Streszczenie Zakażenia szpitalne stanowią złożony problem dla współczesnego lecznictwa i są przyczyną przedłużonego leczenia, rekonwalescencji, zwiększonych kosztów a nawet wielu zgonów wśród pacjentów hospitalizowanych. W badaniach przedstawiono zastosowanie techniki PCR RFLP z użyciem fragmentu genu 16S rrna, ITS PCR oraz MSSCP do analizy szczepów Staphylococcus spp. izolowanych ze środowiska szpitalnego. W otrzymanych wynikach badań analiza restrykcyjna obszaru 16S rrna z użyciem enzymów MspI i Hind III nie wykazała przydatności do badań pokrewieństwa wyizolowanych szczepów Staphylococcus spp. Większe zdolności różnicujące otrzymano poprzez analizę odcinka znajdującego się między 16S rrna i 23S rrna, który cechował się dużym polimorfizmem. Analiza rejonu polimorficznego pomiędzy 16S rrna a 23S rrna za pomocą techniki wielotemperaturowego SSCP (MSSCP) wykazała bardzo duże zróżnicowanie wyizolowanych szczepów, jednak otrzymany wzór prążkowy z uwagi na zbyt dużą liczbę prążków może utrudniać interpretację. Abstract Nosocomial infections pose very complicated problem for nowadays. They are a reason for longer treatment, longer time of recovery, bigger costs of treatment and what most important death of some hospitalized patients. In this study following techniques: PCR RFLP using 16SrRNA fragment, ITS PCR and MSSCP were used for analysis of Staphylococcus spp. strains isolated form hospital milieu. We showed that restriction analysis of the 16S rrna digested with MspI and Hind III was not a proper techniques for finding relationship between examine strains. Better results we obtained after analysis much more polymorphic fragment found between 16S rrna and 23S. Multitemperature single strand conformation polymorphism technique (MSSCP) used to analysis selected polymorphic region showed big diversity of tested strains. However multiply band patterns obtained in this analysis cause problem in results interpretation. Key words: MSSCP, PCR RFLP, Staphylococcus spp., 16S rrna, 16S 23S rrna Słowa kluczowe: MSSCP, PCR RFLP, Staphylococcus spp., 16S rrna, 16S 23S rrna Wstęp Zakażenia szpitalne stanowią złożony problem dla współczesnego lecznictwa i dotyczą wszystkich osób mających kontakt ze środowiskiem szpitalnym. Nie tylko pacjentów znajdujących się na oddziale, personelu medycznego, ale także i osób przypadkowo znajdujących się w szpitalu [1]. Zakażenia szpitalne są przyczyną przedłużonego leczenia i rekonwalescencji, zwiększonych kosztów ponoszonych przez szpitale, a nawet wielu zgonów pacjentów w nich hospitalizowanych. Dane oparte na badaniach prospektywnych wykazują od 10% do 30% śmiertelność wśród pacjentów w wyniku zakażeń nabytych w trakcie ich pobytu w szpitalu. W latach 90-tych trzy ziarenkowce Gram dodatnie takie jak: Staphylococcus aureus, koagulazoujemne gronkowce i eneterokoki stanowiły aż 34% infekcji szpitalnych. Duży problem stwarzają także szczepy wielolekooporne, których leczenie jest utrudnione ze względu na ograniczone możliwości terapeutyczne [2]. Problem ten jest też widoczny
