QUANTA Lite LKM-1 ELISA Do diagnostyki In Vitro Złożoność CLIA: Wysoka

Transkrypt

1 QUANTA Lite LKM-1 ELISA Do diagnostyki In Vitro Złożoność CLIA: Wysoka Przeznaczenie QUANTA Lite LKM-1 jest to immunoenzymatyczny test (ELISA) do półilościowego wykrywania przeciwciał LKM-1 w surowicy człowieka. Obecność przeciwciał LKM-1 można wykorzystać w powiązaniu z wynikami klinicznymi oraz innymi testami laboratoryjnymi w celu wsparcia diagnozy autoagresyjnego zapalenia wątroby typu 2. Podsumowanie i wyjaśnienie testu Autoagresyjne zapalenie wątroby (AIH) jest heterogeniczną chorobą o nieznanej etiologii. 1 Autoagresyjne zapalenie wątroby typu 1 (martwicze AIH) jest częściej spotykanym typem AIH i charakteryzuje się reakcyjnością wobec antygenów przeciwjądrowych (ANA), mięśnia gładkiego (SMA) oraz aktyny. Autoagresyjne zapalenie wątroby typu 2 ( A -2) I H charakteryzuje się obecnością przeciwciał mikrosomu (LKM- 1) wątroby/nerki, wykrywanych na skrawkach tkanki wątroby i nerki gryzoni za pomocą niebezpośredniej immunofluorescencji. Reakcyjność LKM-1 charakteryzuje się zabarwieniem cytoplazmy hepatocytu oraz proksymalnych (ale nie dystalnych) kanalików nerkowych. Pacjenci z chorobą AIH typu 2a to z reguły młode kobiety, z poważną chorobą, z niskim poziomem IgA, z dobrą odpowiedzią na terapię immunosupresyjną oraz z negatywnym wynikiem na wirusowe zapalenie wątroby C (HCV). 1,2 Główny docelowy antygen przeciwciał LKM-1 został zidentyfikowany jako cytochrom P450 2D6, mikrosomalne białko występujące w retikulum endoplazmatycznym. 3-6 Przeciwciała LKM-1 zostały stwierdzone u 8% pacjentów z przewlekłą infekcją HCV. 2,3,7-9 Epitopy uznawane przez surowicę od pacjentów z HCV różnią się od epitopów uznawanych przez AIH-2 i mogą być autoprzeciwciałami wytwarzanymi podczas występowania przewlekłej infekcji HCV, a nie prawdziwej choroby AIH typu 2. 6,7,10,11 Z reguły pacjenci z pozytywnym wynikiem wobec LKM-1 i HCV są starsi, częściej są to mężczyźni i najczęściej mają niższe poziomy przeciwciał LKM-1 niż pacjenci z AIH-2a. 1,2 Pacjenci, którzy mają wynik pozytywny na HVC i pozytywny na LKM-1 mogą stwarzać dla lekarza trudną sytuację, ponieważ leczenie HCV i AIH-2 bardzo się od siebie różni. 9,11,12 Oprócz przeciwciał LKM-1, zostały zidentyfikowane przeciwciała przeciwko cytochromowi P450 2C9 (LKM-2) powiązane z zapaleniem wątroby wywołanym kwasem tienylowym oraz przeciwciała przeciwko transferazie glukoronosylu urydynodwufosforanu (LKM-3), które zostały powiązane z infekcją zapalenia wątroby D. 3 Przeciwciała przeciwko rozpuszczalnemu antygenowi wątroby (SLA) lub antygenowi wątrobowo-trzustkowemu zostały stwierdzone i niektórych pacjentów AIH, którzy mają negatywny wynik i mogą opisać inną podgrupę AIH. 1 Zasada badania Częściowo oczyszczony rekombinat ludzkiego cytochromu, o pełnej długości, P450 2D6 antygen jest związany z dołkami polistyrenowej płytki mikrodołków pod warunkami, że zachowa antygen w jego natywnym stanie. Wstępnie rozcieńczone kontrole oraz surowice pacjentów są dodawane do oddzielnych dołków umożliwiając związanie wszelkich występujących przeciwciał przeciwko LKM-1 z unieruchomionym antygenem. Niezwiązana próbka jest wypłukiwana i do każdego dołka dodawany jest koniugat znakowanego enzymem przeciwciała przeciw-ludzkiego IgG. Druga inkubacja umożliwia przeciwciałom przeciw-ludzkim IgG znakowanym enzymem związać się z dowolnymi przeciwciałami pacjenta, które zostały przytwierdzone do mikrodołków. Po wypłukaniu wszelkich niezwiązanych przeciwciał przeciw-ludzkich IgG znakowanych enzymem, aktywność pozostałego enzymu bada się dodając substrat chromogeniczny i mierząc intensywność powstałej barwy. Badanie może zostać ocenione spektrofotometrycznie, poprzez zmierzenie i porównanie intensywności barwy, która powstaje w dołkach z próbkami od pacjenta z barwą dołków kontrolnych. 1

