QUANTA Lite dsdna ELISA Test ELISA dwuniciowego DNA Do diagnostyki in vitro Złożoność CLIA: Wysoka

Transkrypt

1 QUANTA Lite dsdna ELISA Test ELISA dwuniciowego DNA Do diagnostyki in vitro Złożoność CLIA: Wysoka Przeznaczenie Test ELISA QUANTA Lite dsdna ELISA jest testem immunoenzymatycznym (ELISA) do półilościowego wykrywania autoprzeciwciał dsdna w surowicy ludzkiej. W połączeniu z wynikami klinicznymi i innymi testami laboratoryjnymi do wspomagania diagnozy toczenia rumieniowatego układowego (SLE) wykorzystać można badanie na obecność przeciwciał przeciw dsdna. Podsumowanie i wyjaśnienie testu Przeciwciała przeciwjądrowe (ANA) występują w różnorodnych chorobach tkanki łącznej i jako takie stanowią wrażliwy obiekt badania przesiewowego. 1 Pomimo tego, że badanie ANA jest doskonałym badaniem przesiewowym dla SLE (wynik negatywny praktycznie wyklucza aktywne SLE) 2, w żadnym wypadku nie jest to badanie swoiste. Przeciwciała przeciwko dsdna występują niemal wyłącznie u pacjentów z SLE i są traktowane jako przeciwciała markera dla tej choroby. Obecność przeciwciał przeciwko dsdna zdecydowanie wskazuje na SLE, jednak brak tych przeciwciał w żadnym wypadku nie wyklucza SLE. Autoprzeciwciała przeciwko dsdna zostały w 1982 roku uwzględnione w zweryfikowanych kryteriach klasyfikacji SLE przez podkomitet Stowarzyszenia ds. reumatologii i zapalenia stawów. 3 Do wykrywania przeciwciał przeciwko dsdna używane są różnorodne metody, a w tym test immunofluorescencyjne, 4 badania radioimmunologiczne, 5 pasywna aglutynacja 6 oraz wiązanie dopełniacza 7. Zostały również opracowane klinicznie przydatne testy ELISA umożliwiające wykrywanie przeciwciał dsdna. 8,9,10,11 Technika ELISA wykorzystywana w tych badaniach jest obiektywna, półilościowa i może być dogodnie wykorzystywana do badania dużej liczby pacjentów. Oprócz tego, dzięki użyciu oczyszczonego dsdna jako substratu, zostały wyeliminowane fałszywe pozytywne rezultaty spowodowane obecnością przeciwciał przeciwko jednoniciowemu DNA, histonom lub dezoksynukleoproteinie. Zasada badania Mocno oczyszczone dsdna z grasicy cielęcej wiąże się z dołkami płytek polistyrenowych w warunkach, które zabezpieczają antygen w jego naturalnym stanie. Wstępnie rozcieńczone kontrole oraz surowice pacjentów są dodawane do oddzielnych dołków umożliwiając związanie wszelkich występujących przeciwciał przeciwko dsdna z unieruchomionym antygenem. Niezwiązana próbka jest wypłukiwana i do każdego dołka dodawany jest koniugat znakowanego enzymem przeciwciała przeciw-ludzkiego IgG. Druga inkubacja umożliwia przeciwciałom przeciw-ludzkim IgG znakowanym enzymem związać się z dowolnymi przeciwciałami pacjenta, które zostały przytwierdzone do mikrodołków. Po wypłukaniu wszelkich niezwiązanych przeciwciał przeciw-ludzkich IgG znakowanych enzymem, aktywność pozostałego enzymu bada się dodając substrat chromogeniczny i mierząc intensywność powstałej barwy. Badanie może zostać ocenione spektrofotometrycznie, poprzez zmierzenie i porównanie intensywności barwy, która powstaje w dołkach z próbkami od pacjenta z barwą dołków kontrolnych. Odczynniki 1. Polistyrenowa płytka z mikrodołkami ELISA