QUANTA Lite OMP Plus ELISA Do diagnostyki in vitro Złożoność CLIA: Wysoka

Transkrypt

1 QUANTA Lite OMP Plus ELISA Do diagnostyki in vitro Złożoność CLIA: Wysoka Przeznaczenie Zestaw QUANTA Lite TM OMP Plusjest immunoenzymatycznym testem (ELISA) do półilościowego oznaczania przeciwciał klasy IgA przeciwko OMP w surowicy człowieka. W zamierzeniu stosuje się go w połączeniu z testami na obecność przeciwciał IgG i/lub IgA przeciwko Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) (ASCA). W połączeniu z wynikami klinicznymi i innymi testami laboratoryjnymi do diagnozowania choroby Leśniowskiego-Crohna wykorzystać można badanie na obecność przeciwciał IgA przeciwko OMP (białka zewnętrznej błony komórkowej). Podsumowanie i wyjaśnienie testu Choroba zapalna jelit (IBD) jest ogólnym terminem stosowanym do opisu chorób powodujących stan zapalny jelit. Dwiema głównymi postaciami IBD są choroba Leśniowskiego-Crohna (CD) i wrzodziejące zapalenie okrężnicy (UC). 1-3 Zarówno choroba Leśniowskiego-Crohna jak i wrzodziejące zapalenie okrężnicy są chorobami przewlekłymi i dotykają ze zbliżoną częstością zarówno kobiety jak i mężczyzn. Choroby te z największą częstością występują w Europie Północnej i Ameryce Północnej. W przypadku około 20% osób cierpiących na chorobę Leśniowskiego-Crohna w ich rodzinie występuje jakaś postać IBD. Choroba Leśniowskiego-Crohna pojawia się zazwyczaj w wieku lat, a drugi, mniejszy szczyt zachorowań na tę chorobę pojawia się w wieku lat. W poprzedniej dekadzie pojawiło się kilka doniesień na temat wzrostu częstości występowania choroby Leśniowskiego-Crohna w różnych rejonach geograficznych. 4-6 Chociaż istnieje wiele teorii odnośnie przyczyn choroby Leśniowskiego-Crohna i wrzodziejącego zapalenia okrężnicy, to żadna z nich nie została potwierdzona. Ponieważ wiele objawów choroby Leśniowskiego-Crohna i wrzodziejącego zapalenia okrężnicy jest podobnych, to diagnoza jest często trudna i czasochłonna, a metody wykorzystywane do jej postawienia - inwazyjne. Około 10-12% przypadków początkowo nie klasyfikuje się i określane są one mianem nieokreślonego zapalenia okrężnicy". Z czasem, w około połowie przypadków, pacjentów tych klasyfikuje się jako cierpiących na chorobę Leśniowskiego-Crohna (CD) lub wrzodziejącego zapalenia okrężnicy (UC). 7, 8 Stwierdzono, że przeciwciała przeciwkosaccharomyces cerevisiae (ASCA) występują ze znacznie większą częstością u pacjentów z chorobą Leśniowskiego-Crohna niż u pacjentów z wrzodziejącym zapaleniem okrężnicy, czy u stanowiących kontrolę osób zdrowych Wydaje się, że przeciwciała te, które obejmować mogą zarówno przeciwciała z klasy IgG jak i IgA, skierowane są przeciwko sekwencjom mannozy mannanu budującego ścianę komórkową Saccharomyces cerevisiae. Wykazano, że wysoko specyficzne dla choroby Leśniowskiego-Crohna jest występowanie ASCA IgG lub IgA. Wykrycie ASCA może posłużyć do odróżnienia u niektórych pacjentów choroby Leśniowskiego-Crohna od wrzodziejącego zapalenia okrężnicy. 7, 8 U niektórych pacjentów z chorobą Leśniowskiego-Crohna stwierdzono obecność przeciwciał skierowanych przeciwko antygenom pochodzącym od wielu różnych bakterii. Opisane przeciwciała obejmują przeciwciała skierowane przeciwko białku C zewnętrznej błony komórkowej (OMP C) E.coli, białkom Pseudomonas fluorescens (I2) i kilku antygenom mykobakterii. 11,12 Ponieważ wydaje się, że przeciwciała przeciwko niektórym z tych antygenów występują u takich pacjentów z chorobą Leśniowskiego-Crohna, u których nie występują przeciwciała ASCA, a ich występowanie skorelowane jest z bardziej złożonym fenotypem choroby, opracowano testy wykrywające wspomniane związane z IBD przeciwciała przeciwko drobnoustrojom. 