Elektroforeza kwasów nukleinowych
Elektroforeza jest podstawową techniką wizualizacji kwasów nukleinowych pozwala bezpośrednio identyfikować cząsteczki DNA i jest stosunkowo czuła (po odpowiednim wybarwieniu żelu jesteśmy w stanie zobaczyć ng DNA) jest techniką rozdzielania fragmentów DNA według ich wielkości pozwala na określenie wielkości cząsteczek przez porównanie drogi migracji z fragmentami o znanej wielkości (tzw. markerów) jest techniką oczyszczania DNA techniki elektroforetyczne w swoich podstawowych wersjach są proste, szybkie i stosunkowo tanie
Podział technik elektroforezy DNA Agarozowa (horyzontalna) -w stałym polu elektrycznym -w zmiennym polu (PFGE) Akrylamidowa (wertykalna) -denaturująca -niedenaturująca elektroforezę w żelu agarozowym stosuje się do rozdzielania dużych cząsteczek DNA. elektroforezę w żelu poliakrylamidowym stosuje się do rozdzielania małych fragmentów DNA. Elektroforeza dna w żelu agarozowym w stałym polu elektrycznym jest rutynową techniką wizualizacji DNA i RNA
Funkcjonuje na zasadzie sita molekularnego, gdzie negatywnie naładowane cząsteczki poruszają się w polu elektrycznym w kierunku anody; krótsze wędrują szybciej, dłuższe wolniej Fragmenty DNA Cząsteczki żelu Pory
Elektroforeza agarozowa Agaroza jest naturalnym polimerem izolowanym z krasnorostów Zalety elektroforezy agarozowej duży zakres rozdzielanych fragmentów DNA od kilkuset pz do 40 kpz (w elektroforezie w stałym polu) i Mpz (w zmiennym polu elektrycznym) łatwość przygotowania żelu i elektroforezy jest nietoksyczna Wady mała zdolność rozdzielcza żeli agarozowych agaroza jest stosunkowo droga
Przebieg elektroforezy Przygotowanie próbek Roztwór DNA miesza się z buforem próbkowym, który zagęszcza DNA (nie wypływa ze studzienek) pozwala obserwować migrację DNA
Barwienie żeli agarozowych Bromek etydyny (EB) jest używany najczęściej, lecz jest silnie mutagenny. Należy unikać barwienia żeli przed elektroforezą (tzn. barwnik dodany do agarozy lub do buforu). Daje dość silne tło i żele powinno się odbarwiać przed archiwizacją. SYBR Green, SYBR Gold bardzo czuły, nieszkodliwy, degraduje w lekko alkalicznych warunkach, WADA!!! - drogi. Porównanie czułości barwników Gel Red i EB
Czynniki wpływające na stopień migracji DNA w żelu agarozowym Wielkość cząsteczki - dsdna liniowe migruje w żelu z szybkością odwrotnie proporcjonalną do ilości par zasad (odwrotnie proporcjonalna do log 10 z masy cząsteczkowej)
Konformacja DNA - superzwinięta kolista forma (CCC), otwarto kolista (OC) i liniowa (LIN) forma migrują w żelu z różną szybkością. Względna ruchliwość tych form zależy od stęż. agarozy, natężenia prądu, siły jonowej buforu i gęstości superskrętów formy CCC. Najlepiej dla odróżnienia form stosować odpowiednie markery (zwykle plazmidy i fragmenty DNA). Forma OC Forma CCC Forma LIN
Nie można określić wielkości kolistej cząsteczki DNA porównując jej drogę migracji z liniowym DNA o znanej wielkości!!!