pokryta mocno oczyszczonym antygenem dsdna grasicy cielęcej (12-1 x 8 dołków), z uchwytem, w torebce foliowej zawierającej osuszacze 2. Ujemna kontrola ELISA, 1 fiolka buforu zawierająca środek konserwujący i surowicę ludzką bez ludzkich przeciwciał przeciwko dsdna, wstępnie rozcieńczone, 1,2 ml 3. Pozytywne dsdna ELISA, 1 fiolka buforu zawierającego konserwant i przeciwciała surowicy ludzkiej przeciwko dsdna, wstępnie rozcieńczone, 1,2 ml 4. Kalibrator dsdna ELISA, 1 fiolka buforu zawierającego konserwant i przeciwciała surowicy ludzkiej przeciwko dsdna, wstępnie rozcieńczone, 1,2 ml 5. Rozcieńczalnik do próbek HRP, 1 fiolka zabarwienie różowe, zawiera sól fizjologiczną buforowaną TRIS, Tween 20, stabilizatory białka i konserwant, 50 ml 6. Koncentrat do płukania HRP, 1 fiolka koncentratu 40x zabarwienie czerwone, zawiera sól fizjologiczną buforowaną TRIS i Tween 20, 25 ml. Instrukcje dotyczące rozcieńczania można znaleźć w sekcji Metody. 7. Koniugat HRP IgG, (kozi), przeciwciała przeciw-ludzkie IgG, 1 fiolka zabarwienie niebieskie, zawiera bufor, stabilizatory białka i konserwant, 10 ml 8. Chromogen TMB, 1 fiolka zawierająca stabilizatory, 10 ml 9. Roztwór zatrzymujący HRP, 1 fiolka, kwas siarkowy 0.344M, bezbarwny, 10 ml 1

2 Ostrzeżenia 1. OSTRZEŻENIE: Ten produkt zawiera substancję chemiczną (chloramfenikol 0,02%) w rozcieńczalniku do próbek, kontrolach i koniugacie, która według stanu Kalifornii wywołuje raka. 2. Wszystkie materiały pochodzenia ludzkiego używane w przygotowywaniu kontroli dla tego produktu zostały przetestowane i na podstawie metod zatwierdzonych przez FDA stwierdzono że nie zawierają przeciwciał przeciwko HIV, HBsAg i HCV. Jednak żadna metoda testowania nie może całkowicie zagwarantować braku obecności HIV, HBV, HCV lub innych czynników zakaźnych. W związku z tym, kalibrator dsdna, kontrola pozytywna dsdna ELISA i negatywna ELISA powinny być obsługiwane w taki sam sposób, jak potencjalnie zakaźny materiał Jako konserwant stosowany jest azydek sodu. Azydek sodu jest trucizną i może być toksyczny w przypadku połknięcia lub wchłonięcia przez skórę lub oczy. Azydek sodu może wchodzić w reakcję z ołowianą lub miedzianą instalacją wodociągową, tworząc potencjalnie wybuchowe azydki metali. Jeśli do usuwania odczynników używane są zlewy, należy przepłukiwać je dużą ilością wody, aby nie dopuścić do gromadzenia się azydku. 4. Koniugat HRP zawiera rozcieńczoną trującą/korozyjną substancję chemiczną, która może być toksyczna w przypadku spożycia w dużej ilości. Aby uniknąć potencjalnych oparzeń chemicznych, należy unikać kontaktu ze skórą i oczami. 5. Chromogen TMB zawiera środek drażniący, w który może być szkodliwy w przypadku wdychania, spożycia lub wchłonięcia przez skórę. Aby uniknąć urazów, należy unikać wdychania, spożycia lub kontaktu ze skórą i oczami. 6. Roztwór zatrzymujący HRP składa się z rozcieńczonego roztworu kwasu siarkowego. Unikać wystawienia na działanie zasad, metali lub innych związków, które mogą wchodzić w reakcje z kwasami. Kwas siarkowy jest trucizną i ma właściwości korozyjne. W razie połknięcia może być toksyczny. Aby uniknąć oparzeń chemicznych, należy unikać kontaktu ze skórą i oczami. 