NOVA Lite IgG F-Actin Tylko na eksport. Nie na sprzedaż w Stanach Zjednoczonych. Do diagnostyki in vitro Złożoność CLIA: Wysoka

Transkrypt

1 NOVA Lite IgG F-Actin Tylko na eksport. Nie na sprzedaż w Stanach Zjednoczonych. Do diagnostyki in vitro Złożoność CLIA: Wysoka Przeznaczenie Zestaw NOVA Lite IgG F-Actin jest bezpośrednim badaniem immunofluorescencyjnym (IFA) wykonanym na substracie nabłonka jelita szczura w celu przesiewowym oraz pół-ilościowego oznaczania przeciwciał aktynie F IgG w ludzkiej surowicy. Obecność przeciwciał IgG przeciw- F-aktynie może być stosowane w połączeniu z objawami klinicznymi i innymi badaniami laboratoryjnymi w celu pomocy w diagnostyce chorób autoimmunologicznych wątroby, takich jak autoimmunologiczne zapalenie wątroby (AIH) i pierwotnej marskości żółciowej (PBC). Podsumowanie i wyjaśnienie testu Autoprzeciwciała IgG przeciw F-Aktynie są główną składową wśród tych, które zostały nazwane przeciwciałami przeciwko mięśniom gładkim (ASMA). 1-6 Przeciwciała te występują u 80% przypadków pacjentów z autoimmunologicznym zapaleniem wątroby (AIH) i do 30% pacjentów z pierwotną marskością żółciową 2,6, ale można je także stwierdzić, zwykle w niskich mianach u osób bez AIH. ASMA są zróżnicowane i obejmują przeciwciała przeciwko nitkowatym (F) i kulistym (G) postaciom aktyny jak i nie-aktynowym elementom, takim jak tubulina i filamentom pośrednim. 3,4,7 Kilka autoprzeciwciał związanych jest z AIH. Jednakże przeciwciała IgG przeciw aktynie F są najbardziej swoistymi autoprzeciwciałami dla AIH. 2,5 Podczas gdy badania ELISA przeciwciał IgG przeciw F-aktynie takie jak QUANTA Lite Actin IgG ELISA, umożliwiają wykrycie przeciwciał IgG przeciw aktynie w sposób obiektywny i wymierny, niektóre laboratoria w celu przesiewowym na obecność przeciwciał IgG przeciw F aktynie preferują metodologię IFA lub potwierdzenie ich obecności w sytuacji, kiedy zostanie potwierdzona ich obecność na konwencjonalnych skrawkach tkankowych nerki/żołądka/wątroby gryzoni. Zróżnicowanie przeciwciał przeciw F-aktynie spośród innych przeciwciał przeciw składnikom mięśni gładkich jest często trudne przy wykorzystaniu konwencjonalnych substratów IFA takich jak skrawki tkankowe KSL. 2,5 Identyfikacja przeciwciał przeciw F-aktynie, jest istotną pomocą w rozpoznawaniu AIH. Obecnie nie jest dostępna metoda będąca "złotym standardem" dyskryminacji przeciwciał przeciw F-aktynie z innych reaktywności. 1,2 Preparaty uzyskane komórki nabłonka jelita szczura przy wykorzystaniu zastrzeżonych metod wzrostu i wiązania oferują nowe substraty do wykrywania przeciwciał IgG-przeciw F-aktynie poprzez IFA. Substrat ten pokonuje niektóre z ograniczeń innych procedur IFA odkąd wzór IgG przeciw aktynie jest odrębny, a inne przeciwciała, które powodują zakłócenia wzoru skrawków KSL nie wpływają na substrat komórek nabłonka szczura. Zasada badania W przypadku pośredniej techniki immunofluorescencji próbki są inkubowane z substratem antygenu, a przeciwciała, które nie weszły w reakcję, są wypłukiwane. Substrat jest następnie inkubowany ze swoistą fluoresceiną oznakowaną koniugatem, a następnie płukanie w celu usunięcia niezwiązanego odczynnika. Próbki zawierające autoprzeciwciała obserwowane pod mikroskopem fluorescencyjnym będą wykazywać jasnozieloną fluorescencyjną barwę zależnie od obszarów, gdzie nastąpiło związanie autoprzeciwciał. Próbkę uznaje się za pozytywną, jeżeli swoiste zabarwienie obserwowane włóknach F- aktyny otacza większość komórek we wzorcu heksagonalnym, a niekiedy obserwuje się ją we włóknach krzyżujących się nad komórkami. 1

