NOVA Gel Sm/RNP S 708410 Do diagnostyki in vitro Przeznaczenie Test NOVA Gel TM Sm/RNP jest systemem testu podwójnej dyfuzji do badań przesiewowych oraz półilościowego oznaczania autoprzeciwciał przeciwko Sm/RNP, ekstrahowalnemu antygenowi jądrowemu (ENA) w surowicy ludzkiej. Obecność przeciwciał przeciwko Sm/RNP może być stosowana w połączeniu z objawami klinicznymi i innymi badaniami serologicznymi, aby wspomóc diagnostykę tocznia rumieniowatego układowego (SLE) i innych powiązanych chorób tkanki łącznej. Podsumowanie i wyjaśnienie testu Pojęcie przeciwciała przeciwjądrowe (ANA) opisuje różnorodne przeciwciała, które wchodzą w reakcję ze składnikami jąder komórkowych, w tym z DNA, RNA oraz wieloma białkami i rybonukleoproteinami. 1 Te przeciwciała często występują u pacjentów z chorobami tkanki łącznej lub reumatycznymi, szczególnie SLE. Praktycznie wszyscy pacjenci SLE są ANA-pozytywni. Ta czułość diagnostyczna doprowadziła do włączenia testowania ANA do Poprawionych kryteriów z 1982 r. klasyfikacji toczenia rumieniowatego układowego przez podkomisję Stowarzyszenia Zapalenia Stawów i Reumatyzmu. 2 Pomimo tego, że badanie ANA jest doskonałym badaniem przesiewowym dla SLE (wynik negatywny praktycznie wyklucza aktywne SLE 3 ), w żadnym wypadku nie jest to badanie swoiste. Obecnym trendem w diagnozowaniu i leczeniu chorób tkanki łącznej jest łączenie wrażliwych testów przesiewowych ANA z bardziej swoistymi testami uzupełniającymi, takimi jak dsdna i/lub ENA. Testy ENA są szczególnie ważne, ponieważ dostarczają one informacje diagnostyczne i prognozowe. Autoprzeciwciała przeciwko antygenowi Sm są wysoce swoiste wobec SLE i, podobnie jak przeciwciała przeciwko dsdna, uznawane za przeciwciała markerowe. Autoprzeciwciała przeciwko Sm zostały włączone przez kryteria podkomisji Stowarzyszenia Zapalenia Stawów i Reumatyzmu do klasyfikacji SLE. 2 Autoprzeciwciała przeciwko RNP występują u pacjentów z SLE a także w przypadku innych chorób tkanki łącznej. 1,2,4 Autoprzeciwciała przeciwko RNP wiążą się ze względnie łagodnym przebiegiem choroby z niższą częstością występowania choroby nerek, natomiast pacjenci z przeciwciałami przeciwko Sm mają wyższą częstość występowania choroby nerek oraz zajęcia ośrodkowego układu nerwowego. 5 7 Zasada badania Test podwójnej dyfuzji, opisany przez Ouchterlony, 8 obejmuje wykorzystanie roztworu antygenu, który pasywnie przechodzi przez żelowe podłoże podtrzymujące w kierunku próbki pobranej od pacjenta i/lub przeciwciała zawierającego kontrolę. Specjalnie wyprofilowane dołki umieszczone w podłożu żelowym, pełnią funkcję zasobników, z których roztwory antygenu i przeciwciała przedostają się do siebie. W punkcie zrównoważenia antygenu i przeciwciała, w żelu tworzy się widoczna linia precypityny. Następnie można określić stan immunologiczny pacjenta, poprzez obserwowanie wzorów sąsiednich linii precypityny, formujących się w żelu, przy użyciu próbki kontrolnej znanej swoistości i nieznanej surowicy pacjenta. Technika podwójnej dyfuzji może być użyta z oczyszczonym preparatem Sm/RNP, znaną próbką kontrolną autoprzeciwciał Sm lub RNP oraz próbką pacjenta, która przypuszczalnie zawiera autoprzeciwciała Sm i/lub RNP, aby wykazać immunologiczną identyfikację, brak identyfikacji lub identyfikację częściową. Potwierdzenie aktywności autoprzeciwciał Sm i/lub RNP w surowicy pacjenta może zostać dokonane, jeżeli linia precypityny charakterystycznie łączy się z linią utworzoną przez znaną próbkę kontrolną. 1