2 Odczynniki 1. Polistyrenowe płytki z mikrodołkami ELISA pokryte częściowo oczyszczonym rekombinatem antygenu P450 2D6 ludzkiego cytochromu (12-1 x 8 dołków), z uchwytem w torebce foliowej zawierającej osuszacze 2. Negatywna kontrola ELISA, 1 fiolka buforu zawierająca środek konserwujący i surowicę ludzką bez ludzkich przeciwciał przeciwko LKM-1, wstępnie rozcieńczone, 1,2 ml 3. Słabo pozytywne LKM-1 ELISA, 1 fiolka buforu zawierającego konserwant i przeciwciała surowicy ludzkiej przeciwko rekombinatowi ludzkiego cytochromu P450 2D6, wstępnie rozcieńczone, 1,2 ml 4. Wysoko pozytywne LKM-1 ELISA, 1 fiolka buforu zawierającego konserwant i przeciwciała surowicy ludzkiej przeciwko rekombinatowi ludzkiego cytochromu P450 2D6, wstępnie rozcieńczone, 1,2 ml 5. Rozcieńczalnik do próbek HRP, 1 fiolka zabarwienie różowe, zawiera sól fizjologiczną buforowaną TRIS, Tween 20, stabilizatory białka i konserwant, 50 ml 6. Koncentrat do płukania HRP, 1 fiolka koncentratu 40x zabarwienie czerwone, zawiera sól fizjologiczną buforowaną TRIS i Tween 20, 25 ml. Instrukcje dotyczące rozcieńczania można znaleźć w sekcji Metody. 7. Koniugat HRP IgG, (kozi), przeciwciała przeciw-ludzkie IgG, 1 fiolka zabarwienie niebieskie, zawiera bufor, stabilizatory białka i konserwant, 10 ml 8. Chromogen TMB, 1 fiolka zawierająca stabilizatory, 10 ml 9. Roztwór zatrzymujący HRP, kwas siarkowy 0,344M, 1 fiolka bezbarwny, 10 ml Ostrzeżenia 1. OSTRZEŻENIE: Ten produkt zawiera substancję chemiczną (chloramfenikol 0,02%) w rozcieńczalniku do próbek, kontrolach i koniugacie, która według stanu Kalifornii wywołuje raka. 2. Wszystkie materiały pochodzenia ludzkiego używane w przygotowywaniu kontroli dla tego produktu zostały przetestowane i na podstawie metod zatwierdzonych przez FDA stwierdzono że nie zawierają przeciwciał przeciwko HIV, HBsAg i HCV. Jednak żadna metoda testowania nie może całkowicie zagwarantować braku obecności HIV, HBV, HCV lub innych czynników zakaźnych. Z tego też względu słabo pozytywną LKM-1 ELISA, wysoko pozytywną LKM-1 ELISA i kontrolę negatywną ELISA należy użytkować w ten sam sposób, jak materiał potencjalnie zakaźny Jako konserwant stosowany jest azydek sodu. Azydek sodu jest trucizną i może być toksyczny w przypadku połknięcia lub wchłonięcia przez skórę lub oczy. Azydek sodu może wchodzić w reakcję z ołowianą lub miedzianą instalacją wodociągową, tworząc potencjalnie wybuchowe azydki metali. Jeśli do usuwania odczynników używane są zlewy, należy przepłukiwać je dużą ilością wody, aby nie dopuścić do gromadzenia się azydku. 4. Koniugat HRP zawiera rozcieńczoną trującą/korozyjną substancję chemiczną, która może być toksyczna w przypadku spożycia w dużej ilości. Aby uniknąć potencjalnych oparzeń chemicznych, należy unikać kontaktu ze skórą i oczami. 5. Chromogen TMB zawiera środek drażniący, w który może być szkodliwy w przypadku wdychania, spożycia lub wchłonięcia przez skórę. Aby uniknąć urazów, należy unikać wdychania, spożycia lub kontaktu ze skórą i oczami. 6. Roztwór zatrzymujący HRP składa się z rozcieńczonego roztworu kwasu siarkowego. Unikać wystawienia na działanie zasad, metali lub innych związków, które mogą wchodzić w reakcje z kwasami. Kwas siarkowy jest trucizną i ma właściwości korozyjne. W razie połknięcia może być toksyczny. Aby uniknąć oparzeń chemicznych, należy unikać kontaktu ze skórą i oczami. 7. Podczas pracy z dostarczonymi odczynnikami należy stosować odpowiednie środki ochrony osobistej. 8. Rozlane odczynniki należy natychmiast usunąć. Należy przestrzegać wszystkich krajowych i lokalnych przepisów w zakresie utylizacji odpadów. 2

