Anna Wakulińska OCENA POSTĘPOWANIA DIAGNOSTYCZNEGO I TERAPEUTYCZNEGO W CHŁONIAKACH U PACJENTÓW Z ZESPOŁEM NIJMEGEN

Anna Wakulińska OCENA POSTĘPOWANIA DIAGNOSTYCZNEGO I TERAPEUTYCZNEGO W CHŁONIAKACH U PACJENTÓW Z ZESPOŁEM NIJMEGEN ROZPRAWA NA STOPIEŃ DOKTORA NAUK MEDYCZNYCH Promotor: Prof. nadzw. dr hab. n. med. Krystyna Chrzanowska KLINIKA ONKOLOGII INSTYTUT POMNIKCENTRUM ZDROWIA DZIECKA Kierownik Kliniki: Prof. dr hab. n. med. Danuta Perek Warszawa 2010 1

2

PODZIĘKOWANIA Wyjątkowe podziękowania składam na ręce Pani Profesor Krystyny Chrzanowskiej, promotora pracy, za systematyczną zachętę, entuzjazm, oraz cenne uwagi i pomoc w realizacji projektu Dziękuję Pani Profesor Danucie Perek Pani Profesor BoŜennie DembowskiejBagińskiej Pani Doktor Hannie Gregorek Pani Profesor Irenie Jankowskiej za wiele cennych rad, Ŝyczliwość i wsparcie Szczególne podziękowania kieruję do MęŜa, Synów i Rodziców za ich miłość, cierpliwość i wszechstronną pomoc Praca została wykonana w ramach promotorskiego grantu badawczego MNiSW nr N N407 100938: Ocena postępowania diagnostycznego i terapeutycznego w chłoniakach u pacjentów z zespołem Nijmegen. Kierownik grantu: Prof. nadzw. dr hab. n. med. Krystyna Chrzanowska. 3

SPIS NAJWAśNIEJSZYCH SKRÓTÓW STOSOWANYCH W TEKŚCIE NBS zespół Nijmegen (ang. Nijmegen Breakage syndrome) AT zespół ataksja teleangiektazja GR grupa referencyjna DNA DSBs pęknięcia podwójnej nici DNA (ang. DNA doublestrand breaks) RDS zjawisko tzw. radioopornej syntezy DNA (ang. radioresistant DNA synhesis) Ig immunoglobulina, przeciwciało TCR receptor limfocyta T (ang. Tcell receptor) IGH łańcuchy cięŝkie immunoglobulin IGL łańcuch lekki immunoglobulin typu lambda IGK łańcuch lekki immunoglobulin typu kappa NHL nieziarniczy chłoniak złośliwy (ang. NonHodgkin lymphoma) BL chłoniak Burkitta (ang. Burkitt lymphoma) BLL chłoniak typu Burkittlike (ang. Burkittlike lymphoma) TLBL chłoniak limfoblastyczny z komórek T (ang. Tcell lymphoblastic lymphoma) BLBL chłoniak limfoblastyczny z komórek B (ang. Bcell lymphoblastic lymphoma) DLBCL rozlany chłoniak z duŝych komórek B (ang. Diffuse large Bcell lymphoma) ALCL chłoniak anaplastyczny wielkokomórkowy (ang. Anplastic large cell lymphoma) PTCL chłoniak z dojrzałych komórek T (ang. Peripheral Tcell lymphoma) OUN ośrodkowy układ nerwowy ADM adriamycyna MTX metotreksat CTX cyklofosfamid ARAC arabinozyd cytozyny VP16 vepesid IF ifosfamid LAsp Lasparaginaza CDDP cisplatyna CR całkowita remisja (ang. complete remission) PR PD częściowa remisja (ang. partial remission) progresja choroby (ang. progressive disease) CCG Children Cancer s Group POG Pediatric Oncology Group 4

