (+) + (+) (+) + (+) ( ) (+) ( ) d d + Ochrobactrum anthropi
Rząd 1 Rząd 2 Rząd 3 H G F E D C B A H G F E D C B A H G F E D C B A Identyfikacja OXI IND ARG URE LYS GLU FRU INO SUC PHS bga bgl NAG MAN XYL CEL GAL NO3 NO2 ESL ggt LAC MLT TRE SCI + + d + + + Oligella ureolytica + + + d Oligella urethralis + + (+) + + (+) (+) + (+) + + + ( ) + Pseudomonas aeruginosa + ( ) (+) + Pseudomonas alcaligenes + + d + + d d + + + ( ) ( ) (+) ( ) (+) + Pseudomonas fluorescens + + d + + d + + + + d + Pseudomonas mendocina + d ( ) + + ( ) ( ) Pseudomonas pseudoalcaligenes + + ( ) + + + + + ( ) + Pseudomonas putida + ( ) ( ) + (+) d + d + + (+) (+) (+) Pseudomonas stutzeri + ( ) (+) d + + + d d + ( ) ( ) Shewanella putrefaciens + d + + + + + + + + d + d + d + + + Flavobacterium mizutaii + + + + + + + + + + + + + + + + Sphingobacterium multivorum + + + + + + + + + + + + + + + + + Sphingobacterium spiritivorum + + + + + + + + + + + + + + ( ) + + + Sphingobacterium thalpophilum + + + d d d Weeksella virosa + + + + + + + + + + (+) + + + + (+) + + ( ) Aeromonas caviae + + + + + ( ) + + + + + + + + (+) + + Aeromonas hydrophila + + + + + + + + + d + + ( ) + + + d Aeromonas sobria + + (+) (+) + + + + + + ( ) d + + Plesiomonas shigelloides + + ( ) + + + + + + ( ) + + (+) + (+) Vibrio alginolyticus + (+) + + + + d + + + d + + + ( ) + + + (+) Vibrio fluvialis/furnissili + + (+) d ( ) d d + (+) + ( ) d ( ) Vibrio hollisae + + (+) + d + d + d + + + + d d + + + Vibrio cholerae + + d + + ( ) + + + (+) + + + ( ) + + (+) Vibrio mimicus + + ( ) d + + (+) + + + + + d + + Vibrio parahaemolyticus + + ( ) + + d (+) + + d + + + + (+) d + + ( ) Vibrio vulnificus Objaśnenia: + = reakcja dodatnia (+) = reakcja większości ujemna = reakcja w większości dodatnia ( ) = reakcja ujemna d = reakcja zmienna
Kolumna Test Skrót Rząd 1 Rząd 2 Rząd 3 Interpretacja reakcji dodatnia Reakcja ujemna H Indol IND czerwona, różowa żółtawa G Arginina ARG niebieska, niebisko-fioletowa Zielona, niebiesko-zielona F Ureaza URE Czerwona, czerwono-pomarańczowa Żółta, blado-pomarańczowa E Lizyna LYS Niebieska Żółto-zielona, zielona, zielono-niebieska D Glukoza GLU Żółta, żółto-brązowa Fioletowa, brązowo-fioletowa C Fruktoza FRU Żółta, żółto-brązowa Fioletowa, brązowo-fioletowa B Inozytol INO Żółta, żółto-brązowa Fioletowa, brązowo-fioletowa A Sacharoza SUC Żółta, żółto-brązowa Fioletowa, brązowo-fioletowa H Fosfataza PHS Czerwono-fioletowa, czerwona Bezbarwna, różowa G β-galaktozydaza bga żółta bezbarwna F β-glukozydaza bgl żółta bezbarwna E N-acetyl-β-D-glukozaminidaza NAG żółta bezbarwna D Mannitol MAN żółta, żółto-brązowa Fioletowa, brązowo-fioletowa C Ksyloza XYL żółta, żółto-brązowa Fioletowa, brązowo-fioletowa B Cellobioza CEL żółta, żółto-brązowa Fioletowa, brązowo-fioletowa A Galaktoza GAL żółta, żółto-brązowa Fioletowa, brązowo-fioletowa H Azotany NO 3 Ciemno-czerwona, czerwona Bezbarwna, blado-różowa + Zn: (Bezbarwna, blado różowa:+ Zn) Czerwona, różowa G Azotyny NO 2 Bezbarwna, blado-różowa Czerwona, różowa F Eskulina ESL Czarna, ciemno-brązowa Bezbarwna, blado-brązowa E γ-glutamyltransferaza ggt żółta Bezbarwna, blado-żółta D Laktoza LAC żółta, żółto-brązowa Fioletowa, brązowo-fioletowa C Maltoza MLT żółta, żółto-brązowa Fioletowa, brązowo-fioletowa B Trehaloza TRE żółta, żółto-brązowa Fioletowa, brązowo-fioletowa A Cytrynian Simmonsa SCI Niebieska, niebiesko-zielona Żółto-zielona, zielona, zielono-niebieska PRODUCENT: PLIVA-Lachema Diagnostika s.r.o., Karásek 1, 621 33 BRNO, REPUBLIKA CZESKA Przedstawicielstwo w Polsce: Ul. Szamocińska 21, 61-417 Poznań, tel. kom: +48 510 251 115 fax: +48 61 830 76 53, e-mail: tvrdon@lachema.com, www.lachema.com
Uwagi: 1. Zmiany w klasyfikacji Gram-ujemnych bakterii niefermentujących: Bergeyella zoohelcum poprzednio Weeksella zoohelcum Brevundimonas diminuta poprzednio Pseudomonas diminuta Brevundimonas vesicularis poprzednio Pseudomonas vesicularis Burkholderia cepacia poprzednio Pseudomonas cepacia Burkholderia mallei poprzednio Pseudomonas mallei Burkholderia pickettii poprzednio Pseudomonas pickettii Burkholderia pseudomallei poprzednio Pseudomonas pseudomallei Empedobacter brevis poprzednio Flavobacterium breve Chryseobacterium IIb poprzednio Flavobacterium IIb (Ch. indologenes, Ch. gleum) (F. indologenes, F. gleum) Chryseobacterium meningosepticum poprzednio Flavobacterium meningosepticum Myroides sp. poprzednio Flavobacterium odoratum Sphingomonas paucimobilis poprzednio Pseudomonas paucimobilis Stenotrophomonas maltophilia poprzednio Xanthomonas maltophilia 2. Do odróżnienia Gram-ujemnych bakterii niefermentujących od Gram-ujemnych pałeczek fermentujących zaleca się wykonanie próby O/F. 3. Rodzaj Acinetobacter: kompleks Acinetobacter calcoaceticus / A. baumanii: większość izolatów klinicznych należy do gatunku A. baumanii. Acinetobacter lwoffii / A. johnsonii / A. junii: większość izolatów klinicznych należy do gatunku A. lwoffii. Acinetobacter haemolyticus: większość izolatów klinicznych należących do rodzaju Acinetobacter i wykazujących aktywność hemolityczną należy do gatunku A. haemolyticus. Dla odróżnienia należy zastosować próby wymienione w poniższej tabeli (ewent. zamiast testów wzrostowych w 41 C i 44 C, zastosować temp. 42 o ). Odróżnianie gatunków należących do rodzaju Acinetobacter, spotykanych w materiale klinicznym: 37 C 41 C 44 C HEM GEL GLU A. baumannii + + + + A. calcoaceticus + + A. haemolyticus + + + d A. johnsonii A. junii + + A. lwoffii + HEM GEL GLU hemoliza żelatyna zakwaszanie glukozy (pożywka O/F) (von Graevenitz, A. 1995: Acinetobacter, Alcaligenes, Moraxella, and Other Nonfermentative Gram-Negative Bacteria, pp. 520. In: Murray, P.R. et al. (Ed. by), Manual of Clinical Microbiology, ASM, Washington, D.C.) Ochrona zdrowia: Składniki zestawu nie zawierają substancji niebezpiecznych Symboly na opakowaniu: wg ISO 15223 Data ostatniej rewizji: 19. 3. 2010