3 Środki ostrożności 1. Ten produkt jest przeznaczonych do zastosowań diagnostycznych In Vitro. 2. Zastąpienie składników dostarczonych w tym systemie innymi składnikami może skutkować osiągnięciem niespójnych wyników. 3. Niepełne lub nieprawidłowe płukanie i niewystarczające usunięcie płynu z płytek z dołkami ELISA wpłynie negatywnie na precyzję badań i/lub spowoduje wysoki poziom tła. 4. Dostosowanie tego badania do stosowania ze zautomatyzowanymi analizatorami próbek oraz innymi urządzeniami do pracy z płynami, w całości lub w części, może skutkować rozbieżnością wyników w stosunku do badań przeprowadzanych ręcznie. Obowiązkiem każdego laboratorium jest potwierdzenie, że wyniki testów uzyskanych na podstawie zautomatyzowanych badań mieszczą się w akceptowalnych limitach. 5. Na wyniki analizy wpływa wiele różnych czynników. Obejmują one temperaturę początkową odczynników, temperaturę otoczenia, dokładność i powtarzalność techniki pipetowania, dokładność płukania i usuwania płynu z dołków płytek ELISA, fotometr użyty do analizy wyników oraz czasy trwania inkubacji podczas badania. Uzyskanie dokładnych i powtarzalnych wyników wymaga staranności i precyzji. 6. Zalecane jest ścisłe przestrzeganie procedury testowej. 7. Niedokładne zamknięcie torebki z zamknięciem strunowym, zawierającej płytki z mikrodołkami i osuszaczami, spowoduje degradację antygenu i brak precyzji badania. 8. Dwukrotne lub wielokrotne użycie koniugatu HRP z jednej butelki w pewnym okresie czasu może spowodować niedopuszczalnie niski poziom absorbancji. Aby nie dopuścić do takiej sytuacji istotne jest przestrzeganie wszystkich zaleceń dotyczących procedur pracy z koniugatem HRP. 9. Zanieczyszczenie chemiczne koniugatu HRP może być spowodowane nieprawidłowym czyszczeniem lub płukaniem sprzętu lub narzędzi. Pozostałości typowych laboratoryjnych substancji chemicznych, takich jak formalina, substancja wybielająca, etanol lub detergent, z czasem spowoduje degradację koniugatu HRP. Po użyciu chemicznych substancji czyszczących/dezynfekujących dokładnie wypłukać cały sprzęt i wszystkie narzędzia. Warunki przechowywania 1. Wszystkie odczynniki z zestawu przechowywać w temperaturze 2 8 C. Nie zamrażać. Odczynniki są trwałe do daty ważności, pod warunkiem, że są przechowywane i używane zgodnie z instrukcjami. 2. Nieużyte płytki z mikrodołkami pokrytymi antygenem powinny być starannie zamknięte w torebce foliowej z osuszaczami i przechowywane w temperaturze 2 8 C. 3. Rozcieńczony bufor do płukania zachowuje trwałość przez 1 tydzień w temperaturze 2 8 C. Pobieranie próbek Ta procedura powinna być wykonana z próbką surowicy. Dodanie azydku lub innych konserwantów do próbek analitycznych może mieć negatywny wpływ na wyniki. Nie używać próbek zawierających widoczne zanieczyszczenia, skażonych bakteryjnie lub podgrzanych. Należy unikać całkowicie zhemolizowanej lub lipemicznej surowicy albo próbek. Po pobraniu surowica powinna być oddzielona od skrzepu. Dokument CLSI (NCCLS) H18-A2 zaleca następujące warunki przechowywania próbek: 1) Przechowywać próbki w temperaturze pokojowej nie dłużej niż 8 godzin. 2) Jeśli badanie nie zostanie zakończone w ciągu 8 godzin, schłodzić próbkę do temperatury 2-8 C. 3) Jeśli badanie nie zostanie ukończone w ciągu 48 godzin lub w przypadku transportu próbki, należy zamrozić ją w temperaturze -20 C lub niższej. Zamrożone próbki po rozmrożeniu i przed badaniem muszą zostać dobrze wymieszane. 3