SPIS TREŚCI SPIS SKRÓTÓW NAJCZĘŚCIEJ STOSOWANYCH W TEKŚCIE. I. WSTĘP.. 1.1. Zespół Nijmegen. 1.1.1. Krótka historia. 1.1.2. Manifestacja kliniczna zespołu Nijmegen. 1.1.3. Charakterystyka zaburzeń na poziomie komórkowym w zespole Nijmegen 1.1.4. Molekularne podłoŝe zespołu Nijmegen 1.1.5. Rola nibryny w naprawie dwuniciowych pęknięć DNA 1.1.6. Inne pierwotne niedobory odporności związane z zaburzeniami naprawy DNA... 1.2. Chłoniaki nieziarnicze.. 1.2.1. Klasyfikacja chłoniaków nieziarniczych. 1.2.2. Epidemiologia chłoniaków nieziarniczych 1.2.3. Patogeneza chłoniaków nieziarniczych. 1.2.4. Chłoniaki nieziarnicze w ogólnej populacji dzieci i młodzieŝy. 1.2.5. Leczenie chłoniaków nieziarniczych u dzieci i młodzieŝy II. CEL PRACY III. MATERIAŁ I METODY.. 3.1. Materiał 3.2. Metody. 3.2.1. Ocena postępowania diagnostycznego... 3.2.2. Ocena procesu i wyników leczenia 3.2.3. Analiza statystyczna... IV. WYNIKI.. 4.1. Ogólna charakterystyka obu grup pacjentów... 4.2. Charakterystyka pacjentów z chłoniakami Bkomórkowymi.. 4.3. Charakterystyka pacjentów z chłoniakami Tkomórkowymi.. 4.4. Wywiad chorobowy przed rozpoznaniem chłoniaka u pacjentów z NBS i w grupie referencyjnej 4.5. Przebieg chłoniaków u pacjentów z NBS 4.6. Analiza wybranych parametrów układu odporności przed rozpoznaniem chłoniaka u pacjentów z NBS.. 4.6.1. Niedobory odporności typu komórkowego przed rozpoznaniem chłoniaka.. 4.6.2. Niedobory odporności typu humoralnego przed rozpoznaniem chłoniaka nieziarniczego. 4.6.3. Porównanie zaburzeń odporności komórkowej i humoralnej występujących w okresie przednowotworowym w grupie chorych z chłoniakami typu B i T... 4.7. Leczenie chłoniaków z komórek B i powikłań po chemioterapii u pacjentów z NBS i w grupie referencyjnej... 4.7.1. Strategia leczenia chłoniaków z dojrzałych komórek B 4.7.2. Modyfikacja dawek chemioterapii według programu LMB 89/01 u pacjentów z NBS 4.7.3. Analiza odpowiedzi na leczenie w trakcie chemioterapii wg protokołu LMB.. 4.7.4. Powikłania po chemioterapii u pacjentów z NBS i z grupy referencyjnej 4.7.5. Opóźnienia w podawaniu kolejnych cykli chemioterapii LMB u pacjentów z NBS i w grupie referencyjnej. 4 7 7 7 8 9 11 12 12 13 13 14 15 19 23 29 30 30 30 30 33 34 35 35 39 43 48 51 55 55 57 59 63 63 65 66 67 70 5

4.7.6. Wyniki leczenia chłoniaków z komórek B u pacjentów z NBS i w grupie referencyjnej.. 4.8. Leczenie chłoniaków z komórek T u pacjentów z NBS i w grupie referencyjnej 4.8.1. Strategia leczenia chłoniaków z komórek T... 4.8.2. Modyfikacja dawek chemioterapii według programu BFM 90 /EUROLB 02 u pacjentów z NBS. 4.8.3. Analiza odpowiedzi na leczenie w trakcie chemioterapii wg protokołu BFM 90/EUROLB 02 4.8.4. Powikłania po chemioterapii wg protokołu BFM 90/ EUROLB 02 u pacjentów z NBS i w grupie referencyjnej 4.8.5. Opóźnienia w podawaniu kolejnych cykli chemioterapii protokołu BFM 90/EUROLB 02 u pacjentów z NBS oraz w grupie referencyjnej.. 4.8.6. Wyniki leczenia chłoniaków z komórek T programem BFM 90/ EUROLB 02 u pacjentów z NBS oraz w grupie referencyjnej. 4.9. Podsumowanie wyników leczenia chłoniaków u pacjentów z NBS i z grupy Referencyjnej... V. OMÓWIENIE WYNIKÓW I DYSKUSJA... 5.1. Epidemiologia i charakterystyka chłoniaków w zespole Nijmegen w porównaniu z populacja ogólną... 5.2. Diagnostyka chłoniaków u pacjentów z NBS uwarunkowania, odrębności i Problemy.. 5.3. Leczenie chłoniaków u pacjentów z NBS odrębności, powikłania, wyniki. 5.4. Wyniki leczenia chłoniaków nieziarniczych 5.5. Proponowany algorytm postępowania w przypadku podejrzenia i rozpoznania chłoniaka u pacjenta z zespołem Nijmegen.. VI. PODSUMOWANIE. VII. WNIOSKI.. VIII STRESZCZENIE IX. PIŚMIENNICTWO. XA. SPIS TABEL I RYCIN ZAMIESZCZONYCH W PRACY... XB. SPIS RYCIN ZAMIESZCZONYCH W ANEKSIE. XI. ANEKS. 71 77 77 79 80 81 84 85 88 90 91 98 108 122 127 130 132 133 137 149 152 153 6