Prawidłowa procedura testowania podwójnej dyfuzji wymaga badania wielu proporcji stężenia antygen przeciwciało, aby nie dopuścić do uzyskania nadmiaru antygenu lub przeciwciała. Nieprawidłowe lub mylne utworzenie linii precypityny może wystąpić w przypadku nadmiaru antygenu lub przeciwciał. Aby tego uniknąć, roztwory surowicy pacjenta powinny być badane wraz z tym samym preparatem antygenu. Płytki NOVA Gel S opracowano w celu łatwego spełnienia tego wymogu. Duże dołki sześciokątne mają takie rozmiary, aby pomieścić rozcieńczenie 1:1 (lub czyste stężenie) surowicy pacjenta lub kontroli. Małe dołki prostokątne dzięki swej budowie automatycznie dają w przybliżeniu rozcieńczenie 1:4 czystej próbki pacjenta. Odczynniki 1. Płytki żelowe NOVA Gel S do badań przesiewowych zawierające po 7 dołków ze stabilizatorami i 0,09% azydkiem sodu 2. 0,4 ml antygenu Sm/RNP (z grasicy cieląt), liofilizowane w buforze zawierającym stabilizatory i 0,09% azydek sodu 3. 0,7 ml kontroli Sm, surowica ludzka zawierająca autoprzeciwciała przeciwko Sm w buforze zawierającym 0,09% azydek sodu 4. 0,7 ml kontroli RNP, surowica ludzka zawierająca autoprzeciwciała przeciwko RNP w buforze zawierającym 0,09% azydek sodu Ostrzeżenia 1. Wszystkie materiały pochodzenia ludzkiego używane w przygotowywaniu kontroli dla tego produktu zostały przetestowane i na podstawie metod zatwierdzonych przez FDA stwierdzono że nie zawierają przeciwciał przeciwko HIV, HBsAg i HCV. Jednak żadna metoda testowania nie może całkowicie zagwarantować braku obecności HIV, HBV, HCV lub innych czynników zakaźnych. W związku z tym kontrola Sm i kontrola RNP powinny być obsługiwane w taki sam sposób jak materiał potencjalnie zakaźny. 9 2. Jako konserwant stosowany jest azydek sodu. Azydek sodu jest trucizną i może być toksyczny w przypadku połknięcia lub wchłonięcia przez skórę lub oczy. Azydek sodu może wchodzić w reakcję z ołowianą lub miedzianą instalacją wodociągową, tworząc potencjalnie wybuchowe azydki metali. Jeśli do usuwania odczynników używane są zlewy, należy przepłukiwać je dużą ilością wody, aby nie dopuścić do gromadzenia się azydku. 3. Podczas pracy z dostarczonymi odczynnikami należy stosować odpowiednie środki ochrony osobistej. 4. Rozlane odczynniki należy natychmiast usunąć. Należy przestrzegać wszystkich krajowych i lokalnych przepisów w zakresie utylizacji odpadów. Środki ostrożności 1. Ten produkt jest przeznaczony do zastosowań diagnostycznych in vitro. 2. Zastąpienie składników dostarczonych w tym systemie innymi składnikami może skutkować osiągnięciem niespójnych wyników. 3. Do uwadniania antygenu zalecane jest używanie wody destylowanej lub dejonizowanej. 4. Na wyniki analizy wpływa wiele różnych czynników. Obejmuje to temperaturę początkową odczynników, zapobieganie wylewaniu się odczynników lub próbek otrzymanych od pacjenta z dołków oraz jakość wody stosowanej do uwadniania antygenu. Uzyskanie dokładnych i powtarzalnych wyników wymaga staranności i precyzji. 5. Zalecane jest ścisłe przestrzeganie procedury testowej. 2