4 Badanie Dostarczone materiały 1 Płytka z mikrodołkami LKM-1 ELISA (12-1 x 8 dołków), z uchwytem 1 1,2 ml wstępnie rozcieńczona kontrola negatywna ELISA 1 1,2 ml wstępnie rozcieńczonej słabo pozytywnej LKM-1 ELISA 1 1,2 ml wstępnie rozcieńczonej wysoko pozytywnej LKM-1 ELISA 1 50 ml rozcieńczalnika do próbek HRP 1 25 ml koncentratu do płukania HRP, koncentrat 40x 1 10 ml koniugatu przeciwciała IgG HRP, (kozie), przeciw-ludzkie IgG 1 10 ml chromogenu TMB 1 10 ml roztworu zatrzymującego HRP, kwas siarkowy 0,344M Wymagane materiały nie dołączone do zestawu Mikropipety na 5, 100, i 500 µl Jednorazowe końcówki mikropipet Probówki do roztworów próbek pochodzących od pacjenta, 4 ml objętości Woda destylowana lub dejonizowana Naczynie o objętości 1 l do rozcieńczonego koncentratu HRP do płukania Czytnik płytek z mikrodołkami umożliwiający pomiar gęstości optycznej przy 450 nm (i przy 620 nm dla odczytów przy dwóch długościach fali) Sposób przygotowania Przed rozpoczęciem 1. Doprowadzić wszystkie odczynniki i próbki do temperatury pokojowej (20-26 o C) i dobrze wymieszać. 2. Rozcieńczyć koncentrat do płukania HRP w stosunku 1:40, dodając zawartość butelki koncentratu do płukania HRP do 975 ml wody destylowanej lub dejonizowanej. Jeśli cała płytka nie zostanie przetworzona w tym czasie, można przygotować mniejszą ilość. W tym celu należy dodać 2,0 ml koncentratu do 78 ml wody destylowanej lub dejonizowanej na każde 16 dołków, które będą użyte. Rozcieńczony bufor zachowuje trwałość przez 1 tydzień w temperaturze 2 8 o C. 3. Przygotować roztwór 1:101 każdej próbki pobranej od pacjenta, dodając 5 µl próbki do 500 µl rozcieńczalnika do próbek HRP. Rozcieńczone próbki muszą być użyte w ciągu 8 godzin od przygotowania. NIE ROZCIEŃCZAĆ słabo pozytywnej LKM-1 ELISA, wysoko pozytywnej LKM-1 ELISA i kontroli negatywnej ELISA. 4. Oznaczanie obecności lub braku LKM-1, stosując jednostki umowne wymaga dwóch dołków dla każdego z trzech kontroli i jednego lub dwóch dołków dla każdej próbki pacjenta. Zalecane jest wykonanie duplikatów próbek. Procedura badania 1. WSZYSTKIE ODCZYNNIKI PRZED ROZPOCZĘCIEM BADANIA MUSZĄ BYĆ DOPROWADZONE DO TEMPERATURY POKOJOWEJ (20 26 C). Umieścić wymaganą liczbę mikrodołków/pasków w uchwycie. Natychmiast umieścić nieużywane płytki w torebce foliowej zawierającej osuszacz i dobrze ją zamknąć, aby ograniczyć kontakt z parą wodną. 2. Do dołków dodać 100 µl wstępnie rozcieńczonej słabo pozytywnej LKM-1 ELISA, wysoko pozytywnej ELISA LKM-1, kontroli negatywnej ELISA i rozcieńczone próbki pochodzące od pacjentów. Przykryć dołki i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej na równej powierzchni. Czas inkubacji rozpoczyna się po dodaniu ostatniej próbki. 3. Etap płukania: Odessać całkowicie zawartość każdego dołka. Wlać µl rozcieńczonego buforu HRP do płukania do wszystkich dołków, a następnie go odessać. Powtórzyć tę sekwencję jeszcze dwukrotnie, aby łącznie przeprowadzić trzy płukania. Odwrócić płytkę i postukać w nią na materiale pochłaniającym w celu usunięcia pozostałości płynu po ostatnim płukaniu. Ważne jest, aby całkowicie opróżnić każdy dołek po każdym etapie płukania. Zachować tę samą sekwencję odsysania, jak w przypadku dodawania próbki. 4

5 4. Do każdego dołka dodać 100 µl koniugatu IgG HRP. Koniugat powinien być usunięty z butelek z zastosowaniem standardowych warunków aseptycznych oraz zalecanych technik laboratoryjnych. Pobrać z butelki jedynie wymaganą do analizy ilość koniugatu. ABY UNIKNĄĆ POTENCJALNEGO ZANIECZYSZCZENIA BAKTERYJNEGO I/LUB CHEMICZNEGO, NIE WOLNO Z POWROTEM WLEWAĆ NIEUŻYTEGO KONIUGATU DO BUTELKI. Inkubować dołki przez 30 minut jak w etapie Etap płukania: Powtórzyć etap Dodać 100 µl chromogenu TMB do każdego dołka i inkubować w ciemności przez 30 minut w temperaturze pokojowej. 7. do każdego dołka dodać 100 µl roztworu zatrzymującego HRP. Zachować tę samą sekwencję i czas dodawania roztworu zatrzymującego HRP, jak w przypadku chromogenu TMB. Delikatnie postukać płytkę palcem, aby dokładnie wymieszać zawartość dołków. 