2 Odczynniki 1. Preparaty F-aktyny; 6 dołków/preparatów, wraz z osuszaczem 2. Koniugat IgG przeciw-ludzkich (kozi), 1 fiolka, znakowany fluoresceiną w buforze zawierającym błękit Evansa i 0,09% azydku sodu 3. Pozytywna kontrola IgG aktyny F, 1 fiolka, buforu zawierającego 0,09% azydku sodu i ludzkie przeciwciała w surowicy przeciwko aktynie F, wstępnie rozcieńczona 4. Negatywna kontrola systemu IFA, 1 fiolka buforu zawierającego 0,09% azydku sodu i ludzkie przeciwciała w surowicy przeciwko aktynie F, wstępnie rozcieńczone 5. Koncentrat PBS (40x), 2 fiolka 6. Środek do osadzania preparatu, 1 fiolka, azydek sodu 0,09% 7. Szkiełka nakrywkowe Ostrzeżenia 1. Wszystkie materiały pochodzenia ludzkiego używane w przygotowywaniu kontroli dla tego produktu zostały przetestowane i na podstawie metod zatwierdzonych przez FDA stwierdzono że nie zawierają przeciwciał przeciwko HIV, HBsAg i HCV. Jednak żadna metoda testowania nie może całkowicie zagwarantować braku obecności HIV, HBV, HCV lub innych czynników zakaźnych. Dlatego system kontroli pozytywnej IgG F aktyny oraz system negatywnej kontroli IFA powinien być traktowany w taki sam sposób jak materiał potencjalnie zakaźny Jako konserwant stosowany jest azydek sodu. Azydek sodu jest trucizną i może być toksyczny w przypadku połknięcia lub wchłonięcia przez skórę lub oczy. Azydek sodu może wchodzić w reakcję z ołowianą lub miedzianą instalacją wodociągową, tworząc potencjalnie wybuchowe azydki metali. Jeśli do usuwania odczynników używane są zlewy, należy przepłukiwać je dużą ilością wody, aby nie dopuścić do gromadzenia się azydku. 3. Podczas pracy z dostarczonymi odczynnikami należy stosować odpowiednie środki ochrony osobistej. 4. Rozlane odczynniki należy natychmiast usunąć. Należy przestrzegać wszystkich krajowych i lokalnych przepisów w zakresie utylizacji odpadów. Środki ostrożności 1. Ten produkt jest przeznaczony do diagnostyki in vitro. 2. Zastąpienie składników dostarczonych w tym zestawie innymi składnikami może skutkować osiągnięciem niespójnych wyników. 3. Niekompletne lub nieskuteczne wypłukanie dołków IFA może spowodować wysoki poziom tła. 4. Dostosowanie tego badania do stosowania ze zautomatyzowanymi analizatorami próbek oraz innymi urządzeniami do pracy z płynami, w całości lub w części, może skutkować rozbieżnością wyników w stosunku do badań przeprowadzanych ręcznie. Obowiązkiem każdego laboratorium jest potwierdzenie, że wyniki testów uzyskanych na podstawie zautomatyzowanych badań mieszczą się w akceptowalnych limitach. 5. Na wyniki analizy wpływa wiele różnych czynników. Obejmują one temperaturę początkową odczynników, moc lampy używanego mikroskopu, dokładność i powtarzalność techniki pipetowania, dokładność płukania oraz czasy trwania inkubacji podczas badania. Uzyskanie dokładnych i powtarzalnych wyników wymaga staranności i precyzji. 6. Zalecane jest ścisłe przestrzeganie procedury testowej. Warunki przechowywania 1. Przechowywać wszystkie odczynniki zestawu w temperaturze 2-8 C. Nie zamrażać. Odczynniki są trwałe do daty ważności, pod warunkiem, że są przechowywane i używane zgodnie z instrukcjami. 2. Rozcieńczony bufor do płukania jest stabilny przez 4 tygodnie w temperaturze 2 8 C. 2