13,14 Dzięki wprowadzeniu do podłoża testu QUANTA Lite OMP Plus ELISA opatentowanego lizatu zewnętrznej błony komórkowej i związanych z nią białek, pochodzących od dwóch gatunków bakterii wyizolowanych od pacjentów z chorobą Leśniowskiego-Crohna, możliwe jest wykrycie większej ilości różnego typu przeciwciał skierowanych przeciwko drobnoustrojom, niż jest to w przypadku testów opierających się na jednym antygenie. Zasada badania Opatentowany lizat składający się z częściowo oczyszczonej zewnętrznej błony komórkowej i związanych z nią białek (OMP) otrzymany z 2 gatunków bakterii wyizolowanych od pacjentów z chorobą Leśniowskiego- Crohna wiąże się z ściankami mikrodołków płytek polistyrenowych. Rozcieńczone wstępnie próbki kontrolne i rozcieńczone surowice pochodzące od pacjentów dodaje się do oddzielnych dołków, co umożliwia związanie się wszelkich występujących w próbce przeciwciał przeciwko OMP z unieruchomionym antygenem. Niezwiązana próbka jest wypłukiwana i do każdego dołka dodawany jest koniugat znakowanego enzymem przeciwciała przeciw-ludzkiego IgA. Druga inkubacja umożliwia przeciwciałom przeciw-ludzkim IgA znakowanym enzymem związać się z dowolnymi przeciwciałami pacjenta, które zostały przytwierdzone do mikrodołków. Po wypłukaniu wszelkich niezwiązanych przeciwciał przeciw-ludzkich IgA znakowanych enzymem, aktywność pozostałego enzymu bada się dodając substrat chromogeniczny i mierząc intensywność powstałej barwy. Badanie może zostać ocenione spektrofotometrycznie, poprzez zmierzenie i porównanie intensywności barwy, która powstaje w dołkach z próbką od pacjenta z barwą dołków kontrolnych. 1

2 Odczynniki 1. Polistyrenowa płytka z mikrodołkami ELISA pokryta oczyszczonym antygenem OMP Plus (12-1 x 8 dołków), z uchwytem w torebce foliowej zawierającej osuszacze 2. Kontrola negatywna ELISA, 1 fiolka buforu zawiera konserwant i surowicę ludzką bez ludzkich przeciwciał przeciwko OMP, wstępnie rozcieńczona, gotowa do użycia, 1,2 ml 3. Słabo pozytywna kontrola OMP Plus ELISA, 1 fiolka buforu zawiera konserwant i przeciwciała surowicy ludzkiej przeciwko OMP, wstępnie rozcieńczona, gotowa do użycia 1,2 ml 4. Wysoko pozytywna kontrola OMP Plus ELISA, 1 fiolka buforu zawiera konserwant i przeciwciała surowicy ludzkiej przeciwko OMP, wstępnie rozcieńczona, gotowa do użycia 1,2 ml 5. Rozcieńczalnik do próbek HRP, 1 fiolka zabarwienie różowe, zawiera sól fizjologiczną buforowaną TRIS, Tween 20, stabilizatory białka i konserwant, 50 ml 6. Koncentrat do płukania HRP, 1 fiolka koncentratu 40x zabarwienie czerwone, zawiera sól fizjologiczną buforowaną TRIS i Tween 20, 25 ml. Instrukcje dotyczące rozcieńczania można znaleźć w sekcji Metody. 7. Koniugat HRP IgA, (kozi), przeciwciała przeciw-ludzkie IgA, 1 fiolka zabarwienie słomkowe, zawiera bufor, stabilizatory białka i konserwant, 10 ml 8. Chromogen TMB, 1 fiolka zawierająca stabilizatory, 10 ml 9. Roztwór zatrzymujący HRP, kwas siarkowy 0,344M, 1 fiolka bezbarwny, 10 ml Ostrzeżenia 1. OSTRZEŻENIE: Ten produkt zawiera substancję chemiczną (chloramfenikol 0,02%) w rozcieńczalniku do próbek, kontrolach i koniugacie, która według stanu Kalifornii wywołuje raka. 2. Wszystkie materiały pochodzenia ludzkiego używane w przygotowywaniu kontroli dla tego produktu zostały przetestowane i na podstawie metod zatwierdzonych przez FDA stwierdzono, że nie zawierają przeciwciał przeciwko HIV, syfilisowi, HBsAg i HCV. Jednak żadna metoda testowania nie może całkowicie zagwarantować braku obecności HIV, HBV, HCV lub innych czynników zakaźnych. Z tego też względu słabo pozytywną kontrolę OMP Plus ELISA, wysoko pozytywną kontrolę OMP Plus ELISA i kontrolę negatywną ELISA należy użytkować w ten sam sposób, jak materiał potencjalnie zakaźny Jako konserwant stosowany jest azydek sodu. Azydek sodu jest trucizną i może być toksyczny w przypadku połknięcia lub wchłonięcia przez skórę lub oczy. Azydek sodu może wchodzić w reakcję z ołowianą lub miedzianą instalacją wodociągową, tworząc potencjalnie wybuchowe azydki metali. Jeśli do usuwania odczynników używane są zlewy, należy przepłukiwać je dużą ilością wody, aby nie dopuścić do gromadzenia się azydku. 4. Koniugat HRP zawiera rozcieńczoną trującą/korozyjną substancję chemiczną, która może być toksyczna w przypadku spożycia w dużej ilości. Aby uniknąć potencjalnych oparzeń chemicznych, należy unikać kontaktu ze skórą i oczami. 