Stężenie agarozy jest liniowa zależność między logarytmem mobilności elektroforetycznej DNA ( ) i stężeniem żelu ( ) wg. równania: log = log o K r gdzie o jest swobodną ruchliwością DNA i K r jest współczynnikiem opóźnienia, czyli stałą związaną z własnościami żelu oraz wielkością i kształtem cząsteczek. Agarose gel, % Range of separation, bp Polyacrylamid e gel, % Elektroforeza DNA w żelach o różnym stęż. agarozy Range of separation, bp 0.5 1,000-30,000 3.5 100-1,000 0.7 800-12,000 5.0 80-500 1.0 500-10,000 8.0 60-400 1.2 400-7,000 12.0 40-200 1.4 200-4,000 20.0 5-100 2.0 50-2,000
Obecność bromku etydyny w żelu i buforze. Interkalacja bromku etydyny powoduje spadek ładunku negatywnego w dsdna i wzrost sztywności i długości DNA. Stopień migracji jest opóźniony o około 15%. Napięcie prądu w niskim napięciu, stopień migracji liniowych fragmentów DNA jest proporcjonalny do zaaplikowanego napięcia. W wyższym napięciu mobilność wysoko-cząsteczkowych fragmentów nie jest proporcjonalna do napięcia. Skład buforu do elektroforezy w roztworach o niskiej sile jonowej DNA migruje wolno, w buforach o zbyt wysokiej sile jonowej przepływ ładunku powoduje wydzielanie się ciepła co może prowadzić do rozpuszczenia żelu i denaturacji DNA
Markery wielkości Konwencjonalne oparte na DNA plazmidów i fagów
Tzw. drabinki (ladders)
Izolacja DNA z żeli agarozowych. - zestawy do izolacji DNA z żelu oferowane przez firmy np. perełki szklane. DNA jest adsorbowane na silikonowych perełkach z rozpuszczonej agarozy w wysokim stęż. soli, a eluowane w niskim stęż. soli. - -można też używać agarozy, która topi się i tężeje w niższej niż standardowa temperaturze (LMP low melting point). Agaroza, która została zmodyfikowana przez hydroksymetylację, która redukuje - ilość wiązań wodorowych, ma niższą temp. topnienia i żelowania i zależy to od stopnia substytucji. W temp. 30-35 C agaroza jest płynna i można prowadzić reakcje enzymatyczne jak restrykcję czy ligację, ale wydajność tych reakcji jest mniejsza. Z takiej agarozy można odzyskiwać DNA z większą łatwością przez ekstrakcję mieszaniną fenol-chloroform, lub z perełkami szklanym. Metoda jest wydajna dla fragmentów rzędu 0.5-5 kb.
Elektroforeza pulsacyjna - PFGE (Pulsed- Field Gel Electrophoresis) Fragmenty dsdna powyżej krytycznej wielkości ~40 kb migrują w żelu agarozowym ze stałą szybkością, niezależną od wielkości. Z tego powodu nie można ich rozdzielić w stałym prądzie na horyzontalnych żelach. PFGE jest elektroforezą, w której pole elektryczne jest okresowo zmieniane, co pozwala na rozdział cząsteczek DNA do wlk. rzędu Mpz. Rozdział następuje ponieważ czas wymagany do zmiany kierunku migracji dla cząsteczki DNA zależy od jej wielkości w zmiennym polu elektrycznym. Krótsze cząsteczki mogą szybciej reorientować się (tzn. zmieniać konformację i powracać do stanu pierwotnego) niż dłuższe i dlatego wędrują w żelu z większą szybkością. Dłuższe cząsteczki większość czasu potrzebują na reorientację w zmieniającym się napięciu pola, niż na migrację. Różnica w czasie reorientacji jest tym czynnikiem, który decyduje o rozdzielaniu się fragmentów DNA o wlk. powyżej 40 kb.
CHEF Cantour-Clamped Homogenous Electric Field Electrophoresis Elektroforeza w zmiennym, homogennym polu elektrycznym o kształcie sześciokąta foremnego Elektrody ułożone są w kształcie sześciokąta foremnego daje to jednorodne pole elektryczne o kącie reorientacji 120 o. DNA migruje w prostych torach rozdziału.