8. Odczytać absorbancję (gęstość optyczną) każdego dołka przy długości fali 450 nm w ciągu jednej godziny od zatrzymania reakcji. Jeśli wymagane są pomiary bichromatyczne, referencyjną długością fali może być długość 620 nm. Kontrola jakości 1. Aby upewnić się, że wszystkie odczynniki i procedury funkcjonują prawidłowo, każdą serię próbek należy testować wraz ze słabo pozytywnym LKM-1 ELISA, wysoko pozytywnym LKM-1 ELISA i kontrolą negatywną ELISA. 2. Należy zauważyć, że ponieważ słabo pozytywna LKM-1 LISA, E wysoko pozytywna LKM-1 ELISA oraz kontrola negatywna ELISA są już wstępnie rozcieńczone, to nie będą one stanowić kontroli w przypadku procedur związanych z rozcieńczaniem próbek. 3. Dodatkowe kontrole mogą być przebadane zgodnie z wytycznymi lub wymaganiami lokalnych i/lub krajowych przepisów lub organów normalizacyjnych. Dodatkowe odpowiednie surowice kontrolne można przygotować, dzieląc połączone próbki surowicy ludzkiej i przechowując je w temperaturze - 20 C. 4. Aby wyniki badania mogły być uznane jako ważne, muszą zostać spełnione wszystkie poniższe kryteria. Jeśli jakiekolwiek kryterium nie będzie spełnione, badanie powinno być traktowane jako nieważne i powinno zostać powtórzone. a. Absorbancja wstępnie rozcieńczonej wysoko pozytywnej kontroli LKM-1 ELISA musi być większa niż absorbancja wstępnie rozcieńczonej słabo pozytywnej LKM-1 ELISA, która z kolei musi być większa niż absorbancja wstępnie rozcieńczonej kontroli negatywnej ELISA. b. Absorbancja wstępnie rozcieńczonej wysoko pozytywnej kontroli LKM-1 ELISA musi być większa niż 1,0, natomiast absorbancja wstępnie rozcieńczonej kontroli negatywnej ELISA nie może przekroczyć 0,2. c. Absorbancja wstępnie rozcieńczonej słabo pozytywnej kontroli LKM-1 ELISA musi być ponad dwukrotnie większa niż absorbancja kontroli negatywnej ELISA lub być większa niż 0,25. d. Kontrola negatywna ELISA i wysoko pozytywna LKM-1 ELISA mają za zadanie wykazać ewentualne istotne nieprawidłowe działanie odczynnika. Wysoko pozytywna kontrola LKM-1 ELISA nie zapewni dokładności przy wartości granicznej badania. e. Dodatkowe wytyczne dotyczące odpowiednich praktyk QC można znaleźć w dokumencie CLSI (NCCLS) C24-A. 5

6 Obliczanie wyników W pierwszej kolejności jest określana średnia gęstość optyczna każdego zestawu duplikatów. Reaktywność każdej próbki można następnie wyliczyć, dzieląc średnią gęstość optyczną próbki przez średnią gęstość optyczną słabo pozytywnej LKM-1 ELISA. Otrzymany wynik mnoży się przez liczbę jednostek przypisanych do słabo pozytywnej LKM-1 ELISA, którą można znaleźć na etykiecie. Wartość próbki = (jednostki) Gęstość optyczna próbki x słabo pozytywna LKM-1 ELISA gęstość optyczna słabo pozytywnej LKM-1 ELISA (jednostki) Reaktywność w sposób nieliniowy zależy od ilości obecnych przeciwciał. Wzrosty i spadki stężeń przeciwciał u pacjenta będą odzwierciedlone w analogicznym wzroście lub spadku reaktywności, jednak zmiana ta nie jest proporcjonalna (tzn. podwojenie stężenia przeciwciał nie oznacza podwojenia reaktywności). Jeśli wymagane jest dokładniejsze oszacowanie ilości przeciwciał pacjenta, należy przeprowadzić seryjne badanie próbek otrzymanych od pacjenta i ostatnie rozcieńczenie w ramach badania z wynikiem pozytywnym powinno być zaraportowane jako miano przeciwciał pacjenta. Interpretacja wyników Badanie ELISA jest bardzo wrażliwe na technikę i jest w stanie wychwycić nawet najdrobniejsze różnice w populacjach pacjentów. Poniższe wartości są jedynie wartościami sugerowanymi. Każde laboratorium powinno ustalić własny normalny zakres na podstawie własnych technik, kontroli, sprzętu i populacji pacjentów, zgodnie z własnymi ustalonymi procedurami. Próbka następnie może być sklasyfikowana jako negatywna, niejednoznaczna lub pozytywna, zgodnie z poniższą tabelą. Jednostki Negatywna <20,0 Niejednoznaczne 20,1 24,9 Pozytywne >25 Niejednoznaczne próbki powinny zostać ponownie przebadane przed przedstawieniem wyników. 