5. Chromogen TMB zawiera środek drażniący, w który może być szkodliwy w przypadku wdychania, spożycia lub wchłonięcia przez skórę. Aby uniknąć urazów, należy unikać wdychania, spożycia lub kontaktu ze skórą i oczami. 6. Roztwór zatrzymujący HRP składa się z rozcieńczonego roztworu kwasu siarkowego. Unikać wystawienia na działanie zasad, metali lub innych związków, które mogą wchodzić w reakcje z kwasami. Kwas siarkowy jest trucizną i ma właściwości korozyjne. W razie połknięcia może być toksyczny. Aby uniknąć oparzeń chemicznych, należy unikać kontaktu ze skórą i oczami. 7. Podczas pracy z dostarczonymi odczynnikami należy stosować odpowiednie środki ochrony osobistej. 8. Rozlane odczynniki należy natychmiast usunąć. Należy przestrzegać wszystkich krajowych i lokalnych przepisów w zakresie utylizacji odpadów. Środki ostrożności 1. Ten produkt jest przeznaczony do zastosowań diagnostycznych in vitro. 2. Zastąpienie składników dostarczonych w tym systemie innymi składnikami może skutkować osiągnięciem niespójnych wyników. 3. Niepełne lub nieprawidłowe płukanie i niewystarczające usunięcie płynu z płytek z dołkami ELISA wpłynie negatywnie na precyzję badań i/lub spowoduje wysoki poziom tła. 4. Dostosowanie tego badania do stosowania ze zautomatyzowanymi analizatorami próbek oraz innymi urządzeniami do pracy z płynami, w całości lub w części, może skutkować rozbieżnością wyników w stosunku do badań przeprowadzanych ręcznie. Obowiązkiem każdego laboratorium jest potwierdzenie, że wyniki testów uzyskanych na podstawie zautomatyzowanych badań mieszczą się w akceptowalnych limitach. 5. Na wyniki analizy wpływa wiele różnych czynników. Obejmują one temperaturę początkową odczynników, temperaturę otoczenia, dokładność i powtarzalność techniki pipetowania, dokładność płukania i usuwania płynu z dołków płytek ELISA, fotometr użyty do analizy wyników oraz czasy trwania inkubacji podczas badania. Uzyskanie dokładnych i powtarzalnych wyników wymaga staranności i precyzji. 6. Zalecane jest ścisłe przestrzeganie procedury testowej. 7. Niedokładne zamknięcie torebki z zamknięciem strunowym, zawierającej płytki z mikrodołkami i osuszaczami, spowoduje degradację antygenu i brak precyzji badania. 8. Dwukrotne lub wielokrotne użycie koniugatu HRP z jednej butelki w pewnym okresie czasu może dać niedopuszczalnie niski poziom absorbancji. Aby nie dopuścić do takiej sytuacji istotne jest przestrzeganie wszystkich zaleceń dotyczących procedur pracy z koniugatem HRP. 2

3 9. Zanieczyszczenie chemiczne koniugatu HRP może być spowodowane nieprawidłowym czyszczeniem lub płukaniem sprzętu lub narzędzi. Pozostałości typowych laboratoryjnych substancji chemicznych, takich jak formalina, substancja wybielająca, etanol lub detergent, z czasem spowoduje degradację koniugatu HRP. Po użyciu chemicznych substancji czyszczących/ dezynfekujących dokładnie wypłukać cały sprzęt i wszystkie narzędzia. Warunki przechowywania 1. Wszystkie odczynniki z zestawu przechowywać w temperaturze 2-8 C. Nie zamrażać. Odczynniki są trwałe do daty ważności, pod warunkiem, że są przechowywane i używane zgodnie z instrukcjami. 2. Nieużyte płytki z mikrodołkami pokrytymi antygenem powinny być starannie zamknięte w torebce foliowej z osuszaczami i przechowywane w temperaturze 2-8 C. 3. Rozcieńczony bufor do płukania zachowuje trwałość przez 1 tydzień w temperaturze 2-8 C. Pobieranie próbek Ta procedura powinna być wykonana z próbką surowicy. Dodanie azydku lub innych konserwantów do próbek analitycznych może mieć negatywny wpływ na wyniki. Nie używać próbek zawierających widoczne zanieczyszczenia, skażonych bakteryjnie lub podgrzanych. Należy unikać całkowicie zhemolizowanej lub lipemicznej surowicy albo próbek. Po pobraniu surowica powinna być oddzielona od skrzepu. Dokument CLSI (NCCLS) H18-A3 zaleca następujące warunki przechowywania próbek: 1) Przechowywać próbki w temperaturze pokojowej nie dłużej niż 8 godzin. 