7. Podczas pracy z dostarczonymi odczynnikami należy stosować odpowiednie środki ochrony osobistej. 8. Rozlane odczynniki należy natychmiast usunąć. Należy przestrzegać wszystkich krajowych i lokalnych przepisów w zakresie utylizacji odpadów. Środki ostrożności 1. Ten produkt jest przeznaczonych do zastosowań diagnostycznych in vitro. 2. Zastąpienie składników dostarczonych w tym systemie innymi składnikami może skutkować osiągnięciem niespójnych wyników. 3. Niepełne lub nieprawidłowe płukanie i niewystarczające usunięcie płynu z płytek z dołkami ELISA wpłynie negatywnie na precyzję badań i/lub spowoduje wysoki poziom tła. 4. Dostosowanie tego badania do stosowania ze zautomatyzowanymi analizatorami próbek oraz innymi urządzeniami do pracy z płynami, w całości lub w części, może skutkować rozbieżnością wyników w stosunku do badań przeprowadzanych ręcznie. Obowiązkiem każdego laboratorium jest potwierdzenie, że wyniki testów uzyskanych na podstawie zautomatyzowanych badań mieszczą się w akceptowalnych limitach. 5. Na wyniki analizy wpływa wiele różnych czynników. Obejmują one temperaturę początkową odczynników, temperaturę otoczenia, dokładność i powtarzalność techniki pipetowania, dokładność płukania i usuwania płynu z dołków płytek ELISA, fotometr użyty do analizy wyników oraz czasy trwania inkubacji podczas badania. Uzyskanie dokładnych i powtarzalnych wyników wymaga staranności i precyzji. 6. Zalecane jest ścisłe przestrzeganie procedury testowej. 7. Niedokładne zamknięcie torebki z zamknięciem strunowym, zawierającej płytki z mikrodołkami i osuszaczami, spowoduje degradację antygenu i brak precyzji badania. 8. Dwukrotne lub wielokrotne użycie koniugatu HRP z jednej butelki w pewnym okresie czasu może spowodować niedopuszczalnie niski poziom absorbancji. Aby nie dopuścić do takiej sytuacji istotne jest przestrzeganie wszystkich zaleceń dotyczących procedur pracy z koniugatem HRP. 9. Zanieczyszczenie chemiczne koniugatu HRP, kalibratora dsdna ELISA lub kontroli pozytywnej dsdna może być spowodowane nieprawidłowym czyszczeniem lub płukaniem sprzętu lub narzędzi. Pozostałości typowych laboratoryjnych substancji chemicznych, takich jak formalina, substancja wybielająca, etanol lub detergent, z czasem spowodują degradację koniugatu HRP, kalibratora dsdna ELISA lub kontroli pozytywnej dsdna. Po użyciu chemicznych substancji czyszczących/dezynfekujących dokładnie wypłukać cały sprzęt i wszystkie narzędzia. 2

3 Warunki przechowywania 1. Wszystkie odczynniki z zestawu przechowywać w temperaturze 2 8 C. Nie zamrażać. Odczynniki są trwałe do daty ważności, pod warunkiem, że są przechowywane i używane zgodnie z instrukcjami. 2. Nieużyte płytki z mikrodołkami pokrytymi antygenem powinny być starannie zamknięte w torebce foliowej z osuszaczami i przechowywane w temperaturze 2 8 C. 3. Rozcieńczony bufor do płukania zachowuje trwałość przez 1 tydzień w temperaturze 2 8 C. Pobieranie próbek Ta procedura powinna być wykonana z próbką surowicy. Dodanie azydku lub innych konserwantów do próbek analitycznych może mieć negatywny wpływ na wyniki. Nie używać próbek zawierających widoczne zanieczyszczenia, skażonych bakteryjnie lub podgrzanych. Należy unikać całkowicie zhemolizowanej lub lipemicznej surowicy albo próbek. Po pobraniu surowica powinna być oddzielona od skrzepu. Dokument CLSI (uprzednio NCCLS) H18-A2 zaleca następujące warunki przechowywania próbek: 1) Przechowywać próbki w temperaturze pokojowej nie dłużej niż 8 godzin. 