3 Pobieranie próbek Ta procedura powinna być wykonana z próbką surowicy. Dodanie azydku lub innych konserwantów do próbek analitycznych może mieć negatywny wpływ na wyniki. Nie używać próbek zawierających widoczne zanieczyszczenia, podgrzanych, rażąco zhemolizowanych lub lipemicznych zawierających widoczne cząstki. Po pobraniu surowica powinna być oddzielona od skrzepu. Dokument CLSI (NCCLS) H18-A3 zaleca następujące warunki przechowywania próbek: 1) Przechowywać próbki w temperaturze pokojowej nie dłużej niż 8 godzin. 2) Jeżeli test nie zostanie zakończony w ciągu 8 godzin, próbki należy przechowywać w lodówce w temperaturze 2-8 C. 3) Jeśli badanie nie zostanie ukończone w ciągu 48 godzin lub w przypadku transportu próbki, należy zamrozić ją w temperaturze -20 C lub niższej. Zamrożone próbki po rozmrożeniu i przed badaniem muszą zostać dobrze wymieszane. Badanie Dostarczone materiały 5 6-dołków dla preparatów aktyny F 1 7 ml koniugatu FITC przeciwko-ludzkiej IgG 1 0,8 ml pozytywnej kontroli IgG aktyny F 1 0,5 ml negatywna kontrola systemu IFA 2 25 ml koncentrat PBS (40x) 1 7 ml środek do osadzania preparatu 1 opakowanie 10 szkiełek nakrywkowych Wymagane materiały nie dołączone do zestawu Mikropipety o objętości μL Woda destylowana lub dejonizowana Gruszki laboratoryjne lub pipety Pasteura Komora wilgotna Pojemnik 1 l (do rozcieńczania PBS) Barwiacz Coplina Mikroskop fluorescencyjny z filtrem wzbudzającym 495 nm i filtrem barierowym 515 nm Sposób przygotowania Przed rozpoczęciem 1. Doprowadzić wszystkie odczynniki i próbki do temperatury pokojowej (20-26 o C). 2. Rozcieńczyć koncentrat PBS: WAŻNE: Rozcieńczyć koncentrat PBS w stosunku 1:40, dodając zawartość butelki koncentratu PBS do 975 ml wody destylowanej lub dejonizowanej i dokładnie wymieszać. Bufor PBS jest używany do rozcieńczania próbek pacjentów oraz jako bufor do płukania. Rozcieńczony bufor może być przechowywany maksymalnie przez 4 tygodnie w temperaturze 2-8 C. 3. Rozcieńczyć próbki pobrane od pacjenta: a. Wstępne badanie przesiewowe: Rozcieńczyć próbki pacjentów rozcieńczonym buforem fosforanowym 1:40 (np. dodać 50 μl surowicy do 1,95 ml buforu fosforanowego). b. Miareczkowanie: Wykonać serię 2-krotnych rozcieńczeń od początkowego przesiewowego rozcieńczenia dla wszystkich pozytywnych próbek za pomocą rozcieńczonego buforu fosforanowego (np. 1:80, 1:160, 1: do punktu końcowego). 3