Przygotowanie próbek PFGE wymaga nieuszkodzonego DNA ponieważ każde uszkodzenie spowoduje zmianę wyglądu prążków. Najpierw umieszcza się bakterie lub inne komórki w agarozie, a następnie trawi się je enzymami litycznymi, co nie narusza DNA. DNA następnie można trawić enzymami restrykcyjnymi. Tak przygotowany preparat jest przycinany do odpowiedniej wielkości, wkładany do wejścia w żelu agarozowym i zaklejany agarozą. Enzymy restrykcyjne w PFGE Wybiera się enzymy, które: - tną DNA rzadko np. rozpoznają 8-nukleotydowe sekwencje, -w rozpoznawanej sekwencji mają dużo par GC ( jest rzadko spotykany u Eukaryota -w rozpoznawanej sekwencji mają dużo par AT (mogą być rzadsze u Prokaryota -Typu homing (kodowane przez introny) -muszą być bardzo czyste i w wysokiej specyficznej aktywności (bez zanieczyszczeń nukleazami).
Markerami w PFGE są albo konkatemery DNA faga (50 kb), albo chromosomy S. cerevisiae (200-2000 kb), Schizosaccharomyces pombe (trzy chromosomy, 3.5; 4.6; 5.7 Mb) lub inne znane genomy.
Zastosowanie PFGE - rozdzielanie cząsteczek DNA w zakresie 50 kpz 10 Mpz Izolowane fragmenty mogą być użyte do klonowania; - konstruowanie map restrykcyjnych całych genomów bakterii oraz dużych regionów genomów eukariotycznych; - identyfikacja genomów w tzw. epidemiologii molekularnej
Elektroforeza w żelu poliakrylamidowym Polimer akrylamidu może służyć do rozdziału dsdna i ssdna według wielkości i konformacji. Żele poliakrylamidowe mają trzy główne cechy korzystniejsze niż żele agarozowe: - ich zdolność rozdzielcza jest tak duża, że mogą rozdzielać cząsteczki różniące się długością równą 0.1% (tzn. 1 bp w 1000 bp); - można rozdzielać większe ilości DNA można rozdzielać do 10 µg DNA w jednej ścieżce (1 cm x 1 mm) bez utraty zdolności rozdzielczej; - DNA odzyskane z żelu akrylamidowego jest bardzo czyste (metodami podobnymi do odzyskiwania z agarozy ) i można go używać np. do iniekcji zarodków mysich).
Zdolność rozdzielcza zależy od wielkości porów jakie tworzy polimer, a to zależy od stężenia akrylamidu i N,N -metylenbisakrylamidu oraz od szeregu innych czynników jak natężenie prądu czy grubość żelu. Zakres stężenia akrylamidu to 3.5% - 20%, w którym dzieli się fragmenty 6-2000 pz. Stosunek bisakrylamidu do akrylamidu wynosi zwykle 1:30 Żele akrylamidowe nie mogą być barwione przed elektroforezą, ponieważ bromek etydyny hamuje polimeryzację akrylamidu, ale barwią się po elektroforezie, lecz z mniejszą efektywnością niż agaroza. Do barwienia DNA w tych żelach można używać także innych barwników jak SYBR.
Rodzaje żeli akrylamidowych w elektroforezie DNA: Żele denaturujące służą do rozdzielania i oczyszczania ssdna lub RNA. Te żele są polimeryzowane w obecności mocznika, formamidu lub formaldehydem co hamuje tworzenie par w DNA. Zdenaturowany DNA migruje w tych żelach z szybkością niezależną od składu zasad i ich sekwencji. Stosuje się m.in. do rozdziału RNA, izolacji radioaktywnych sond i do rozdziału produktów reakcji sekwencyjnych. Żele niedenaturujące są używane do rozdziału i oczyszczania dsdna. Zasadniczo dsdna migruje w żelach z szybkością odwrotnie proporcjonalną do log 10 z ich wielkości. Jednakże szybkość migracji zależy też od składu zasad i fragmenty tej samej wielkości mogą migrować z szybkością różniącą się nawet o 10%. Zwykle służą do preparowania bardzo czystego DNA i do wykrywania interakcji DNA-białko (EMSA - Gel Shift Assay).