2) Jeśli badanie nie zostanie zakończone w ciągu 8 godzin, schłodzić próbkę do temperatury 2-8 C. 3) Jeśli badanie nie zostanie ukończone w ciągu 48 godzin lub w przypadku transportu próbki, należy zamrozić ją w temperaturze -20 C lub niższej. Zamrożone próbki po rozmrożeniu i przed badaniem muszą zostać dobrze wymieszane. Badanie Dostarczone materiały 1 Płytka z mikrodołkami ELISA z dsdna (12-1 x 8 dołków), z uchwytem 1 1,2 ml wstępnie rozcieńczona kontrola negatywna ELISA 1 1,2 ml wstępnie rozcieńczonej kontroli pozytywnej dsdna ELISA 1 1,2 ml wstępnie rozcieńczonego kalibratora dsdna ELISA 1 50 ml rozcieńczalnika do próbek HRP 1 25 ml koncentratu do płukania HRP, koncentrat 40x 1 10 ml koniugatu przeciwciała IgG HRP, (kozie), przeciw-ludzkie IgG 1 10 ml chromogenu TMB 1 10 ml roztworu zatrzymującego HRP, kwas siarkowy 0,344M Wymagane materiały nie dołączone do zestawu Mikropipety na 5, 100, i 500 µl Jednorazowe końcówki mikropipet Probówki do roztworów próbek pochodzących od pacjenta, 4 ml objętości Woda destylowana lub dejonizowana Naczynie o objętości 1 l do rozcieńczonego koncentratu HRP do płukania Czytnik płytek z mikrodołkami umożliwiający pomiar gęstości optycznej przy 450 nm (i przy 620 nm dla odczytów przy dwóch długościach fali) Sposób przygotowania Przed rozpoczęciem 1. Doprowadzić wszystkie odczynniki i próbki do temperatury pokojowej (20-26 o C) i dobrze wymieszać. 2. Rozcieńczyć koncentrat do płukania HRP w stosunku 1:40, dodając zawartość butelki koncentratu do płukania HRP do 975 ml wody destylowanej lub dejonizowanej. Jeśli cała płytka nie zostanie przetworzona w tym czasie, można przygotować mniejszą ilość. W tym celu należy dodać 2,0 ml koncentratu do 78 ml wody destylowanej lub dejonizowanej na każde 16 dołków, które będą użyte. Rozcieńczony bufor zachowuje trwałość przez 1 tydzień w temperaturze 2 8 o C. 3. Przygotować roztwór 1:101 każdej próbki pochodzącej od pacjenta, dodając 5 µl próbki do 500 µl rozcieńczalnika do próbek HRP. Rozcieńczone próbki muszą być użyte w ciągu 8 godzin od przygotowania. NIE ROZCIEŃCZAĆ kalibratora dsdna ELISA, kontroli pozytywnej dsdna ELISA lub kontroli negatywnej ELISA. 4. Oznaczanie obecności lub braku autoprzeciwciał przeciwko dsdna wymaga dwóch dołków dla każdego z trzech kontroli i jednego lub dwóch dołków dla każdej próbki pacjenta. Zalecane jest wykonanie duplikatów próbek. 3