2) Jeśli badanie nie zostanie zakończone w ciągu 8 godzin, schłodzić próbkę do temperatury 2-8 C. 3) Jeśli badanie nie zostanie ukończone w ciągu 48 godzin lub w przypadku transportu próbki, należy zamrozić ją w temperaturze -20 C lub niższej. Zamrożone próbki po rozmrożeniu i przed badaniem muszą zostać dobrze wymieszane. Badanie Dostarczone materiały 1 Płytka z mikrodołkami OMP Plus ELISA (12-1 x 8 dołków), z uchwytem 1 1,2 ml wstępnie rozcieńczonej, gotowej do użycia kontroli negatywnej ELISA 1 1,2 ml wstępnie rozcieńczonej, gotowej do użycia słabo pozytywnej kontroli OMP Plus ELISA 1 1,2 ml wstępnie rozcieńczonej, gotowej do użycia wysoko pozytywnej kontroli OMP Plus ELISA 1 50 ml rozcieńczalnika do próbek HRP 1 25 ml koncentratu do płukania HRP, koncentrat 40x 1 10 ml koniugatu przeciwciała IgA HRP, (kozie), przeciw-ludzkie IgA 1 10 ml chromogenu TMB 1 10 ml roztworu zatrzymującego HRP, kwas siarkowy 0,344M Wymagane materiały nie dołączone do zestawu Mikropipety na 5, 100, i 500 µl Jednorazowe końcówki mikropipet Probówki do roztworów próbek pochodzących od pacjenta, 4 ml objętości Woda destylowana lub dejonizowana Naczynie o objętości 1 l do rozcieńczonego koncentratu HRP do płukania Czytnik płytek z mikrodołkami umożliwiający pomiar gęstości optycznej przy 450 nm (i przy 620 nm dla odczytów przy dwóch długościach fali) Sposób przygotowania Przed rozpoczęciem 1. Doprowadzić wszystkie odczynniki i próbki do temperatury pokojowej (20-26 o C) i dobrze wymieszać. 2. Rozcieńczyć koncentrat do płukania HRP w stosunku 1:40, dodając zawartość butelki koncentratu do płukania HRP do 975 ml wody destylowanej lub dejonizowanej. Jeśli cała płytka nie zostanie przetworzona w tym czasie, można przygotować mniejszą ilość. W tym celu należy dodać 2,0 ml koncentratu do 78 ml wody destylowanej lub dejonizowanej na każde 16 dołków, które będą użyte. Rozcieńczony bufor zachowuje trwałość przez 1 tydzień w temperaturze 2-8 C. 3. Przygotować roztwór 1:101 każdej próbki pochodzącej od pacjenta, dodając 5 µl próbki do 500 µl rozcieńczalnika do próbek HRP. Rozcieńczone próbki muszą być użyte w ciągu 8 godzin od przygotowania. NIE ROZCIEŃCZAĆ słabo pozytywnej kontroli OMP Plus ELISA, wysoko pozytywnej kontroli OMP Plus ELISA i kontroli negatywnej ELISA. 4. W celu stwierdzenia obecności bądź braku OMP Plus z zastosowaniem jednostek arbitralnych, potrzebne są po dwa dołki na każdą z trzech kontroli i jeden do dwóch dołków na każdą próbkę pochodzącą od pacjenta. Zalecane jest wykonanie duplikatów próbek. Procedura badania 1. WSZYSTKIE ODCZYNNIKI PRZED ROZPOCZĘCIEM BADANIA MUSZĄ BYĆ DOPROWADZONE DO TEMPERATURY POKOJOWEJ (20 26 C). Umieścić wymaganą liczbę mikrodołków/pasków w uchwycie. Natychmiast umieścić nieużywane płytki w torebce foliowej zawierającej osuszacz i dobrze ją zamknąć, aby ograniczyć kontakt z parą wodną. 3

4 2. Do dołków dodać 100 µl wstępnie rozcieńczonej słabo pozytywnej kontroli OMP Plus ELISA, wysoko pozytywnej kontroli OMP Plus ELISA, kontroli negatywnej ELISA i rozcieńczonych próbek pochodzących od pacjentów. Przykryć dołki i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej na równej powierzchni. Czas inkubacji rozpoczyna się po dodaniu ostatniej próbki 3. Etap płukania: Odessać całkowicie zawartość każdego dołka. Wlać µl rozcieńczonego buforu HRP do płukania do wszystkich dołków, a następnie go odessać. Powtórzyć tę sekwencję jeszcze dwukrotnie, aby łącznie przeprowadzić trzy płukania. Odwrócić płytkę i postukać w nią na materiale pochłaniającym w celu usunięcia pozostałości płynu po ostatnim płukaniu. Ważne jest, aby całkowicie opróżnić każdy dołek po każdym etapie płukania. Zachować tę samą sekwencję odsysania, jak w przypadku dodawania próbki. 4. Do każdego dołka dodać 100 μl koniugatu IgA HRP. Koniugat powinien być usunięty z butelek z zastosowaniem standardowych warunków aseptycznych oraz zalecanych technik laboratoryjnych. Pobrać z butelki jedynie wymaganą do analizy ilość koniugatu. ABY UNIKNĄĆ POTENCJALNEGO ZANIECZYSZCZENIA BAKTERYJNEGO I/LUB CHEMICZNEGO, NIE WOLNO WLEWAĆ NIEUŻYTEGO KONIUGATU Z POWROTEM DO BUTELKI. Inkubować dołki przez 30 minut jak w etapie Etap płukania: Powtórzyć etap Dodać 100 µl chromogenu TMB do każdego dołka i inkubować w ciemności przez 30 minut w temperaturze pokojowej. 