4 Procedura badania 1. Przygotować preparat substratu: Preparaty substratu przed wyjęciem z woreczka muszą osiągnąć temperaturę pokojową. Oznaczyć ołówkiem i umieścić w odpowiedniej komorze wilgotnej. Dodać 1 kroplę (20 25 μl) nierozcieńczonej kontroli pozytywnej i negatywnej, odpowiednio do dołka 1 i 2. Dodać 1 kroplę (20 25 μl) rozcieńczonej próbki pacjenta do pozostałych dołków. 2. Inkubacja preparatu: Inkubować preparat przez 30 ± 5 minut w komorze wilgotnej (zwilżony ręcznik papierowy włożony na płasko na spodzie zamkniętej torebki lub szklanego pojemnika zapewni odpowiednie warunki wilgotności). Nie dopuścić do wyschnięcia substratu podczas badania. 3. Wypłukać preparaty: Po inkubacji użyć plastikowej gruszki laboratoryjnej lub pipety, aby delikatnie przepłukać surowicę rozcieńczonym buforem PBS. Ustawić preparat oraz strumień bufora PBS w taki sposób, aby ograniczyć wypłukiwanie próbek między dołkami. Unikać kierowania strumienia bezpośrednio na dołki, aby nie dopuścić do uszkodzenia substratu. Jeśli jest to wymagane, można umieścić preparaty na maks. 5 minut w barwiaczu Coplina z rozcieńczonym buforem PBS. 4. Dodanie koniugatu fluorescencyjnego: Strząsnąć nadmiar buforu PBS. Umieścić preparat z powrotem w komorze wilgotnej i natychmiast przykryć każdy dołek kroplą koniugatu fluorescencyjnego. Inkubować preparaty przez dodatkowe 30 ± 5 minut. 5. Wypłukać preparaty: Powtórzyć etap Szkiełko nakrywkowe: Procedura nakładania szkiełek nakrywkowych różni się w zależności od laboratorium. Zalecana jest poniższa procedura: a. Umieścić szkiełko nakrywkowe na ręczniku papierowym. b. Nanieść środek do osadzania preparatu w formie ciągłej linii na dolnej krawędzi szkiełka nakrywkowego. c. Strząsnąć nadmiar buforu PBS i zetknąć dolną krawędź preparatu z krawędzią szkiełka nakrywkowego. Delikatnie opuścić preparat na szkiełko nakrywkowe, w taki sposób, aby środek do osadzania preparatu rozpłynął się do górnej krawędzi preparatu bez formowania pęcherzyków powietrza. Kontrola jakości System pozytywnej kontroli IgG aktyny F oraz system negatywnej kontroli IFA powinny być przeprowadzone na każdym preparacie, aby zapewnić, że wszystkie odczynniki i procedury są wykonane poprawnie. Dodatkowe odpowiednie surowice kontrolne można przygotować dzieląc połączone próbki surowicy ludzkiej i przechowując je w temperaturze < -70 o C. Aby wyniki badania mogły być uznane jako ważne, muszą zostać spełnione wszystkie poniższe kryteria. Jeśli jakiekolwiek kryterium nie będzie spełnione, wyniki badania powinny być traktowane jako nieważne i badanie powinno zostać powtórzone. 1. Nierozcieńczona pozytywna kontrola IgG aktyny F musi być > System kontroli negatywnej IFA musi być negatywny. Interpretacja wyników Reakcja negatywna. Próbka uznawana jest za negatywną, jeżeli swoiste zabarwienie, jak opisano poniżej w sekcji "Reakcja pozytywna" jest mniejsze lub równe systemowi kontroli negatywnej IFA. Próbki mogą wykazywać różne stopnie swoistego zabarwienia lub zabarwienia tła do innych składników komórkowych, ale być negatywne dla przeciwciał IgG przeciwko aktynie F. Reakcja pozytywna: Próbkę uznaje się za pozytywną, jeżeli swoiste zabarwienie o większej intensywności niż negatywna kontrola systemu IFA obserwowana na włóknach F aktyny otacza większość komórek we wzorcu heksagonalnym, a niekiedy obserwuje się ją we włóknach krzyżujących się nad komórkami. 4

5 Ustalić stopień fluorescencji lub intensywności za pomocą tych kryteriów: 4+ Jaskrawo jasnozielona fluorescencja 3+ Jasna jasnozielona fluorescencja 2+ Wyraźnie rozpoznawalna pozytywna fluorescencja 1+ Najniższa swoista fluorescencja, która umożliwia dokładne różnicowanie barwienia aktyny F od fluorescencji tła. Interpretacja wzoru: Różnorodność wzorów barwienia materiałów jądrowych i/lub cytoplazmatycznych może być przedstawiana w zależności od rodzaju i względnej ilości autoprzeciwciał obecnych w próbce. Tylko wzór opisany powyżej w rubryce "pozytywna reakcja" należy uznać za korzystny dla przeciwciał IgG przeciwko aktynie F. Wszystkie inne wzory powinny być uważane za negatywne. Ograniczenia badania 1. Wysokie-miano IgG przeciwko aktynie F sugeruje rozpoznanie AIH, ale nie powinno być traktowane jako diagnostyczne. Wynik IgG przeciwko aktynie F należy rozpatrywać w połączeniu z innymi wyniki badań laboratoryjnych, jak również ogólną historią kliniczną pacjenta. 2. Wiele różnych czynników zewnętrznych ma wpływ na wrażliwość testu, np. typ używanego mikroskopu fluorescencyjnego, moc i wiek lampy, stosowane powiększenie, system filtrów oraz badacz. 3. Jeśli zamiast filtra barierowego 515nm używany jest filtr środkowo-przepustowy, może wystąpić zwiększone zabarwienie artefaktowe. 4. Do opisywania preparatów należy stosować wyłącznie ołówek. Stosowanie innego przyrządu do pisania może spowodować zabarwienie artefaktowe. 5. Wszystkie barwiacze Coplina stosowane do płukania preparatów nie powinny zawierać żadnych pozostałości barwników. Używanie barwiaczy Coplina zawierających pozostałości barwników może spowodować zabarwienie artefaktowe. 6. Charakterystyka wyników badania została ustalona dla surowicy, ale nie dla osocza lub innych rodzajów próbek. Spodziewane wartości Zdolność zestawu NOVA Lite IgG F-Actin do wykrywania przeciwciał IgG aktyny F była oceniana przez porównanie do dostępnych na rynku QUANTA Lite F-Actin IgG ELISA (INOVA Diagnostics, Inc). Wyniki ELISA określono jako dodatnie, jeśli próbka pacjenta wynosiła 20 lub więcej, a negatywna, jeśli mniej niż 20 jednostek. Normalny zakres Czterysta dziewięćdziesiąt trzy próbki od zdrowych dawców krwi były wykonywane za pomocą zestawu NOVA Lite IgG F-Actin. Wszystkie oprócz 4 spośród 493 prawidłowych próbek (swoistość 99,2%) było negatywne w teście NOVA Lite IgG F-Actin. 5