wśród szczepów metycylinoopornych gronkowca złocistego (MRSA) jak u szczepów metycylinoopornych gronkowców koagulazoujemnych (MRCNS). Ważnym elementem ograniczającym przenoszeniu zakażeń szpitalnych jest odpowiednie monitorowanie środowiska szpitalnego wraz z odpowiednią techniką laboratoryjną. Tradycyjna diagnostyka mikrobiologiczna oparta na analizie cech fenotypowych, nie daje pełnych możliwości analizy zróżnicowania szczepów izolowanych ze środowiska szpitalnego, dlatego poszukuje się coraz nowszych, dokładniejszych i o większej zdolności do różnicowania metod badawczych, opartych głównie na analizie molekularnej szczepów poprzez analizę cech genotypowych bakterii. Do badań tych używa się analiz wielu różnych fragmentów genów zarówno tych konserwatywnych jak i wysoce zmiennych. Analizę sekwencji genu 16S rybosomalnego RNA (16S rrna) używa się do identyfikacji gatunkowej bakterii i wykonywania badań taksonomicznych. Bakteryjny gen 16S rrna zwykle zawiera 9 wysokozmiennych obszarów wykazujących znaczną różnorodność pomiędzy gatunkami bakteryjnymi i może być on wykorzystywany do identyfikacji gatunkowej. Obszary wysokozmienne są flankowane u wielu bakterii przez konserwatywne fragmenty, pozwalając na amplifikację techniką PCR (Polymerase Chain Reaction) sekwencji docelowych przy użyciu uniwersalnych starterów [3]. W ostatnich latach coraz częściej w badaniach polimorfizmu znajduje technika ITS PCR (ang. Intergenic Transcribed Spacer PCR) gdzie amplifikowany jest obszar pomiędzy genami kodującymi 16S i 23S rrna. Ten wysokozmienny obszar prawdopodobnie umożliwi typowanie szczepów w obrębie gatunku [4, 5]. W badaniach pokrewieństwa szczepów coraz większe znaczenie ma łączenie kilku technik biologii molekularnej (PCR i RFLP, PCR i MSSCP) w celu zwiększenia czułości i specyficzności prowadzonych badań. Użycie techniki PCR, w połączeniu z techniką MSSCP (Multitemperature Single Strand Conformation Polymorphism), która jest nową, szybką techniką do analizy polimorfizmów i mutacji występujących w DNA pozwoli prawdopodobnie na opracowanie szybkiej i wiarygodnej metody diagnostycznej służącej do analiz zakażeń szpitalnych [6]. Mając na uwadze konieczność poszukiwania prostych ale zarazem wysoce specyficznych technik analizy podobieństwa lub zróżnicowania szczepów izolowanych ze środowiska szpitalnego w naszych badaniach podjęto próbę zastosowania techniki PCR RFLP, ITS PCR oraz MSSCP w celu określenia ich przydatności do badania pokrewieństwa szczepów Staphylococcus spp. wyizolowanych ze środowiska szpitalnego. Metodyka badań Badania hodowlane W wyniku przeprowadzonych badań czystości mikrobiologicznej środowiska szpitalnego wyizolowano 110 szczepów, które poddano analizie gatunkowej w kierunku rodzaju Staphylococcus, zgodnie z obowiązującą metodyka badań mikrobiologicznych. Wszystkie wyizolowane szczepy gronkowców zostały zidentyfikowane biochemicznie do gatunku przy użyciu testów API Staph (BioMerieux France). Do badan molekularnych wybrano 11 szczepów Staphylococcus spp. (Tab. I): 10 szczepów wyizolowanych ze środowiska szpitalnego - 5 szczepów Staphylococcus epidermidis, 3 szczepów Staphylococcus aureus, 2 szczepów Staphylococcua xylosus oraz szczepu wzorcowego Staphylococcus aureus ATCC 25923. Szczepy do dalszych badań przechowywano w systemie