7. Do każdego dołka dodać 100 µl roztworu zatrzymującego HRP. Zachować tę samą sekwencję i czas dodawania roztworu zatrzymującego HRP, jak w przypadku chromogenu TMB. Delikatnie postukać płytkę palcem, aby dokładnie wymieszać zawartość dołków. 8. Odczytać absorbancję (gęstość optyczną) każdego dołka przy długości fali 450 nm w ciągu jednej godziny od zatrzymania reakcji. Jeśli wymagane są pomiary bichromatyczne, referencyjną długością fali może być długość 620 nm. Kontrola jakości 1. Aby upewnić się, że wszystkie odczynniki i procedury funkcjonują prawidłowo, każdą serię próbek należy testować wraz ze słabo pozytywną kontrolą OMP Plus ELISA, wysoko pozytywną kontrolą OMP Plus ELISA i kontrolą negatywną ELISA. 2. Należy zauważyć, że ponieważ słabo pozytywna kontrola OMP Plus ELISA, wysoko pozytywna kontrola OMP Plus ELISA i kontrola negatywna ELISA są już wstępnie rozcieńczone, to nie będą one stanowić kontroli w przypadku procedur związanych z rozcieńczaniem próbek. 3. Dodatkowe kontrole mogą być przebadane zgodnie z wytycznymi lub wymaganiami lokalnych i/lub krajowych przepisów lub organów normalizacyjnych. Dodatkowe odpowiednie surowice kontrolne można przygotować, dzieląc połączone próbki surowicy ludzkiej i przechowując je w temperaturze < -20 C. 4. Aby wyniki badania mogły być uznane jako ważne, muszą zostać spełnione wszystkie poniższe kryteria. Jeśli jakiekolwiek kryterium nie będzie spełnione, badanie powinno być traktowane jako nieważne i powinno zostać powtórzone. a. Absorbancja wstępnie rozcieńczonej wysoko pozytywnej kontroli OMP Plus ELISA musi być większa niż absorbancja wstępnie rozcieńczonej słabo pozytywnej kontroli OMP Plus ELISA, która z kolei musi być większa niż absorbancja wstępnie rozcieńczonej kontroli negatywnej ELISA. b. Absorbancja wstępnie rozcieńczonej wysoko pozytywnej kontroli OMP Plus ELISA musi być większa niż 1,0, natomiast absorbancja wstępnie rozcieńczonej kontroli negatywnej ELISA nie może przekroczyć 0,2. c. Absorbancja wstępnie rozcieńczonej słabo pozytywnej kontroli OMP Plus ELISA musi być ponad dwukrotnie większa niż absorbancja kontroli negatywnej ELISA lub być większa niż 0,20. d. Kontrola negatywna ELISA i wysoko pozytywna kontrola OMP Plus ELISA mają za zadanie wykazać ewentualne istotne nieprawidłowe działanie odczynnika. Wysoko pozytywna kontrola OMP Plus ELISA nie zapewni dokładności przy wartości granicznej badania. e. Dodatkowe wytyczne dotyczące odpowiednich praktyk QC można znaleźć w dokumencie CLSI (NCCLS) C24-A2. Obliczanie wyników W pierwszej kolejności jest określana średnia gęstość optyczna każdego zestawu duplikatów. Reaktywność każdej próbki można następnie wyliczyć, dzieląc średnią gęstość optyczną próbki przez średnią gęstość optyczną słabo pozytywnej kontroli OMP Plus ELISA. Otrzymany wynik mnoży się przez znajdującą się na etykiecie liczbę jednostek przypisanych do słabo pozytywnej kontroli OMP Plus ELISA, która wynosi 25 jednostek. Gęstość optyczna próbki Wartość próbki = x słabo pozytywna kontrola OMP Plus ELISA (jednostki) gęstości optycznej słabo pozytywnej (25 jednostek) kontroli OMP Plus ELISA Reaktywność w sposób nieliniowy zależy od ilości obecnych przeciwciał. Wzrosty i spadki stężeń przeciwciał u pacjenta będą odzwierciedlone w analogicznym wzroście lub spadku reaktywności, jednak zmiana ta nie jest proporcjonalna (tzn. podwojenie stężenia przeciwciał nie oznacza podwojenia reaktywności). Jeśli wymagane jest dokładniejsze oszacowanie ilości przeciwciał pacjenta, należy przeprowadzić badanie seryjnych rozcieńczeń próbek pochodzących od pacjenta i ostatnie rozcieńczenie w ramach badania z wynikiem pozytywnym powinno być zaraportowane jako miano przeciwciał pacjenta. 4