6 Porównanie pomiędzy testem NOVA Lite IgG F-Actin IFA oraz QUANTA Lite F-Actin IgG ELISA Aby określić zgodność testów pozytywną i negatywną, badano 992 próbki zawierające przeciwciała z różnorodnymi antygenami NOVA Lite IgG F-Actin zestawu IFA i QUANTA Lite Actin IgG ELISA. Próbki te obejmujące 493 zdrowych dawców krwi, 60 pacjentów z klinicznie zdefiniowanymi chorobami (reumatoidalne zapalenie stawów, SLE, twardzina), 40 próbek z określonymi przeciwciałami (choroby zakaźne i autoprzeciwciała) oraz 399 próbek od pacjentów z podejrzeniem choroby wątroby. N= 992 QUANTA Lite Actin IgG ELISA Pozytywna QUANTA Lite Actin IgG ELISA Negatywny Łącznie NOVA Lite IgG F-Actin Pozytywna ** 290 NOVA Lite IgG F-Actin Negatywny 69* Łącznie Zgodność % pozytywna 269/338 (80%) Zgodność % negatywna 633/654 (97%) Zgodność % całkowita 902/992 (91%) *39 spośród 69 było słabo pozytywna ELISA ** 14 spośród 21 było 1+ IFA (niska reaktywność) NOVA Lite, QUANTA Lite i INOVA Diagnostics, Inc, są zastrzeżonymi znakami towarowymi. All Rights Reserved Copyright

7 Piśmiennictwo 1. Chretien-Leprince P, Ballot E, Andre C, et al. Diagnostic value of anti-f-actin antibodies in a French multicenter study. Ann NY Acad Sci 1050: , Villalta D, Bizzaro N, Da Re M, et al. Diagnostic accuracy of four different immunological methods for the detection of anti-f-actin autoantibodies in type 1 autoimmune hepatitis and other liver related disorders. Autoimmunity 41: , Czaja A, Norman G: Autoantibodies in the diagnosis and management of liver disease. J Clin Gastroenterol 37: , Toh BH. Smooth muscle autoantibodies and autoantigens. Clin exp Immunol 38: , Fusconi M, Cassani F, Zauli D, et al. Anti-actin antibodies: a new test for an old problem. Journal of Immunological Methods 130: 1-8, Granito A, Muratori L, Muratori P, et al. Antibodies to filamentous actin (F-actin) in type 1 autoimmune hepatitis. J Clin Path 59: , Dighiero G, Lymberi P, Monot C. Sera with high levels of anti-smooth muscle and antimitochondrial antibodies frequently bind to cytoskeleton proteins. Clin exp Immunolol 82: 52-56, Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Centers for Disease Control/National Institute of Health, 2007, Fifth Edition. 7

8 Wyprodukowano przez: INOVA Diagnostics, Inc Old Grove Road San Diego, CA Stany Zjednoczone Ameryki Pomoc techniczna (tylko na terenie Stanów Zjednoczonych i Kanady): Pomoc techniczna (poza terenem Stanów Zjednoczonych): support@inovadx.com Autoryzowani przedstawiciele na terenie Unii Europejskiej: Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D St. Ingbert, Niemcy Tel.: Faks.: POL Sierpień 2011 Wersja 0 8