Warunki przechowywania Wszystkie zestawy odczynników przechowywać w temperaturze 2 8 C. Nie zamrażać. Odczynniki są trwałe do daty ważności, pod warunkiem, że są przechowywane i używane zgodnie z instrukcjami. Po rozpuszczeniu antygen jest stabilny przez 2 tygodnie w temperaturze 2 8 C. W razie potrzeby można przygotować 100μL próbek, które należy przechować w temperaturze < -70 o C. Przechowywany w ten sposób antygen jest stabilny przez przynajmniej 1 rok. Pobieranie próbek Ta procedura powinna być wykonana z próbką surowicy. Dodanie azydku lub innych konserwantów do próbek analitycznych może mieć negatywny wpływ na wyniki. Nie używać próbek zawierających widoczne zanieczyszczenia, skażonych bakteryjnie lub podgrzanych. Należy unikać całkowicie zhemolizowanej lub lipemicznej surowicy albo próbek. Po pobraniu surowica powinna być oddzielona od skrzepu. Dokument NCCLS H18-A2 zaleca następujące warunki przechowywania próbek: 1) Przechowywać próbki w temperaturze pokojowej nie dłużej niż 8 godzin. 2) Jeżeli badanie nie zostanie przeprowadzone w ciągu 8 godzin, próbki należy umieścić w lodówce, w temperaturze 2 8 C. 3) Jeżeli badanie nie zostanie przeprowadzone w ciągu 48 godzin lub próbka ma zostać wysłana, należy ją zamrozić w temperaturze -20 C lub niższej. Zamrożone próbki po rozmrożeniu i przed badaniem muszą zostać dobrze wymieszane. Badanie Dostarczone materiały 8 płytki NOVA Gel S do badań przesiewowych z wstępnie umieszczonymi dołkami 2 0,4 ml antygenu Sm/RNP, liofilizowanego 1 0,7 ml kontroli Sm 1 0,7 ml kontroli RNP Wymagane materiały nie dołączone do zestawu Mikropipety o pojemności 15 100µLobjętość Jednorazowe końcówki mikropipet 0,85% sól fizjologiczna Woda destylowana lub dejonizowana (najlepiej jałowa) Źródło światła lub pudełko do podglądu żelu Sposób przygotowania 1. Rozpuścić antygen Sm/RNP Ostrożnie otworzyć fiolkę z antygenem i dodać 0,4 ml destylowanej lub dejonizowanej wody do liofilizatu antygenu. W celu uzyskania optymalnych wyników zalecane jest używanie jałowej wody destylowanej lub dejonizowanej. Pozostawić uwodniony antygen na 5 minut, a następnie dobrze wywirować przed użyciem. 2. Napełnianie płytki żelowej Napełnić płytki żelowe antygenem i kontrolami (około 80µL na duży dołek) zgodnie z ilustracją poniżej. Każda próbka pacjenta powinna być umieszczona zarówno w większym dołku sześciokątnym (około 80 µl) oraz w mniejszym dołku prostokątnym (około 20μL) zgodnie z ilustracją. Ścisłe objętości nie są istotne, ale NIE NALEŻY PRZEPEŁNIAĆ DOŁKÓW. Dołki kontrolne mogą być napełniane bezpośrednio z plastikowych gruszek laboratoryjnych lub mikropipet. W przypadku używania gruszek laboratoryjnych należy umieścić końcówkę dozownika w dołku i delikatnie ścisnąć, aby poziom płynu zbliżył się do górnej krawędzi dołka. Przykryć płytkę natychmiast po napełnieniu. 3
Uwaga: Mniejsza objętość dołka prostokątnego redukuje lokalne stężenie przeciwciał pacjenta NIE WYMAGAJĄC FAKTYCZNEGO ETAPU ROZCIEŃCZANIA PRÓBKI. Rozcieńczenie wyjściowe mniejszego dołka to około 1:4. Zmniejsza to prawdopodobieństwo uzyskania wyniku fałszywie negatywnego z powodu nadmiaru przeciwciał. 