5 Interpretacja wyników Badanie ELISA jest bardzo wrażliwe na technikę i jest w stanie wychwycić nawet najdrobniejsze różnice w populacjach pacjentów. Poniższe wartości są jedynie wartościami sugerowanymi. Każde laboratorium powinno ustalić własny normalny zakres na podstawie własnych technik, kontroli, sprzętu i populacji pacjentów, zgodnie z własnymi ustalonymi procedurami. Próbki uznaje się za dające wynik negatywny (negatywny pod względem przeciwciała IgA przeciwko OMP), niejednoznaczny lub pozytywny (wykryte zostaje przeciwciało IgA przeciwko OMP) w oparciu o poniższą tabelę. Jednostki Negatywny Niejednoznaczna Pozytywna Wynik pozytywny wskazuje na obecność przeciwciał IgA przeciwko OMP i sugeruje możliwość wystąpienia choroby Leśniowskiego-Crohna. 2. W przypadku próbek o niejednoznacznym poziomie przeciwciał OMP Plus nie można ustalić stanu wytwarzania przeciwciał. Jeśli wyniki nadal są niejednoznaczne po powtórzonym badaniu, wynik należy zaraportować jako niejednoznaczny i/lub pobrać dodatkową próbkę. 3. Wynik negatywny świadczy o tym, że nie występują przeciwciała IgA przeciwko OMP, lub że ich poziom jest poniżej granicy wykrywania dla tego testu. 4. W przypadku próbek o gęstości optycznej przewyższającej zakres odczytu czytnika płytek, można je zaraportować jako takie, których najwyższą mierzalną wartość gęstości optycznej dzieli się przez gęstość optyczną kontroli słabo pozytywnej i mnoży przez 25, lub można je rozcieńczyć, przebadać ponownie i wyliczyć pożądaną wartość. 5. Zalecane jest, aby wyniki raportowane przez laboratorium zawierały stwierdzenie: Poniższe wyniki otrzymano przy wykorzystaniu zestawu INOVA QUANTA Lite TM OMP Plus ELISA. Nie można stosować zamiennie wartości OMP uzyskanych przy zastosowaniu metod testowych innych producentów. Rząd wielkości raportowanych poziomów nie może być skorelowany z mianem punktu końcowego. Ograniczenia badania 1. Negatywny wynik OMP Plus nie wyklucza choroby Leśniowskiego-Crohna. 2. Negatywny wynik na obecność przeciwciał OMP Plus nie wyklucza obecności przeciwciał przeciwko OMP, ponieważ stężenie przeciwciał może być poniżej granicy wykrywania dla tego testu. 3. Wynik pozytywny świadczy jedynie o występowaniu przeciwciał przeciwko OMP i nie koniecznie może wskazywać na chorobę Leśniowskiego-Crohna. 4. Zdiagnozowanie choroby Leśniowskiego-Crohna wymaga zebrania dokumentacji dotyczącej danych demograficznych pacjenta, manifestacji klinicznej oraz innych badań diagnostycznych. 5. Nie ustalono w jaki sposób test ten sprawdza się w populacji dziecięcej. 6. Charakterystyka wyników badania nie została ustanowiona dla podłoża innego niż surowica. 7. Przy użyciu tego testu nie badano pacjentów cierpiących na zespół jelita drażliwego. Spodziewane wartości Oceny częstości występowania choroby Leśniowskiego-Crohna wahają się od 10 do 198/ Choroba ta występuje najczęściej w populacjach Europy Północnej i Ameryki Północnej. Choroba ta dotyka z prawie równą częstością kobiety jak i mężczyzn, a w przypadku około 20% osób cierpiących na chorobę Leśniowskiego-Crohna w ich rodzinie występuje jakaś postać IBD. Choroba Leśniowskiego-Crohna występuje 3-8 razy częściej w populacji Żydów Aszkenazyjskich niż w populacji ogólnej. W poprzedniej dekadzie pojawiło się kilka doniesień na temat wzrostu częstości występowania choroby Leśniowskiego- Crohna w różnych rejonach geograficznych. 5, 6 Normalny zakres Próbki pobrane od 500, uznanych za zdrowe, osób ze Stanów Zjednoczonych (250 mężczyzn i 250 kobiet) o medianie wieku wynoszącej 41 lat (rozpiętość wieku dawców wynosiła 18 do 80 lat) testowano przy użyciu zestawu QUANTA Lite OMP Plus ELISA. Otrzymana wartość mediany wynosiła 12,5 jednostki. Wartość graniczną badania ustalono na 25 jednostek. Dało to w rezultacie swoistość rzędu 94% (468/500). 5