4 Procedura badania 1. WSZYSTKIE ODCZYNNIKI PRZED ROZPOCZĘCIEM BADANIA MUSZĄ BYĆ DOPROWADZONE DO TEMPERATURY POKOJOWEJ (20 26 C). Umieścić wymaganą liczbę mikrodołków/pasków w uchwycie. Natychmiast umieścić nieużywane płytki w torebce foliowej zawierającej osuszacz i dobrze ją zamknąć, aby ograniczyć kontakt z parą wodną. 2. Kalibrator dsdna ELISA i kontrola pozytywna dsdna ELISA powinny być wyjęte z butelek z zastosowaniem standardowych warunków aseptycznych i odpowiednich technik laboratoryjnych. Pobrać z butelki jedynie wymaganą do analizy ilość kalibratora dsdna ELISA lub kontroli pozytywnej dsdna ELISA. ABY UNIKNĄĆ POTENCJALNEGO ZANIECZYSZCZENIA BAKTERYJNEGO I/LUB CHEMICZNEGO, NIE WOLNO WLEWAĆ Z POWROTEM DO BUTELKI NIEUŻYTEGO kalibratora dsdna ELISA lub kontroli pozytywnej dsdna ELISA. Dodać do dołków 100 µl wstępnie rozcieńczonego kalibratora dsdna ELISA, kontroli pozytywnej dsdna ELISA, kontroli negatywnej ELISA oraz rozcieńczonych próbek pacjenta. Przykryć dołki i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej na równej powierzchni. Czas inkubacji rozpoczyna się po dodaniu ostatniej próbki. 3. Etap płukania: Odessać całkowicie zawartość każdego dołka. Dodać µl rozcieńczonego buforu do płukania HRP do wszystkich dołków, a następnie odessać. Powtórzyć tę sekwencję jeszcze dwukrotnie, aby łącznie przeprowadzić trzy płukania. Odwrócić płytkę i postukać w nią na materiale pochłaniającym w celu usunięcia pozostałości płynu po ostatnim płukaniu. Ważne jest, aby całkowicie opróżnić każdy dołek po każdym etapie płukania. Zachować tę samą sekwencję odsysania, jak w przypadku dodawania próbki. 4. Do każdego dołka dodać 100 μl koniugatu IgG HRP. Koniugat powinien być usunięty z butelek z zastosowaniem standardowych warunków aseptycznych oraz zalecanych technik laboratoryjnych. Pobrać z butelki jedynie wymaganą do analizy ilość koniugatu. ABY UNIKNĄĆ POTENCJALNEGO ZANIECZYSZCZENIA BAKTERYJNEGO I/LUB CHEMICZNEGO, NIE WOLNO WLEWAĆ NIEUŻYTEGO KONIUGATU Z POWROTEM DO BUTELKI. Inkubować dołki przez 30 minut jak w etapie Etap płukania: Powtórzyć etap Dodać 100 µl chromogenu TMB do każdego dołka i inkubować w ciemności przez 30 minut w temperaturze pokojowej. 7. Do każdego dołka dodać 100 µl roztworu zatrzymującego HRP. Zachować tę samą sekwencję i czas dodawania roztworu zatrzymującego HRP, jak w przypadku chromogenu TMB. Delikatnie postukać płytkę palcem, aby dokładnie wymieszać zawartość dołków. 8. Odczytać absorbancję (gęstość optyczną) każdego dołka przy długości fali 450 nm w ciągu jednej godziny od zatrzymania reakcji. Jeśli wymagane są pomiary bichromatyczne, referencyjną długością fali może być długość 620 nm. Kontrola jakości 1. Aby upewnić się, że wszystkie odczynniki i procedury funkcjonują prawidłowo, każdą serię próbek należy testować wraz z kalibratorem dsdna ELISA, kontrolą pozytywną dsdna oraz kontrolą negatywną ELISA. 2. Należy zwrócić uwagę, że kalibrator dsdna ELISA, kontrola pozytywna dsdna ELISA oraz kontrola negatywna ELISA są wstępnie rozcieńczone i nie będą one stanowić kontroli w przypadku procedur związanych z rozcieńczaniem próbek. 3. Dodatkowe kontrole mogą być przebadane zgodnie z wytycznymi lub wymaganiami lokalnych i/lub krajowych przepisów lub organów normalizacyjnych. Dodatkowe odpowiednie surowice kontrolne można przygotować, dzieląc połączone próbki surowicy ludzkiej i przechowując je w temperaturze < -20 C. 4. Obliczona wartość kontroli pozytywnej IU/ml lub jednostki/ml WHO muszą mieścić się w zakresie podanym na fiolce. 