I. WSTĘP Na skutek działania czynników środowiskowych oraz wewnątrzkomórkowych procesów metabolicznych liczba uszkodzeń DNA w pojedynczej komórce dochodzi do 10 3 10 6 kaŝdego dnia [1]. KaŜda komórka wyposaŝona jest w mechanizmy umoŝliwiające ciągłą identyfikację i naprawę powstających defektów, które mają zapobiec replikacji uszkodzeń DNA i przekazywania ich komórkom potomnym. W utrzymaniu integralności genomu biorą udział produkty białkowe kilkuset genów [2]. Defekty białek uczestniczących bezpośrednio w procesie naprawy DNA, regulacji cyklu komórkowego lub apoptozy są związane ze zwiększonym ryzykiem występowania nowotworów [3,4]. Szczególnie niebezpieczne dla komórki są jednoczesne uszkodzenia obu nici DNA (ang. DNA doublestrand breaks; DNA DSBs), które powstają zarówno pod wpływem czynników zewnętrznych, takich jak np. promieniowanie jonizujące czy związki chemiczne, jak i w przebiegu procesów fizjologicznego dojrzewania limfocytów w wyniku rekombinacji V(D)J genów immunoglobulin i receptorów limfocytów T (Ig/TCR) [5]. Nieskuteczna naprawa DNA DSBs jest przyczyną powaŝnych uszkodzeń genomu, których konsekwencją moŝe być niestabilność genomu i rozwój nowotworu [6]. Dziedziczne defekty naprawy DNA DSBs są przyczyną grupy chorób, których stałym elementem jest niestabilność chromosomowa i wysoka częstość występowania nowotworów, zwłaszcza układu chłonnego [4,7,8,9]. Do grupy tych chorób zaliczany jest zespół Nijmegen, który występuje w populacji polskiej częściej niŝ w innych rejonach świata [10,11,12]. 1.2. ZESPÓŁ NIJMEGEN 1.1.1 Krótka historia Zespół Nijmegen (ang. Nijmegen Breakage Syndrome; NBS) [MIM *251260] jest rzadką chorobą monogenową dziedziczącą się autosomalnie recesywnie. Opisany został po raz pierwszy w roku 1981, przez Weemaes i wsp. [13] z Uniwersytetu w Nijmegen w Holandii, u pary rodzeństwa z małogłowiem, niedoborem wzrostu, złoŝonymi zaburzeniami odporności i upośledzeniem umysłowym, będących potomstwem spokrewnionych rodziców. Dodatkowo u obojga dzieci stwierdzono aberracje chromosomowe zbliŝone do obserwowanych w zespole ataksja teleangiektazja (ang. ataxia telangictasia; AT). Dalsze badania ujawniły, Ŝe komórki pacjentów z NBS, podobnie jak chorych z AT, są niezwykle wraŝliwe na promieniowanie jonizujące (X i γ) oraz na bleomycynę (chemioterapeutyk zaliczany do tzw. radiomimetyków). Pod wpływem działania tych czynników gwałtownie wzrastała liczba złamań chromosomowych, malała przeŝywalność komórek oraz występował 7