3. Inkubacja Pozostawić przykryte płytki do inkubacji w temperaturze pokojowej na stabilnej płaskiej powierzchni na 24 godziny. Sprawdzić płytki i zwrócić uwagę na linie precypityny, które powstają pomiędzy próbką od pacjenta a antygenem. Sprawdzić powiązanie tej linii z linią precypityny jednej z kontroli. Ponownie sprawdzić płytki po 48 godzinach, aby przed końcową interpretacją wyników ustalić, czy powstały nowe linie. Kontrola jakości Kontrole Sm i RNP powinny być oznaczane dla każdej płytki, aby upewnić się, że wszystkie odczynniki i procedury działają prawidłowo. Dodatkowe odpowiednie surowice kontrolne można przygotować dzieląc połączone próbki surowicy ludzkiej i przechowując je w temperaturze < -70 o C. Aby wyniki badania mogły być uznane jako ważne, między dołkami kontroli Sm i RNP oraz antygenów Sm/RNP musi być widoczna linia precypityny. Interpretacja wyników W celu uzyskania optymalnej analizy linii precypityny zalecane jest zastosowanie poniższej procedury: 1. Zdjąć pokrywę płytki. 2. Przytrzymać płytkę w takiej pozycji, aby maksymalnie ograniczyć odbicie powierzchni żelu. 3. Podświetlić płytkę żelową z boku (np. równolegle do powierzchni żelu). Uwaga: Należy zwrócić uwagę, aby źródło światła było zasłonięte przed bezpośrednim widokiem. 4. Linie precypityny są najlepiej widoczne, gdy są umieszczone na ciemnym tle i oglądane pod kątem. 5. Szkło powiększające może pomóc w obserwacji mniej widocznych linii lub w celu rozróżniania niezidentyfikowanych próbek. Reakcja negatywna. Próbka jest traktowana jako negatywna, jeśli po 48 godzinach nie ma żadnych widocznych linii precypityny pomiędzy dołkami pacjenta oraz dołkami antygenu. Interpretacja swoistości. W przypadku podwójnej dyfuzji swoistość jest określana poprzez porównanie relacji linii precypityny próbki z liniami znanej kontroli. W przypadku testu NOVA Gel Sm/RNP mogą wystąpić następujące możliwości: 4
Rys. 1: Brak identyfikacji Rys. 2: Identyfikacja Sm Rys. 3: Identyfikacja Sm i RNP Linia precypityny pacjenta 1 krzyżuje się lub wykazuje brak identyfikacji z kontrolami Sm oraz RNP. Wskazuje to, że pacjent reaguje z antygenem ENA inaczej niż z Sm lub RNP. Linia precypityny pacjenta 1 łączy się lub wykazuje identyfikację z linią kontroli Sm. W takim przypadku pacjent ma autoprzeciwciała przeciwko Sm. Patrz punkt Ograniczenia badania, numer 5. Pacjent 1 ma dwie linie precypityny. Jedna linia wykazuje identyfikację z kontrolą Sm, a druga z kontrolą RNP. Ten pacjent ma autoprzeciwciała przeciwko Sm oraz RNP. Ograniczenia badania 1. Wiele linii precypityny utrudnia interpretację wyniku. W takich przypadkach zaleca się ponowne zbadanie próbki przy rozcieńczeniu 1:2 lub 1:4 w soli fizjologicznej, umieszczając każde rozcieńczenie zarówno w dołku sześciokątnym oraz mniejszym prostokątnym. Daje to w mniejszym dołku prostokątnym odpowiednio rozcieńczenia 1:8 lub 1:16. Rozcieńczenie próbki może wyeliminować słabsze linie lub je rozproszyć, dzięki czemu interpretacja jest łatwiejsza. 2. Inną możliwością jest efekt prozone, chociaż jest on mało prawdopodobny dzięki unikalnej geometrii dołka. Efekt prozone zachodzi, gdy występuje przytłaczająca ilość autoprzeciwciał pacjenta w stosunku do antygenu (nadmiar przeciwciał), skutkiem czego linia precypityny powstaje przy krawędzi dołka antygenu. W takich przypadkach zaleca się ponowne zbadanie możliwych próbek pozytywnych przy rozcieńczeniu 1:2 lub 1:4 w soli fizjologicznej, aby zapobiec fałszywie negatywnej interpretacji testu. 