5. Aby wyniki badania mogły być uznane jako ważne, muszą zostać spełnione wszystkie poniższe kryteria. Jeśli jakiekolwiek kryterium nie będzie spełnione, badanie powinno być traktowane jako nieważne i powinno zostać powtórzone. a. Absorbancja wstępnie rozcieńczonej kontroli pozytywnej dsdna ELISA musi być większa niż absorbancja wstępnie rozcieńczonego kalibratora dsdna ELISA, która z kolei musi być większa niż absorbancja wstępnie rozcieńczonej kontroli negatywnej ELISA. b. Absorbancja wstępnie rozcieńczonej kontroli pozytywnej dsdna ELISA musi być większa niż 1,0, natomiast absorbancja wstępnie rozcieńczonej kontroli negatywnej ELISA nie może przekroczyć 0,2. c. Absorbancja kalibratora dsdna ELISA musi być ponad dwukrotnie większa niż absorbancja kontroli negatywnej ELISA lub być większa niż 0,25. 4

5 d. Kontrola negatywna ELISA i kontrola pozytywna dsdna ELISA mają za zadanie wykazać ewentualne istotne nieprawidłowe działanie odczynnika. Pozytywna kontrola dsdna ELISA nie zapewni dokładności przy wartości granicznej badania. e. Dodatkowe wytyczne dotyczące odpowiednich praktyk QC można znaleźć w dokumencie CLSI (uprzednio NCCLS) C24-A3. Obliczanie wyników W pierwszej kolejności jest określana średnia gęstość optyczna każdego zestawu duplikatów. Reakcyjność każdej próbki może być następnie obliczona poprzez podzielenie średniej gęstości optycznej próbki przez średnią gęstość optyczną kalibratora dsdna ELISA i pomnożenie wyniki przez wartość IU/ml lub jednostki WHO/ml kalibratora dsdna ELISA. Jednostki przypisane do kalibratora dsdna ELISA znajdują się na fiolce. Gęstość optyczna próbki Wartość próbki = 5 x kalibrator dsdna ELISA (jednostki) gęstość optyczna kalibratora dsdna ELISA (jednostki) Reaktywność w sposób nieliniowy zależy od ilości obecnych przeciwciał. Wzrosty i spadki stężeń przeciwciał u pacjenta będą odzwierciedlone w analogicznym wzroście lub spadku reaktywności, jednak zmiana ta nie jest proporcjonalna (tzn. podwojenie stężenia przeciwciał nie oznacza podwojenia reaktywności). Jeśli wymagane jest dokładniejsze oszacowanie ilości przeciwciał pacjenta, należy przeprowadzić seryjne badanie próbek otrzymanych od pacjenta i ostatnie rozcieńczenie w ramach badania z wynikiem pozytywnym powinno być zaraportowane jako miano przeciwciał pacjenta. Interpretacja wyników Badanie ELISA jest bardzo wrażliwe na technikę i jest w stanie wychwycić nawet najdrobniejsze różnice w populacjach pacjentów. Poniższe wartości są jedynie wartościami sugerowanymi. Każde laboratorium powinno ustalić własny normalny zakres na podstawie własnych technik, kontroli, sprzętu i populacji pacjentów, zgodnie z własnymi ustalonymi procedurami. Próbka następnie może być sklasyfikowana jako negatywna, niejednoznaczna, umiarkowanie pozytywna lub silnie pozytywna, zgodnie z poniższą tabelą. IU/ml jednostki WHO/ml Negatywna Niejednoznaczne Średnio pozytywna Silnie pozytywna Niejednoznaczne próbki powinny zostać ponownie przebadane przed przedstawieniem wyników. 1. Wynik pozytywny wskazuje na obecność przeciwciał przeciwko dsdna i sugeruje możliwość wystąpienia SLE. 2. W przypadku próbek o niejednoznacznym poziomie przeciwciał dsdna nie można ustalić stanu wytwarzania przeciwciał. Jeśli wyniki nadal są niejednoznaczne po powtórzonym badaniu, wynik należy zaraportować jako niejednoznaczny i/lub pobrać dodatkową próbkę. 