6 Specyficzna charakterystyka wyników Panel 1186 surowic złożony z 365 próbek od pacjentów cierpiących na chorobę Leśniowskiego-Crohna i 821 od pacjentów nie cierpiących na tę chorobę, w tym od 234 pacjentów z wrzodziejącym zapaleniem okrężnicy i 587 zdrowych osób stanowiących kontrolę, badano stosując zarówno zestaw QUANTA Lite OMP Plus ELISA jak i predykatowy zestaw QUANTA Lite ASCA IgG ELISA. Dane demograficzne na temat populacji pacjentów były niedostępne. Służące do porównania metod klinicznych próbki CD, UC i próbki normalne pochodziły z Europy i Kanady. Porównanie z urządzeniem predykatowym QUANTA Lite ASCA IgG ELISA Pozyt. Negat. Łącznie Pozyt QUANTA Lite Negat OMP Plus ELISA Łącznie Wyniki niejednoznaczne liczone jako negatywne (tzn. niedodatnie) Procentowa zgodność wyników pozytywnych: 36,8% (117/318) Procentowa zgodność wyników negatywnych: 90,4% (785/868) Ogólna zgodność 76,1% ( /1186) Swoistość i wrażliwość kliniczna Ogółem przebadano 1186 surowic, w których skład wchodziło 365 próbek od pacjentów cierpiących na chorobę Leśniowskiego-Crohna i 821 od pacjentów nie cierpiących na tę chorobę (w tym od 234 pacjentów z wrzodziejącym zapaleniem okrężnicy i 587 zdrowych osób stanowiących kontrolę), stosując zarówno zestaw QUANTA Lite OMP Plus ELISA jak i zestawy QUANTA Lite ASCA IgG i ASCA IgA ELISA. Odróżnienie próbek pochodzących od pacjentów z chorobą Leśniowskiego-Crohna od innych próbek (wrzodziejące zapalenie okrężnicy i normalne próbki kontrolne) Choroba Leśniowskiego- Crohna Choroba inna niż choroba Leśniowskiego- N =1186 Crohna Łącznie QUANTA Lite OMP Plus ELISA pozyt Negat Łącznie Wyniki niejednoznaczne liczone jako negatywne (tzn. niedodatnie) Wrażliwość kliniczna: 37,5% (137/365) (95% CI, 0,325 do 0,427) Swoistość kliniczna: 92,3% (758/821) (95% CI, 0,903 do 0,941) Odróżnienie próbek pochodzących od pacjentów z chorobą Leśniowskiego-Crohna od próbek pochodzących od pacjentów z wrzodziejącym zapaleniem okrężnicy N = 599 Choroba Leśniowskiego- Crohna Wrzodziejące zapalenie okrężnicy Łącznie QUANTA Lite OMP Plus ELISA pozyt Negat Łącznie Wyniki niejednoznaczne liczone jako negatywne (tzn. niedodatnie) Wrażliwość kliniczna: 37,5% (137/365) (95% CI, 0,325 do 0,427) Swoistość kliniczna: 88,9% (208/234) (95% CI, 0,841 do 0,926) Na bazie wyników IgA OMP Plus, IgG ASCA i IgA ASCA stwierdzono, że wynik pozytywny dla wszystkich trzech markerów (wynik potrójnie pozytywny) wiąże się z czułością wynoszącą 25,5% (93/365), lecz specyficzność wynosi wówczas 99,5% (817/821), co zatem może posłużyć do wykluczenia" choroby Leśniowskiego-Crohna. Wynik pozytywny dla co najmniej 1 markera Wynik pozytywny dla co najmniej 2 markerów Wynik pozytywny dla 3 markerów Wrażliwość Swoistość Wrażliwość Swoistość Wrażliwość Swoistość 72.1% (263/365) 79.2% (652/821) 46% (168/365) 96.3% (791/821) 25.5% (93/365) 99.5% (817/821) 6

7 7

8 Reaktywność krzyżowa W celu określenia swoistości testu przebadano surowice pochodzące od 36 pacjentów z różnymi chorobami autoimmunologicznymi lub zakaźnymi, dającymi pozytywne wyniki pod względem przeciwciał towarzyszących, w tym 8 z przeciwciałami przeciwko reumatoidalnemu zapaleniu stawów, 2 z przeciwciałami przeciwko rozpuszczalnemu antygenowi wątrobowemu (SLA), 2 z przeciwciałami przeciwko mikrosomowi wątrobowo-nerkowemu (LKM), 2 z przeciwciałami przeciwko chromatynie, 2 z przeciwciałami przeciwko Jo- 1, 2 z przeciwciałami przeciwko centromerowi, 1 z przeciwciałami przeciwko SS-A, 2 z przeciwciałami przeciwko SS-B, 2 z przeciwciałami przeciwko mitochondrium (AMA), 2 z przeciwciałami przeciwko transglutaminazie tkankowej (ttg), 1 z przeciwciałami przeciwko Scl-10, 1 z przeciwciałami przeciwko RNP, 3 z przeciwciałami przeciwko błonie podstawnej kłębuszków nerkowych (GBM), 2 z przeciwciałami przeciwko wirusowi cytomegalii (CMV), 2 z przeciwciałami przeciwko wirusowi różyczki, 2 z przeciwciałami przeciwko wirusowi opryszczki pospolitej (HSV), wykorzystując do tego celu zestaw QUANTA Lite OMP Plus ELISA. W żadnym przypadku nie uzyskano wyniku pozytywnego, a tylko jedna próbka (pochodząca od pacjenta z autoimmunologicznym zapaleniem wątroby, wykazującego przeciwciała przeciwko SLA) dała wynik niejednoznaczny - 22,2 jednostki w teście OMP Plus ELISA. Dodatkowe badania wykazały, że próbka ta dała wynik średnio pozytywny pod względem IgG ASCA (76,1 jednostki) i wykazała niejednoznaczny poziom przeciwciał IgA ASCA. Surowice pochodzące od 226 pacjentów chorych na celiakię badano przy użyciu OMP Plus IgA ELISA