VIABANK w temperaturze -80 0 C. Izolacja DNA Z namnożonych na agarze krwawym (24 h w 37 0 C) szczepów przeprowadzono izolację DNA za pomocą zestawu Genomic Mini (DNA-Gdańsk II s.c.) z dodatkiem lizostafiny (400u/ml) i lizozymu (18mg/ml). Stężenie wyizolowanego DNA określano metoda fluorymetryczna w aparacie Qubit Fluorymetr (Invitrogen). DNA do dalszych badań przechowywano w temperaturze -20 0 C. Reakcja PCR W kolejnym etapie badań przygotowano 2 pary starterów. Dla fragmentu genu 16S rrna i dla rejonu zmiennego pomiędzy genami 16S rrna i 23S rrna (Tab. II) Tab. I. Identyfikacja gatunkowa szczepów użytych do analiz Nr szczepu identyfikacja Nr szczepu identyfikacja 1 Staphylococcus xylosus 7 Staphylococcus aureus MSSA 2 Staphylococcus aureus MSSA 8 Staphylococcus epidermidis 3 Staphylococcus epidermidis 9 Staphylococcus xylosus 4 Staphylococcus epidermidis 10 Staphylococcus epidermidis 5 Staphylococcus epidermidis 11 Staphylococcus aureus ATCC 25923 6 Staphylococcus aureus MSSA Tab. II. Sekwencje starterów użytych do reakcji PCR starter sekwencja amplifikowany fragment 16S-f 5 -TACATGCAAGTCGAGCGAAC-3 16S-r 5 -ACCTTCCGATACGGCTACCT-3 16S rrna G1 5 -GAAGTCGTAACAAGG-3 L1 5 -CAAGGCATCCACCGT-3 16S rrna 23S rrna wielkość amplimeru 1482 pz zmienna
Amplifikację przeprowadzono w mieszaninie reakcyjnej HotStarTaq Plus Master Mix (QIAGEN) zawierającej: 1u polimerazy DNA HotStarTaqPlus, 1x bufor PCR z 15mM MgCl 2, po 200 μm mieszaniny dntp, 1x CoralLoad Concentrate, po 0,1 μm odpowiednich starterów (Tab. II) i około 200 ng wyizolowanego DNA. Reakcje PCR przeprowadzono w termocyklerze MJ Mini Personal Thermal Cycer (Bio- Rad) wg następującego profilu temperaturowego. Wstępna denaturacja 95 0 C w czasie 5 minut, a następnie 30 cykli w układzie: denaturacja 95 0 C w czasie 1 minuty, przyłączanie starterów dla pary 16Sf i 16Sr 65 0 C w czasie 1 minuty oraz dla pary G1 i L1 54 0 C w czasie 1 minuty, wydłużanie starterów 72 0 C przez 1 minutę. Amplifikację zakończono wydłużaniem końcowym w temperaturze 72 0 C przez 10 minut. Rozdział elektroforetyczny Otrzymane amplimery rozdzielano w 3 % żelu agarozowym dla 16S rrna 23 rrna oraz w 1,5% żelu agarozowym dla 16S rrna z dodatkiem bromku etydyny (0.5 μg/ ml). Żele analizowano następnie z wykorzystaniem programu UVI-DocMW. PCR RFLP Otrzymany produkt reakcji PCR z starterami dla fragmentu genu 16S rrna poddano analizie z użyciem enzymów restrykcyjnych HindIII oraz MspI (Fermentas). W tym celu przygotowano mieszaninę reakcyjną zawierającą 10 μl produktu reakcji PCR, 18 μl jałowej wody dejonizowanej, 2 μl 10x buforu Hind III lub MspI oraz 1 μl odpowiedniego enzymu. Analizę restrykcyjną prowadzono w termobloku DR1 Block DB30 (Techne) w następującym układzie temperaturowym: 2 godziny w temperaturze 37 0 C, a następnie w celu przerwania trawienia w 80 0 C przez 10 minut. Produkty trawienia poddano elektroforezie w 1,5% żelu agarozowym z dodatkiem bromku etydyny (0.5 μg/ml). Otrzymane fragmenty analizy restrykcyjnej analizowano następnie z wykorzystaniem programu UVI-DocMW. MSSCP Analizę wielotemperaturowego SSCP przeprowadzono dla produktu reakcji ITS PCR. Do analizy MSSCP pobrano 4μl produktu PCR i