3. Jeśli do uwadniania antygenu używana jest niejałowa lub zanieczyszczona woda, antygen może wykazywać natychmiastową lub progresywną degradację. W takim przypadku może pojawić się bardzo delikatna linia precypityny lub może nie pojawić się w ogóle. 4. Kontrola Sm nie jest monoswoista i może zawierać nieco RNP. Kontrola Sm może wykazywać częściową identyfikację z pacjentem lub kontrolą RNP. 5. W przypadku surowicy wykazującej identyfikację z kontrolą Sm możliwe jest zaobserwowanie gniazda skierowanego w kierunku dołka kontroli RNP. Może to wskazywać na obecność autoprzeciwciał RNP w surowicy pacjenta anty-sm. 6. Wyniki tego badania powinny być użyte w powiązaniu z wynikami klinicznymi i innymi badaniami serologicznymi. 7. Charakterystyka wyników badania nie została ustanowiona dla podłoża innego niż surowica. 5
Spodziewane wartości Za pomocą testu podwójnej dyfuzji NOVA Gel Sm/RNP przebadano pacjentów z różnymi chorobami tkanki łącznej oraz 200 losowo wybranych krwiodawców. Wyniki znajdują się poniżej: Grupa pacjentów Numer Test NOVA Gel ENA na liczbę pozytywnych Sm pozytywni RNP pozytywni SLE 105 15 20 Toczeń polekowy 24 0 0 Reumatoidalne zapalenie stawów 40 0 0 Twardzina 24 0 1 Zapalenie skórno-mięśniowe 14 0 1 Zespół Sjogrena 14 0 1 Normalne 200 0 0 6
Piśmiennictwo 1. Tan E. Autoantibodies to nuclear antigens (ANA): Their immunobiology and medicine. Advances in Immunology 33:167-239, 1982. 2. Tan E, et. al. The 1982 Revised criteria for the classification of systemic lupus erythematosus. Arthritis and Rheumatism 25:1271-1277, 1982. 3. Casalo SP, Friou GJ, Myers LL. Significance of antibody to DNA in systemic lupus erythematosus. Arthritis and Rheumatism 7:379-390, 1964. 4. Reichlin M, Maddison PJ. Soluble tissue autoantigens which precipitate with sera of patients with connective tissue diseases. In Immunopathology of the Skin, 2nd ed. (EH Beutner, TP Chorzelski, SF Bean, eds) John Wiley and Sons, NY, pp 351-362, 1979. 5. Reichlin M, Mattioli M. Correlation of a precipitin reaction to an RNA protein antigen and a low prevalence of nephritis in patients with systemic lupus erythematosus. New England Journal of Medicine 286:908-911, 1972. 6. Barada FA, Andrews BS, Davis JS, Taylor RP. Antibodies to Sm in patients with systemic lupus erythematosus. Arthritis and Rheumatism 24:1236-1244, 1981. 7. Winn DM, Wolfe JF, Lindberg DA, Fristoe FH, Kingsland L, Sharp GC. Identification of a clinical subset of systemic lupus erythematosus by antibodies to the Sm antigen. Arthritis and Rheumatism 22:1334-1337, 1979. 8. Ouchterlony O: Diffusion-in-gel methods for immunological analysis. Prog Allergy 5:1, 1958. 9. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Centers for Disease Control and Prevention/National Institutes of Health, Fifth Edition, 2007.. NOVA Gel jest zastrzeżonym znakiem handlowym firmy INOVA Diagnostics, Inc. Copyright 2011. Wszelkie prawa zastrzeżone 7
Wyprodukowano przez: INOVA Diagnostics, Inc. 9900 Old Grove Road San Diego, CA 92131 Stany Zjednoczone Ameryki Pomoc techniczna (tylko na terenie Stanów Zjednoczonych i Kanady): 877-829-4745 Pomoc techniczna (poza terenem Stanów Zjednoczonych): 00+ 1 858-805-7950 support@inovadx.com Autoryzowani przedstawiciele na terenie Unii Europejskiej: Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D-66386 St. Ingbert, Niemcy Tel.: +49-6894-581020 Faks.: +49-6894-581021 www.mt-procons.com 628410POL Marzec 2011 Wersja 0 8