1. Wynik pozytywny wskazuje obecność przeciwciał IgG przeciwko rekombinatowi ludzkiego P450 2D6 i sugeruje możliwość występowania autoagresyjnego zapalenia wątroby typu W przypadku próbek o niejednoznacznym poziomie LKM-1 IgG nie można ustalić stanu przeciwciał. Jeśli wyniki nadal są niejednoznaczne po powtórzonym badaniu, wynik należy zaraportować jako niejednoznaczny i/lub pobrać dodatkową próbkę. 3. Wynik negatywny świadczy o tym, że nie występują przeciwciała IgG przeciwko LKM-1 lub że ich poziom jest poniżej dolnej wartości granicznej badania. 4. W przypadku próbek o gęstości optycznej przewyższającej zakres odczytu czytnika płytek, można je zaraportować jako takie, których najwyższą mierzalną wartość gęstości optycznej dzieli się przez gęstość optyczną kontroli słabo pozytywnej i mnoży przez 25, lub można je rozcieńczyć, przebadać ponownie i wyliczyć pożądaną wartość. 5. Zalecane jest, aby wyniki raportowane przez laboratorium zawierały oświadczenie: Poniższe wyniki otrzymano przy wykorzystaniu zestawu INOVA QUANTA Lite LKM-1 ELISA. Nie można stosować zamiennie wartości LKM-1 uzyskanych przy zastosowaniu metod testowych innych producentów. Rząd wielkości poziomów raportowanego IgG nie może być skorelowany z mianem punktu końcowego. Ograniczenia badania 1. Negatywny wynik LKM-1 nie wyklucza obecności autoagresyjnego zapalenia wątroby typu Negatywny wynik przeciwciał LKM-1 nie wyklucza obecności przeciwciał LKM-1, ponieważ stężenie przeciwciał może być poniżej granicy wykrywania dla tego testu. 3. Pozytywny wynik testu wskazuje jedynie obecność przeciwciał przeciwko ludzkiemu rekombinatowi cytochromu P450 2D6 i niekoniecznie wskazuje na obecność autoagresyjnego zapalenia wątroby typu 2. 6

7 4. Zdiagnozowanie autoagresyjnego zapalenia wątroby typu 2 wymaga zebrania dokumentacji dotyczącej danych demograficznych pacjenta, manifestacji klinicznej oraz innych badań diagnostycznych. 5. Przeciwciała LKM-1 mogą być wykrywane u pacjentów w podobnej liczbie jako rezultat infekcji HCV i mogą nie być rezultatem AIH-2. Pozytywne próbki LKM-1 powinny być przetestowane pod kątem infekcji HCV. 6. Wyniki tego badania powinny być użyte w powiązaniu z wynikami klinicznymi i innymi badaniami serologicznymi. 7. Charakterystyka wyników badania nie została ustanowiona dla podłoża innego niż surowica. Spodziewane wartości Występowanie autoagresyjnego zapalenia wątroby typu 2 zostało oszacowane jako 5 30 przypadków na milion. Choroba nie jest zbyt powszechna w wieku 2 14 lat i częściej występuje u kobiet niż u mężczyzn (8:1). 14,15 Normalny zakres Panel 194 próbek zebranych od 151 dorosłych i 43 dzieci został przebadany przy użyciu zestawu QUANTA Lite LKM-1 ELISA. Jedna próbka była niejednoznaczna/na granicy zakresu wyników (20,7 jednostki). Pozostałe 193 próbki zostały zinterpretowane jako negatywne. Po wykluczeniu próbek niejednoznacznych swoistość wyniosła 100% (193/193). Wartość średnia dla tej populacji wynosiła 6,3 jednostki, wartość mediany wynosiła 5,7 jednostek, a najwyższa wartość wyniosła 20,7 jednostki. Zakres wiekowy osób wynosił od 1 roku do 75 lat. Charakterystyka swoista Badania kliniczne W ramach pierwszego badania przygotowano i przetestowana w zewnętrznej placówce klinicznej panel składający się z 84 klinicznie zdefiniowanych próbek. Szczegóły przetestowanych próbek oraz wyniki badania zostały podsumowane na rys. 1. Test QUANTA Lite LKM-1 ELISA wykazał 100% (22/22) czułości w przypadku próbek, które miały pozytywny wynik na autoagresyjne zapalenie wątroby typu 2, pozytywny wynik na LKM-1 IFA oraz negatywny wynik na HCV. Niskie poziomy reakcyjności LKM-1 zostały stwierdzone u pacjentów z pozytywnym wynikiem na HCV. Test QUANTA Lite LKM-1 ELISA wykazał, że 70% (14/20) wybranej grupy próbek LKM-1 