zmieszano z 8μl buforu denaturującego, a następnie inkubowano przez 5 min w 95 C i schłodzono w lodzie. Fragmenty DNA z dodatkiem 3 μl buforu obciążającego były nanoszone na 8% żel poliakrylamidowy z dodatkiem 5% glicerolu w buforze 1 x TBE. Elektroforezę prowadzono w aparacie DNA Pointer System (Kucharczyk, T.E.) przy stałym napięciu 1500 V w trzech wariantach temperaturowych: 35 0 C, 15 0 C, 5 0 C. Otrzymane żele barwiono metodą srebrową z użyciem zestawu Silver Stain (Kucharczyk, T.E.) zgodnie z dołączoną procedurą. Następnie żele skanowano i poddawano analizie. Wyniki badań Ryc. 1. Analiza restrykcyjna produktu amplifikacji fragmentu genu 16S rrna z użyciem enzymu MspI. Ryc. 2. Analiza restrykcyjna produktu amplifikacji fragmentu genu 16S rrna z użyciem enzymu HindIII. W wyniku amplifikacji DNA z parą starterów dla fragmentu genu 16S rrna we wszystkich przypadkach uzyskano jednorodne wzory amplimerów (1 prążek). Następnie przeprowadzono analizę restrykcyjną produktu amplifikacji z enzymami MspI i Hind III. Po przeprowadzeniu analizy restrykcyjnej z użyciem enzymu MspI otrzymano 6 różnych fragmentów (ryc.1.), a zakres ich mas molekularnych po analizie w programie UVI DocMW wynosił od 51 pz do 647 pz. Analiza restrykcyjna produktu PCR z użyciem tego enzymu wykazała obecność takich samych profili elektroforetycznych dla wszystkich badanych szczepów. Po trawieniu enzymem HindIII produktu amplifikacji fragmentu 16S rrna otrzymano 4 różne fragmenty (Ryc.2). Zakres otrzymanych wielkości tych fragmentów wynosił od 351 pz do 1193 pz. W zależności od szczepu profil składał się z 2 lub 3 charakterystycznych prążków. W wyniku tej analizy podzielono wyizolowane szczepy na 3 grupy pod względem podobieństwa ich profili elektroforetycznych. W kolejnym etapie badań przeanalizowano otrzymane
szczepy pod względem różnic w obszarze pomiędzy genami 16S rrna 23S rrna. Po amplifikacji regionu zmiennego ITS w wyniku elektroforezy otrzymano wieloprążkowy profil elektroforetyczny (Ryc.3). W zależności od szczepu profil składał się z 2, 3, 4 lub 5 głównych prążków. Wielkość otrzymanych fragmentów po analizie w programie UVI DocMW wynosiła od 317 pz do 701 pz. Duże podobieństwo wykazano w przypadku szczepów oznaczonych numerami 3 i 5 oraz szczepów o numerach 8 i 10. Pozostałe szczepy wykazały duże zróżnicowanie zarówno w liczbie jak i w wielkości otrzymanych fragmentów. W badaniach z użyciem techniki MSSCP otrzymano wieloprążkowy wzór elektroforetyczny (Ryc.4). Otrzymane wyniki uwidoczniły do kilkudziesięciu różnych fragmentów. Z uwagi na tak dużą liczbę fragmentów analiza z użyciem programu UVI DocMW stała się niemożliwa. Jednocześnie analizując otrzymany elektroforegram nie znaleziono podobnych wzorów prążkowych w badanych szczepach co może świadczyć o ich dużym zróżnicowaniu. Dyskusja wyników Ryc. 3. Elektroforeza produktów amplifikacji obszaru zmiennego pomiędzy genami kodującymi 16S rrna i 23S rrna. Ryc. 4. Żel poliakrylamidowy analizy MSSCP fragmentu pomiędzy genami 16S rrna i 23S rrna. Wiele badań wykazało, że sekwencje obszaru zmiennego 16S rrna mogą być przydatne do identyfikacji pojedynczych gatunków bakterii czy uwidaczniania różnic