i w 27% dały one wynik pozytywny. W tej samej grupie 27% dało wynik pozytywny dla przeciwciał IgA ASCA i 31% dla przeciwciał IgG ASCA. W przypadku 14 próbek pochodzących od pacjentów z celiakią (6,2%) uzyskano wynik potrójnie pozytywny (IgA OMP Plus, IgG ASCA i IgA ASCA). Precyzja i powtarzalność Precyzję w obrębie badania dla QUANTA Lite OMP Plus ELISA określono, przeprowadzając 8-krotne badanie 8 tych samych próbek i dołączonej do zestawu wysoko pozytywnej kontroli (HPC). Precyzja w obrębie badania dla QUANTA Lite OMP Plus ELISA Próbka A Próbka B Próbka C Próbka D Próbka E Próbka F Próbka G Próbka H Jednostki średnie 46,2 26,9 45,5 26,3 41,8 24,5 23,9 21,8 SD 1,17 0,78 2,91 0,72 0,93 0,86 0,83 0,46 CV % 2,5 2,9 6,4 2,8 2,2 3,5 3,5 2,1 Precyzję pomiędzy badaniami oceniono, przeprowadzając badanie 8 próbek i dołączonej do zestawu wysoko pozytywnej kontroli (HPC); dwa razy dziennie (rano i popołudniu) przez 3 dni, w dwóch powtórzeniach. Precyzja pomiędzy badaniami dla QUANTA Lite OMP Plus ELISA HPC Próbka 1 Próbka 2 Próbka 3 Próbka 4 Próbka 5 Próbka 6 Próbka 7 Próbka 8 Jednostki średnie 69,8 50,0 26,6 54,1 29,2 46,2 27,3 24,7 23,5 SD 2,35 0,74 0,89 2,23 1,07 1,63 1,14 1,07 0,89 CV % 3,4 1,5 3,4 4,1 3,7 3,5 4,2 4,3 3,8 8

9 Piśmiennictwo 1. Merck Manual of Diagnosis and Therapy Whitehouse Station, NJ. ( 2. National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases (NIDDK). Crohn s Disease. NIH Publication No , ( 3. Coche, J.-C. & Colombel, J.-F. Heterogeneity of Inflammatory Bowel Disease: Clinical Subgroups of Patients. Res. Clin. Forums 20, (1998). 4. Bernstein, C. N., Blanchard, J. F., Rawsthorne, P. & Wajda, A. Epidemiology of Crohn's disease and ulcerative colitis in a central Canadian province: a population-based study. Am J Epidemiol 149, (1999). 5. Loftus, E. V., Jr. et al. Crohn's disease in Olmsted County, Minnesota, : incidence, prevalence, and survival. Gastroenterology 114, (1998). 6. Niv, Y., Abuksis, G. & Fraser, G. M. Epidemiology of Crohn's disease in Israel: a survey of Israeli kibbutz settlements. Am J Gastroenterol 94, (1999). 7. Joossens, S. et al. The value of serologic markers in indeterminate colitis: a prospective follow-up study. Gastroenterology 122, (2002). 8. Rutgeerts, P. & Vermeire, S. Clinical value of the detection of antibodies in the serum for diagnosis and treatment of inflammatory bowel disease. Gastroenterology 115, (1998). 9. Norman, G. Anti- Saccharomyces cerevisiae antibodies in inflammatory bowel disease. Clin Applied Immunol Rev 2, (2001). 10. Sendid, B. et al. Anti-Saccharomyces cerevisiae mannan antibodies in familial Crohn's disease. Am J Gastroenterol 93, (1998). 11. Landers, C. J. et al. Selected loss of tolerance evidenced by Crohn's disease-associated immune responses to auto- and microbial antigens. Gastroenterology 123, (2002). 12. Sutton, C. L. et al. Identification of a novel bacterial sequence associated with Crohn's disease. Gastroenterology 119, (2000). 13. Papp, M., et al. New Serological Markers for Inflammatory Bowel Disease are Associated with Earlier Age at Onset, Complicated Disease Behavior, Risk for Surgery, and NOD2/CARD15 Genotype in a Hungarian IBD Cohort. Am J. Gastroenterol 102:1-17 (2007). 14 Ferrante, M. et al. New Serological Markers in inflammatory Bowel Disease are associated with complicated disease behaviour. Gut 56: (2007). 15. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Centers for Disease Control and Prevention/National Institutes of Health, Fifth Edition, QUANTA Lite jest zastrzeżonym znakiem handlowym firmy INOVA Diagnostics, Inc. Copyright Wszelkie prawa zastrzeżone Wyprodukowano przez: INOVA Diagnostics, Inc Old Grove Road San Diego, CA Stany Zjednoczone Ameryki Pomoc techniczna (tylko na terenie Stanów Zjednoczonych i Kanady): Pomoc techniczna (poza terenem Stanów Zjednoczonych): support@inovadx.com Autoryzowani przedstawiciele na terenie Unii Europejskiej: Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D St. Ingbert, Niemcy Tel.: Faks.: POL Marzec 2011 Wersja 0 9