brak zahamowania syntezy DNA, czyli. zjawisko tzw. radioopornej syntezy DNA (ang. Radioresistant DNA synhesis; RDS) [14]. W 1985 roku Seemanová i wsp. [15] opisali jako nowy zespół chorobowy (Seemanová syndrome II) kilkoro pacjentów z małogłowiem i niedoborami odporności, u których często występowały nowotwory. Równolegle przeprowadzone testy in vitro w komórkach pacjentów holenderskich i czeskich wykazały, Ŝe dotknięci oni byli tą samą chorobą [16]. W ciągu prawie 30 lat od momentu zidentyfikowania zespołu Nijmegen jako nowej jednostki chorobowej dokonał się ogromny postęp. Sklonowano gen NBS1 (zgodnie z obecną nomenklaturą NBN) oraz zidentyfikowano dziedziczne mutacje będące podłoŝem zachorowań na NBS, co umoŝliwiło wgląd w molekularną patogenezę choroby [17,18]. Wykazano takŝe częstsze występowanie NBS w Europie Środkowej i Wschodniej niŝ w innych częściach świata [15,19,20,21]. W populacji słowiańskiej wykryto mutację załoŝycielską (ang. founder effect) polegającą na utracie 5 nukleotydów w egzonie 6. genu NBN, c.657_661del5, która okazała się być przyczyną ponad 90% zachorowań [10]. W trzech populacjach: polskiej, czeskiej i ukraińskiej, w których zidentyfikowano najwięcej pacjentów z NBS częstość występowania heterozygotycznego nosicielstwa tej mutacji oszacowano na ~0,5% [18]. Pierwsza grupa 11 polskich pacjentów z zespołem Nijmegen została opisana w roku 1995 [19]. Obecnie w Polskim Rejestrze Chorych z NBS prowadzonym w Poradni Genetycznej IPCZD znajdują się dane 120 pacjentów [inf. własna, 2010], którzy stanowią około połowę pacjentów zidentyfikowanych na świecie [Rejestr ESID inf. własna]. 1.1.2. Manifestacja kliniczna zespołu Nijmegen Na obraz kliniczny zespołu Nijmegen składają się: małogłowie z charakterystycznym wyglądem twarzy (niskie, pochyłe czoło, wydatny nos, cofnięta broda), niedobór wzrostu i masy ciała, nawracające infekcje spowodowane złoŝonymi niedoborami odporności oraz niezwykła predyspozycja do rozwoju nowotworów złośliwych, zwłaszcza wywodzących się z układu limfoidalnego [11,12,15,20,21,22,23]. Małogłowie jest wiodącym objawem zespołu Nijmegen, obecnym praktycznie u wszystkich pacjentów w chwili urodzenia lub wkrótce po, z pojedynczymi wyjątkami [20,24], ale opisywano takŝe wodogłowie i zaburzenia rozwojowe mózgu pod postacią schizencefalii, torbieli pajęczynówkowych, czy pachygyrii [11,25]. Mimo wybitnego małogłowia u chorych z NBS nie występują objawy neurologiczne, ani opóźnienie rozwoju psychoruchowego, a rozwój intelektualny w pierwszych latach Ŝycia z reguły mieści się w granicach szerokiej 8

normy. ObniŜenie sprawności intelektualnej w stopniu lekkim lub umiarkowanym obserwuje się dopiero w wieku szkolnym [11,26]. Dzieci rodzą się z niedoborem masy i długości ciała w porównaniu do zdrowych noworodków odpowiedniej płci. Opóźnienie wzrastania obserwuje się szczególnie w okresie niemowlęcym i przedszkolnym, w wieku szkolnym tempo wzrastania z reguły ulega poprawie [23]. Dziewczynki nie dojrzewają spontanicznie z powodu dysfunkcji jajników (hipogonadyzm hipergonadotropowy) i wymagają stałej substytucji hormonalnej, która umoŝliwia rozwój drugorzędowych cech płciowych [11,27,28]. U chłopców z NBS proces pokwitania przebiega podobnie jak u ich rówieśników, ale nie wiadomo czy męŝczyźni są płodni [27]. U większości chorych z NBS występują nawracające i/lub przewlekłe zapalenia płuc i oskrzeli, zatok obocznych nosa, uszu, dróg moczowych. Zbyt późne rozpoznanie niedoborów odporności oraz opóźnione wdroŝenie odpowiedniego leczenia i profilaktyki (m.in. substytucji preparatami immunoglobulin) skutkować moŝe rozstrzeniami oskrzeli [11,20,21], a takŝe stanami zapalnymi śluzówek jamy ustnej [29]. W tej grupie chorych stosunkowo rzadko dochodzi do rozwoju zakaŝeń oportunistycznych [30,31,32]. Dzięki poprawie opieki nad pacjentami z NBS oraz coraz skuteczniejszym metodom leczenia zakaŝeń, obecnie najczęstszą przyczyną zgonów są nowotwory, na które przed 20 r.ŝ., wg róŝnych autorów, zapada od 40 do 65% pacjentów [11,21,33]. Ogromną większość, 8590%, stanowią nowotwory wywodzące się z układu limfatycznego, wśród których przewaŝają chłoniaki nieziarnicze, rzadziej występują białaczki limfoblastyczne lub chłoniaki Hodgkina. Wśród innych typów nowotworów odnotowano m.in. rdzeniaki zarodkowe móŝdŝku, ganglioneuroblastoma, gonadoblastoma, mięsaki tkanek miękkich, [34,35,36,37]. Niestety, dość często zespół Nijmegen rozpoznawany jest dopiero po wystąpieniu nowotworu [38,39,40,41] i/lub nadmiernej reakcji na standardowe leczenie przeciwnowotworowe, zwłaszcza radioterapię [34,35]. Warto podkreślić, Ŝe częstość występowania nowotworów w NBS jest wyŝsza nie tylko w porównaniu do zdrowej populacji, ale takŝe w stosunku do innych chorób o genetycznie uwarunkowanej niestabilności chromosomów, takich jak zespół ataksja teleangiektazja (AT), czy anemia Fanconiego (FA) [11,21,42,43]. 1.1.3 Charakterystyka zaburzeń na poziomie komórkowym w zespole Nijmegen Zaburzone kształtowanie się repertuaru układu odporności w NBS 9