pomiędzy ograniczoną liczbą gatunków i rodzajów. W powszechnym użyciu są już szybkie metody, które wykrywają gatunkowo specyficzne sekwencje w obrębie pojedynczych wysokozmiennych obszarów [2]. Otrzymane w badaniach wzory prążkowe dla produktu amplifikacji genu 16S rrna, nie wykazują jednak polimorfizmu, który umożliwiłyby różnicowanie szczepów, a fragment 16S rrna charakteryzował się dużą konserwatywnością. W otrzymanych przez nas wynikach badań analiza restrykcyjna obszaru 16S rrna z użyciem enzymów MspI i Hind III nie wykazała swojej mocy różnicującej a zarazem i przydatności do badań pokrewieństwa wyizolowanych szczepów Staphylococcus spp. Słabe właściwości różnicujące tego genu przedstawiają także w swoich badaniach Dewhirst F. i wsp., którzy próbowali zastosować go do różnicowania szczepów z rodzaju Helicobacter [7]. W badaniach Heikens E. i wsp. stwierdzono, że identyfikacja genotypowa oparta na fragmencie 16S rrna jest ograniczona przez ścisłe powiązanie gatunkowe szczepów Staphylococcus spp. [8]. Z przeprowadzonych analiz wynika, że większe zdolności różnicujące otrzymano poprzez analizę, nawet bez zastosowania enzymów restrykcyjnych, odcinka znajdującego się pomiędzy genami kodującymi 16S rrna i 23S rrna, który cechował się dużym polimorfizmem. Otrzymane wyniki badań wykazują, że polimorfizm długości fragmentu znajdującego się pomiędzy 16S i 23S rrna pozwala na wstępną identyfikację i analizę filogenetyczną szczepów bakterii z rodzaju Staphylococcus. Przydatność techniki ITS PCR do badań wewnątrzgatunkowych potwierdzili w swoich badaniach Roth i wsp., którzy wykorzystali tą technikę do badań wewnątrzgatunkowych i międzygatunkowych szczepów Mycobacterium spp. [9]. Po amplifikacji regionu zmiennego ITS w wyniku elektroforezy otrzymano wieloprążkowy profil elektroforetyczny pozwalający na odróżnienie szczepów bez przeprowadzania analizy restrykcyjnej, jednak w przypadku szczepów o numerach 8 i 10 oraz 3 i 5 zaobserwowano ich podobieństwo. Wszystkie te szczepy należały do gatunku Staphylococcus epidermidis. Przydatność analizy rejonu zmiennego do analizy próbek środowiskowych potwierdzają także w swoich badaniach Sadeghifard i wsp. [10]. W badaniach Kretowa M. i Grones J., przedstawili także zdolności różnicujące pomiędzy szczepami Acetobacter z zastosowaniem analizy rejonu zmiennego pomiędzy 16S rrna i 23S rrna [11],
a Traček J i Teuber M. wykazali możliwość zastosowania tego fragmentu do analizy polimorfizmu 57 badanych szczepów bakterii kwasu octowego [12]. Analiza rejonu polimorficznego pomiędzy 16S rrna a 23S rrna za pomocą techniki wielotemperaturowego SSCP (MSSCP) wykazała całkowite zróżnicowanie wyizolowanych szczepów, jednak otrzymany wzór prążkowy z uwagi na zbyt dużą liczbę prążków znacznie utrudnił ich interpretację. W przeprowadzonych badaniach wykazano potrzebę właściwego doboru techniki w zależności od zróżnicowania badanych szczepów i ich pochodzenia. Przeprowadzone badania wykazują ponadto konieczność optymalizacji wykorzystanych technik w celu uzyskiwania powtarzalności otrzymanych wyników. Brak optymalizacji badań genetycznych może prowadzić do błędnych ich interpretacji, a jednocześnie ograniczać ich zastosowanie do badań środowiska szpitalnego. Wnioski 1. Zastosowana technika PCR RFLP z użyciem fragmentu genu 16S rrna nie wykazała przydatności do analizy szczepów Staphylococcus spp. wyizolowanych ze środowiska szpitalnego. 