3. Wynik negatywny świadczy o tym, że nie występują przeciwciała przeciwko dsdna, lub że ich poziom jest poniżej dolnej wartości granicznej badania. 4. Zalecane jest, aby wyniki raportowane przez laboratorium zawierały oświadczenie: Poniższe wyniki otrzymano przy wykorzystaniu zestawu INOVA QUANTA Lite dsdna ELISA. Nie można stosować zamiennie wartości dsdna uzyskanych przy zastosowaniu metod testowych innych producentów. Ograniczenia badania 1. Przeciwciała przeciwko jednoniciowemu DNA, kompleksom histonu lub innym kompleksom nukleoproteinowym nie mogą reagować w znaczącym stopniu z antygenem dsdna używanym w tym badaniu. Te przeciwciała mogą być wykrywane w większym lub mniejszym stopniu w przypadku innych metod badawczych. W związku z tym porównania pomiędzy różnymi metodami mogą przynieść różne wyniki. 2. W związku z tym, że przeciwciała IgG są uważane za najbardziej istotne z klinicznego punktu widzenia, 13,14,15 to badanie wykorzystuje swoisty koniugat IgG. Przeciwciała IgM dsdna, które nie zostały oszacowane w tym teście, mogą konkurować z przeciwciałami IgG o dostępne miejsca wiązania. Jeśli podejrzewane są interferencje spowodowane przeciwciałami IgM, należy powtórzyć badanie próbki przy wyższym rozcieńczeniu. Gwałtowny wzrost wartości dla próbki wskazuje na obecność konkurujących przeciwciał IgM. Ta nowa wartość zapewni dokładniejsze oszacowanie ilości przeciwciał dsdna IgG w próbce pacjenta. 3. Obecność kompleksów immunologicznych lub innych agregatów immunoglobuliny w próbce pochodzącej od pacjenta może powodować podwyższony poziom nieswoistego wiązania i wytwarzać fałszywe pozytywne wyniki

6 w tym badaniu. 4. Wyniki tego badania powinny być użyte w powiązaniu z wynikami klinicznymi i innymi badaniami serologicznymi. 5. Negatywny wynik dsdna nie wyklucza obecności SLE. 6. Pozytywny wynik testu świadczy jedynie o występowaniu przeciwciał przeciwko dsdna i niekoniecznie może wskazywać na obecność SLE. 7. Charakterystyka wyników badania nie została ustanowiona dla podłoża innego niż surowica. Spodziewane wartości Zdolność testu QUANTA Lite dsdna ELISA do wykrywania przeciwciał dsdna została oceniona przez porównanie z komercyjnie dostępnym testem immunofluorescencji firmy INOVA Diagnostics, Inc. Normalny zakres Normalny zakres dla tego badania został ustalony poprzez przeanalizowanie próbek pochodzących od 175 losowo wybranych dawców krwi. Spośród tych wszystkich próbek jedynie 2 (1,1%) miały wartości przeciwko-dsdna poniżej 200 IU/ml (92,6 jednostki WHO/ml). Swoistość i wrażliwość względna Reaktywność krzyżowa testu została ustalona poprzez przebadanie 50 pacjentów z różnymi chorobami autoagresyjnymi, którzy mieli przeciwciała przeciwjądrowe (ANA) ale nie mieli istotnych przeciwciał przeciwko dsdna w ramach metody referencyjnej. Spośród tych wszystkich próbek jedynie 1 (2,0%) miały wartości przeciwko-dsdna poniżej 200 IU/ml (92,6 jednostki WHO/ml). Bezpośrednie porównanie z innym komercyjnie dostępnym testem ELISA na przeciwciała dsdna zostało przeprowadzone na 64 pacjentach wybranych z populacji obejmującej pozytywne i negatywne próbki. Wyniki tych badań zostały przedstawione w poniższej tabeli. Metoda referencyjna P E N P 16** 0 0 P = pozytywne INOVA E 0 1* 1 E = niejednoznaczne N 0 7* 39 N = negatywne *przetestowane jako negatywne przez IFA za pomocą Crithidia luciliae. ** 12 z 16 również pozytywnych przez IFA za pomocą Crithidia luciliae. 6