Jednym z zasadniczych i stałych objawów zespołu Nijmegen jest złoŝony niedobór odporności, często cięŝki i bardzo zmienny, z tendencją do pogłębiania się wraz z wiekiem [21,31,44]. Upośledzona jest zarówno odporność komórkowa, jak i humoralna. Limfocyty pacjentów z NBS mają znacznie obniŝoną zdolność do proliferacji in vitro pod wpływem działania róŝnych mitogenów, takich jak m.in. fitohemaglutynina (PHA) i antycd3 działające na komórki T, czy przeciwciała antyigm stymulujące komórki B [31,45]. Immunofenotypowanie komórek szpiku pacjentów z NBS w róŝnym wieku ujawniło względną redukcję populacji komórek preb, co moŝe być wynikiem częściowego bloku dojrzewania, przedwczesnego starzenia się komórek lub zaburzonej proliferacji [44]. W krwi obwodowej stwierdza się obniŝenie odsetka i liczby bezwzględnej limfocytów B CD19+ i komórek T CD3+, jak równieŝ zaburzenia repertuaru limfocytów B i T, w tym głębokie niedobory subpopulacji komórek T CD3/CD4+ i CD3/CD8+ oraz izoformy CD4+CD45RA+ [44,45,46]. W zakresie głównych klas immunoglobulin najczęściej występuje niedobór IgA i IgG, natomiast stęŝenia IgM mogą być zarówno niskie, jak i podwyŝszone, nawet wielokrotnie powyŝej górnej granicy normy dla wieku [15,19,21,31,46]. Powszechna tendencja do hipogammaglobulinemii w NBS jest wynikiem zaburzonej syntezy przeciwciał izotypów innych niŝ IgM, co stało się zrozumiałe kiedy wykazano, Ŝe białko NBN odgrywa istotną rolę w prawidłowym procesie przełączania klas [47,48]. Warto podkreślić, Ŝe u wszystkich badanych stwierdza się takŝe niedobory w zakresie jednej lub więcej podklas IgG, z reguły IgG4 i IgG2, które mogą być maskowane przez prawidłowy poziom całkowitych IgG [21,31]. Niestabilność chromosomowa Niezwykle charakterystyczną cechą biologiczną komórek pacjentów z zespołem Nijmegen jest niestabilność chromosomowa, która manifestuje się występowaniem spontanicznych złamań chromosomów prowadzących do powstawania licznych aberracji strukturalnych, w szczególności translokacji wymiennych i inwersji [11]. Kariotypy pacjentów z NBS badane klasycznymi technikami cytogenetycznymi w limfocytach krwi obwodowej stymulowanych PHA (limfocyty T) są prawidłowe, natomiast w pewnym odsetku komórek stwierdza się rearanŝacje chromosomów pary 7 i/lub 14, z punktami złamań powtarzającymi się w prąŝkach 7p13, 7q34, 14q11 i 14q32 [11,15,19,20]. We wszystkich rearanŝacjach tego typu biorą udział loci genów kodujących receptory limfocytów T (ang. T cell receptor; TCR) i łańcuchy cięŝkie Ig. Na podkreślenie zasługuje fakt, Ŝe specyficzne rearanŝacje chromosomów 7 i 14 występują w NBS wielokrotnie częściej niŝ w populacji ogólnej; np. t(7;14) około 100krotnie, a inv(7) nawet 200400krotnie [23]. Interesujące jest 10