IFA+/HCV+ miało wynik pozytywny w ramach QUANTA Lite LKM-1 ELISA. T e s t Q U A N T A L LKM-1 i t e ELISA był w 100% swoisty (34/34) w przypadku 34 próbek, które uzyskały wyniki pozytywny na LKM-1 IFA, ale które były klinicznie pozytywne na AIH-2 i nie były pozytywne na HCV. Oprócz tego 3 pacjentów z pozytywnym wynikiem halotanu na LKM-2 oraz 5 pacjentów na LKM miało negatywny wynik w ramach QUANTA Lite LKM-1 ELISA. Drugie zewnętrzne badanie objęło panel zawierający 4 udokumentowane próbki pacjentów z AIH-2 (w wieku 2, 2, 4 1/2 oraz 6 lat) oraz 41 innych próbek z chorobami autoagresyjnymi i chorobami wątroby. Wszystkie 4 próbki AIH-2 zostały zinterpretowane jako pozytywne. Trzy pozytywne próbki HCV miały wynik pozytywny dla LKM-1 ELISA oraz IFA, a jedna miała wynik pozytywny tylko dla LKM ELISA. Informacje na temat innych przebadanych próbek można znaleźć w punkcie reakcyjność krzyżowa. 7

8 Rys 1 QUANTA LITE LKM-1 ELISA Evalutation z próbek klinicznych U N I T S LKM-1 Positive Autoimmune Hepatitis 2 pozytywny HCV negatywnc n=22 LKM-1 Pozytywny - HCV posytywny n=20 LKM-1 Pozytywny - NOT Autoagresyjne z a p a l e n i e w ą t r o b y2 - HCV Negatywnc n=34 LKM-2 Pozytywny n=3 LKM- Halothane pozytywny n=5 Table 1: Badanie wewnętrzne poddało testom kompleksowy panel składający się z 79 złożonych próbek z laboratoriów referencyjnych oraz z magazynów placówki. Wyniki badań wg testu QUANTA Lite LKM-1 ELISA oraz LKM-1 IFA zostały podsumowane w tabeli 1. Tabela 1: n=79 LKM-1 IFA POZ NIEJED NEG QUANTA LITE POZ LKM-1 ELISA NIEJED NEG Zgodność całkowita = 91,5% (65/71) (wyniki niejednoznaczne zostały wykluczone) Badanie reaktywności krzyżowej Próbki od różnorodnych grup klinicznych zostały ocenione pod kątem potencjalnej reakcyjności krzyżowej za pomocą QUANTA Lite LKM-1 ELISA. Wyniki zostały podsumowane w tabeli 2. Tabela 2: Badanie reaktywności krzyżowej Grupa pacjentów n= Pozyt. Niejed.Neg HCV * 40 5** 0 35 LKM LKM-halotan Rozpuszczalny antygen wątroby (SLA) Autoagresyjne zapalenie wątroby typu Choroba Leśniowskiego-Crohna Ostre zapalenie jelita grubego Marskość wątroby (jedna alkoholowa, jedna nieokreślona) Marskość wątroby pierwotna żółciowa Krioglobulinemia Niealkoholowe stłuszczeniowe zapalenie wątroby Obstrukcyjne zapalenie trzustki Celiakia Twardzina Choroba Addisona (adreal poz.)

9 Grupa pacjentów n= Pozyt. Niejed.Neg Przeciwciała przeciwko komórkom wyspowym (ICA) Dekarboksylaza kwasu glutaminowego (GAD) AMA SMA TPO Sm RNP SS-A SS-B Scl Jo Rybosomalny P Chromatyna PCNA ANA/DNA Centromerowy * Próbki pozytywne HCV (niewybrane dla reakcyjności LKM-1 IFA) ** 4/5 pozytywne dla LKM-1 IFA Precyzja i powtarzalność Wyniki wewnątrz badania zostały ocenione na podstawie 12-krotnego testu 6 próbek, w tym negatywnej, niejednoznacznej, pozytywnej na granicy, słabo pozytywnej, umiarkowanie pozytywnej i wysoko pozytywnej. Wyniki zostały podsumowane w tabeli 3. Tabela 3 Surowica 1 Surowica 2 Surowica 3 Surowica 4 Surowica 5 Surowica 6 Średnia 61,7 13,5 4,9 12,9 43,6 66,2 S,D, 2,6 0,8 0,3 0,4 0,8 2,8 C,V,% 4,2 5,8 5,3 3,2 1,8 4,3 Wyniki pomiędzy próbkami zostały ocenione poprzez 6-krotne przebadanie w ciągu 3 dni 10 próbek, w tym negatywnej, słabo pozytywnej, umiarkowanie pozytywnej i wysoko pozytywnej. Przeprowadzono dwie serie dziennie jedną rano, a drugą po południu. Wyniki, które zostały podsumowane w tabeli 4, wykazują CV% około 5% lub mniej w przypadku wszystkich próbek przy wartościach testu 5,5 lub powyżej. Tabela 4 Surowica 1 Surowica 2 Surowica 3 Surowica 4 Surowica 5 Surowica 6 Surowica 7 Surowica 8 Surowica 9 Surowica 10 Średnia 58,0 3,2 65,8 5,1 50,2 46,9 4,4 48,5 44,2 5,4 S.D. 1,4 0,7 2,7 0,7 1,2 2,4 0,8 2,2 2,2 0,8 C.V.% 2,3 22,7 4,1 14,1 2,5 5,1 17,6 4,5 4,9 14,2 9