7 Piśmiennictwo 1. Tan E: Autoantibodies to nuclear antigens (ANA): Their immunobiology and medicine. Advances in Immunology 33: 167, Casalo SP, Friou GJ, Myers LL: Significance of antibodies to DNA is systemic lupus erythematosus. Arthritis and Rheumatism 7: 379, Tan EM, et al.: The 1982 Revised Criteria for the Classification of Systemic Lupus Erythematosus. Arthritis and Rheumatism 25: 1271, Crowe W, Kusher I: An immunofluorescent method using Crithidia luciliae to detect antibodies to double-stranded DNA. Arthritis and Rheumatism 20: 811, Fish F, Ziff M: A sensitive solid phase microradioimmunoassy for anti double-stranded DNA antibodies. Arthritis and Rheumatism 24: 534, Inami YH, Nakamura RM, Tan EM: Microhemagglutination test for the detection of native and single-stranded DNA antibodies and circulating DNA antigen. Journal Immunol Methods 3: 287, Arana RK, Seligmann M: Antibodies to native and denatured deoxyribonucleic acid in systemic lupus erythematosus. Journal Clinical Investitgation 46: 1867, Kavai M, et al.: Enzyme-linked immunosorbent assay for antibodies to native DNA in sera of patients with SLE. Journal Immunol Methods 48: 169, Rubin RL, et al.: An improved ELISA for anti-native DNA by elimination of interference by anti-histone antibodies. Journal Immunol Methods 63: 359, Pisetsky DS, Peters DV: A simple enzyme-linked immunosorbent assay for antibodies to native DNA. Journal Immunol Methods 41: 187, Klotz JL: Enzyme-linked Immunosorbent Assay for antibodies to native and denatured DNA. Methods in Enzymology 84: 194, Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Center for Disease Control/National Institute of Health, Fifth Edition, Sontheimer RD, Gilliam JN: DNA antibody class, subclass, and complement fixation in systemic lupus erythematosus with and without nephritis. Clinical Immunolgy and Immunopatholgy 10: 459, Talal N, et al.: Biological significance of IgM and IgG antibodies to DNA and RNA in autoimmune disease. American Journal of Clinical Pathology 68: 643, Gonzalez EN, Rothfield NF. Immunoglobulin class and pattern of nuclear fluorescence in systemic lupus erythematosus. New England Journal of Medicine 274: 133,

8 QUANTALite jest zastrzeżonym znakiem handlowym firmy INOVA Diagnostics, Inc. Copyright Wszelkie prawa zastrzeżone Wyprodukowano przez: INOVA Diagnostics, Inc Old Grove Road San Diego, CA Stany Zjednoczone Ameryki Pomoc techniczna (tylko na terenie Stanów Zjednoczonych i Kanady): Pomoc techniczna (poza terenem Stanów Zjednoczonych): support@inovadx.com Autoryzowani przedstawiciele na terenie Unii Europejskiej: Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D St. Ingbert, Niemcy Tel.: Faks.: POL Merzec 2011 Wersja 0 8