takŝe stwierdzenie, Ŝe specyficzne rearanŝacje z udziałem chromosomów 7/14 występują ponad dwukrotnie częściej w NBS niŝ w AT [23], podobnie jak nowotwory wywodzące się z układu chłonnego [11,21,42,43]. Inny typ nieprawidłowości chromosomowych dominuje w komórkach B, w których na skutek fuzji telomerów powstają chromosomy dicentryczne [28]. Ponadto, charakterystyczną cechą komórek chorych z NBS, jak i z AT jest wzrost liczby pęknięć i złamań chromosomowych po ekspozycji in vitro na promieniowanie jonizujące [11]. NadwraŜliwość na promieniowanie jonizujące Badania wpływu promieniowania jonizującego oraz cytostatyków z grupy tzw. radiomimetyków (m.in. bleomycyna) in vitro na komórki NBS wykazały podobne skutki jak w AT, tj. kilkukrotny wzrost częstości chromosomowych aberracji strukturalnych oraz obniŝenie przeŝywalności komórek o około 50% [14,28]. Obydwa czynniki indukują pęknięcia obu nici DNA. Skuteczne usunięcie DNA DSBs wymaga sprawnych mechanizmów naprawczych [5], które są zaburzone zarówno w NBS, jak i w AT [49]. W komórkach pacjentów z NBS, podobnie jak z AT, odmiennie niŝ u osób zdrowych, obserwuje się fenomen RDS. Sprzyja on utrwalaniu błędów powstałych w procesie replikacji po napromienieniu lub na skutek działania bleomycyny in vitro [11,14,19] i świadczy o zaburzonych mechanizmach kontroli cyklu komórkowego w fazie S w obu chorobach [50]. 1.1.4. Molekularne podłoŝe zespołu Nijmegen Gen NBN (dawniej NBS1), zlokalizowany jest na chromosomie 8q21, składa się z 16 eksonów i koduje białko nibrynę, które tworzy multimetryczny kompleks z białkami hmre11 i hrad50, zwany w skrócie M/R/N [17,18]. Kompleks M/R/N pełni jedną z kluczowych ról w kaskadzie naprawy dwuniciowych pęknięć DNA. [17,51]. Do chwili obecnej zidentyfikowano 11 róŝnych mutacji w genie NBN/NBS1 powodujących brak syntezy prawidłowej funkcjonalnie cząsteczki nibryny. Wszystkie zidentyfikowane mutacje są zlokalizowane w eksonach 6., 7., 8. i 10. [18,30,52]. W ponad 90% przypadków NBS, w tym u wszystkich przebadanych polskich pacjentów, mutacja załoŝycielska c.657_661del5 występuje na obu allelach genu NBN. Pozostałe mutacje wykryto w pojedynczych rodzinach, w postaci homozygotycznej lub na jednym allelu, w połączeniu z mutacją c.657_661del5 na drugim allelu (tzw. złoŝone heterozygoty) [23]. Wszystkie mutacje zidentyfikowane u ludzi uwaŝa się za hipomorficzne, poniewaŝ umoŝliwiają powstanie częściowo funkcjonalnego białka [52]. 11