2. Technika ITS PCR wykazała dużą przydatność do analizy pokrewieństwa wyizolowanych szczepów środowiskowych Staphylococcus spp. 3. Technika MSSCP jest najczulszą z badanych metod analizy polimorfizmu szczepów, jednak z uwagi na dużą liczbę otrzymanych prążków wymaga zastosowania do tej analizy krótszych fragmentów amplifikowanego fragmentu DNA. Badania finansowano z tematu KNW 1-052/08 i KNW 2-069/09 Piśmiennictwo 1. Fiedotow M, Denys A. Wybrana aspekty zakażeń szpitalnych. Pol Merk Lek 2006; 125: 484 488. 2. Krawczyk B. Diagnostyka molekularna w zakażeniach szpitalnych. Post Microbiol 2007; 46: 367 378. 3. Chakravorty S, Helb D, Burday M, Connell N, Alland DA. Detailed Analysis of 16S Ribosomal RNA Gene Segments for the Diagnosis of Pathogenic Bacteria. J Microbiol Methods 2007; 69: 330-339. 4. Daffonchio D, Cherif A, Brusetti L, Rizzi A, Mora D, Boudabous A, Borin S. Nature of Polymorphisms in 16S-23S rrna Gene Intergenic Transcribed Spacer Fingerprinting of Bacillus and Related Genera. Appl Environ Microbiol 2003; 69: 5128 5137. 5. Krawczyk B, Kur J. Diagnostyka molekularna w mikrobiologii. Wyd Politechniki Gdańskiej 2008, 85-91. 6. Kaczanowski R, Trzeciak L, Kucharczyk K. Multitemperature single stand conformation polymorphism. Electrophoresis 2001; 22: 3539 3535. 7. Dewhirst FE, Shen Z, Scimeca MS, Stokes LN, Boumenna T, Chen T, Paster BJ, Fox JG Discordant 16S and 23S rrna Gene Phylogenies for the Genus Helicobacter: Implications for Phylogenetic Inference and Systematics. J Bacteriol 2005; 187: 6106-6118. 8. Heikens E, Fleer A, Paauw A, Florijn A, Fluit AC. Comparison of Genotypic and Phenotypic Methods for Species-Level Identification of Clinical Isolates of Coagulase-Negative Staphylococci. J Clin Microbiol 2005; 43: 2286-2290. 9. Roth A, Fischer M, Hamid ME, Michalke S, Ludwig W, Mauch H. Differentiation of Phylogenetically Related Slowly Growing Mycobacteria Based on 16S-23S rrna Gene Internal Transcribed Spacer Sequences. J Clin Microbiol 1998; 36: 139-147. 10. Sadeghifard N, GürtlerV, Beer M, Seviour RJ. The Mosaic Nature of Intergenic 16S-23S rrna Spacer Regions Suggests rrna Operon Copy Number Variation in Clostridium difficile Strains. Appl Environ Microbiol 2006; 72: 7311-7323. 11. Kretowa M, Grones J. Molecular Analysis of 16S 23S Spacer Regions of Acetobacter Species. Folia Microbiol 2005; 50: 288-292. 12. Traček J, Teuber M. Genetic and Restriction Analysis of the 16S 23S rdna Internal Transcribed Spacer Regions of the Acetic Acid Bacteria. FEMS Microbiol Lett 2002; 208: 69-75. data otrzymania pracy: 19.11.2009 r. data akceptacji do druku: 22.02.2010 r. Adres do korespondencji: dr n. med. Robert D. Wojtyczka Katedra i Zakład Mikrobiologii Wydziału Farmaceutycznego z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej w Sosnowcu, Śląskiego Uniwersytetu Medycznego w Katowicach 41-200 Sosnowiec, ul. Jagiellońska 4, tel: 32 364 16 22, e-mail: rwojtyczka@sum.edu.pl