10 Powtarzalność pomiędzy laboratoriami została oceniona poprzez porównanie wyników losowo wybranych 20 elementów panelu w zewnętrznej klinice 2 oraz wyników uzyskanych wcześniej przez firmę INOVA Diagnostics. Analiza regresji wykazała doskonałą zgodność z wartością R 2 o wielkości 0,99. Liniowość Roztwory 3 próbek wykazały, że badanie wykazało dobrą liniowość w przypadku testowania roztworów od 1:50 do 1:51,200 (rys. 2). Rys 2 10

11 11

12 Piśmiennictwo 1. McFarlane IG. The Relationship between autoimmune markers and different clinical syndromes in autoimmune hepatitis. Gut 42: , Manns MP. Liver/kidney microsomal autoantigens. In: Autoantibodies, eds: Peter JB and Shoenfeld Y. Elsevier. pp , Manns MP and Obermayer-Straub P. Cytochromes P450 and uridine triphosphate-glucoronosyltransferases: model autoantigens to study drug-induced, virus-induced, and autoimmune liver disease. Hepatology 26(4): , Zanger UM, Hauri HP,Loeper J, Homberg JC and Meyer UA. Antibodies against human cytochrome P450 dbl in autoimmune hepatitis type II. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: , Manns MP, Johnson EF, Griffin KJ, Tan EM and Sullivan KF. Major antigen of liver kidney microsomal autoantibodies in idiopathic autoimmune hepatitis is cytochrome P450 dbl. J. Clin. Invest. 83: , Gueguen M, Yamamoto AM, Bernhard O and Alvarez F. Anti-liver-kidney microsome antibody type 1 recognizes human cytochrome P450 dbl. Biochem. Biophys. Res. Commun. 159: , Miyakawa H, Kitazawa E, Abe K, Kawaguchi N, Fuzikawa H, Kikuchi K, Kako M, Komatsu T, Hayashi N and Kiyosawa K. Chronic hepatitis C associated with anti-liver/kidney microsome-1 antibody is not a subgroup of autoimmune hepatitis. J. Gastroenterol. 32(6): , Clifford BD, Donahue D, Smith S, Cable E, Luettig B and Manns MP. High prevalence of serological markers of autoimmunity in patient with chronic hepatitis C. Hepatology 231: , Gregorio GV, Pensati P, Iorio R, Vegnente A, Mieli-Vergani G and Vergani D. Autoantibody prevalence in children with liver disease due to chronic hepatitis C virus (HCV) infection. Clin. Exp. Immunol. 112(3): 471-6, Declos-Valee JC, Hajoui O, Yamamoto AM, Jacqz-Aigrin E and Alvarez F. Conformational epitopes on CYP2D6 are recognized by liver/kidney microsomal antibodies. Gastroenterology 108: , Dalekos GN, Wedemeyer H, Obermayer-Straub P, Kayser A, Barut A, Frank H and Manns MP. Epitope mapping of cytochrome P450 2D6 autoantigen in patients with chronic hepatitis C during alpha-interferon treatment. J. Hepatol. 30(3): , Todros L, Saracco G, Durazzo M, Abate ML, Touscoz G, Scaglione L, Verme G and M Tissetto. Efficacy and safety of interferon alfa therapy in chronic hepatitis C with autoantibodies to liver-kidney microsomes. Hepatology 22: , Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Center for Disease Control/National Institute of Health, 2007, Fifth Edition. 14. Beaune P, Pessayre D, Dansette P, Mansuy D and Manns MP. Autoantibodies against cytochromes P450: a role in human diseases. Adv. Pharmacol. 30: , Homberg JC, Abuaf N, Bernard O, Islam S, Alvarez F, Khalil SH, Poupon R, Darnis F, Levy VG, Grippon P, et al. Chronic active hepatitis associated with antiliver/kidney microsome antibody type 1: a second type of autoimmune hepatitis. Hepatology 7(6): ,

13 QUANTA Lite jest zastrzeżonym znakiem handlowym firmy INOVA Diagnostics, Inc. Copyright Wszelkie prawa zastrzeżone Wyprodukowano przez: INOVA Diagnostics, Inc Old Grove Road San Diego, CA Stany Zjednoczone Ameryki Pomoc techniczna (tylko na terenie Stanów Zjednoczonych i Kanady): Pomoc techniczna (poza terenem Stanów Zjednoczonych): support@inovadx.com Autoryzowani przedstawiciele na terenie Unii Europejskiej: Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D St. Ingbert, Niemcy Tel.: Faks.: POL Czerwiec 2012 Wersja 0 13