1.1.5. Rola nibryny w naprawie dwuniciowych pęknięć DNA Powstanie DNA DSBs, niezaleŝnie od przyczyny, uruchamia całą kaskadę wydarzeń związanych z ich naprawą. Nibryna odgrywa kluczową rolę w utrzymaniu stabilności genomu. Uczestniczy m.in. w przemieszczaniu enzymów naprawczych do miejsc uszkodzeń nici DNA oraz w regulacji punktów kontrolnych cyklu komórkowego. Jednym z najwcześniejszych etapów odpowiedzi komórkowej jest fosforylacja białka ATM (zmutowanego u chorych z AT produktu białkowego genu ATM). Białko ATM pełni rolę czujnika, przekazującego sygnał o uszkodzeniu, w wyniku którego dochodzi do fosforylacji szeregu innych białek, m.in. p53 i Chk2 uczestniczących w regulacji punktów kontrolnych cyklu komórkowego G1/S i G2/M, a takŝe nibryny [53]. Nibryna tworzy wówczas kompleks funkcjonalny z białkami hmre11 i hrad50, zwany M/R/N [17,54]. Białko MRE11 wykazuje aktynowość egzo i endoneklazy, przygotowując końce pękniętych nici DNA do ponownego połączenia po naprawieniu uszkodzeń [55]. Białko hrad50 wchodzi w skład rodziny białek tzw. kompleksu zachowania stabilności chromosomów [56]. Rola nibryny jako elementu składowego kompleksu M/R/N polega na zlokalizowaniu miejsca uszkodzenia przez wiązanie z białkiem histonowym γh2ax i przekazaniu sygnału do reszty składowych kompleksu M/R/N [57]. Wszystkie poznane dotychczas mutacje genu NBN powodują utratę dystalnego, Ckońcowego odcinka nibryny, w którym znajduje się kilka miejsc fosforylowanych przez ATM, jak równieŝ miejsce wiązania cząsteczki nibryny z białkiem hmre11 w funkcjonalny kompleks [17,18]. W procesie naprawy DNA DSBs zasadniczą rolę odgrywają mechanizmy rekombinacji: rekombinacji homologicznej (HR) swoistej dla fazy S i późnej fazy G2 oraz niehomologicznego łączenia końców (ang. nonhomologous endjoining, NHEJ) [5,58]. Niedokładna naprawa DSB moŝe prowadzić do powstawania i kumulacji strukturalnych aberracji chromosomowych (inwersji i translokacji), a następnie mutagenezy i kancerogenezy [59]. Jednocześnie utrata kontroli nad przebiegiem cyklu komórkowego w limfocytach (poprzez białko p53) skutkuje upośledzeniem apoptozy, brakiem zatrzymania cyklu komórkowego i kontynuacją replikacji DNA pomimo uszkodzenia, prowadząc do akumulacji zmian genetycznych mogących prowadzić do rozwoju chłoniaków [8]. 1.1.6. Inne pierwotne niedobory odporności związane z zaburzeniami naprawy DNA Znanych jest obecnie kilkanaście chorób, których przyczyną są defekty naprawy DNA, a ich skutkiem pierwotne niedobory odporności oraz znacznie zwiększone ryzyko rozwoju nowotworów w młodym wieku, zwłaszcza chłoniaków i białaczek. Pierwsze z tych 12

chorób były wyodrębnione juŝ w połowie lat 60tych ubiegłego wieku: zespół Blooma (BS) [60], anemia Fanconiego (FA) [61], zespół ataksjateleangiektazja (AT) [62]. W następnych latach zidentyfikowano kolejne jednostki chorobowe: zespół Nijmegen [13], deficyt ligazy DNA I (LIG1) [63], zespół podobny do zespołu ataksjateleangiektazja (ATLD) [64], deficyt ligazy DNA IV (LIG4) [65], zespół NHEJ 1 (NHEJ1) [66], zespół podobny do NBS (ang. NBSlike disorder; NBSLD) [67]. W tabeli 1 przedstawiono podobieństwa i róŝnice w obrazie klinicznym i na poziomie komórkowym pomiędzy ww. chorobami. Tabela 1. Charakterystyka zespołów związanych z zaburzeniami naprawy podwójnych pęknięć nici DNA Zespół Gen Małogłowie Niedobór odporności AT ATM Nie IgG, IgA, limfopenia ATLD MRE11 Część Nie pacjentów stwierdzono NBS NBN Tak IgG, IgA, IgM, limfopenia NBSLD RAD50 Tak Nie DNA LIG4 DNA LIG4 Część pacjentów NHEJ1 NHEJ1 Część pacjentów FA FANCA N Część pacjentów stwierdzono IgG, IgA, limfopenia BLM RECQL3 Tak IgG, IgA, IgM, Aberracje chromosomów 7 i 14 NadwraŜliwość na prom. X i γ Nowotwory Tak Tak Białaczki, chłoniaki, guzy lite Tak Tak Brak doniesień Tak Tak Chłoniaki, białaczki, guzy lite Tak Tak Brak doniesień Nie Tak Chłoniaki, białaczki limfopenia, SCID Tak Tak MDS, białaczki Neutropenia Nie Umiarkowana MDS, białaczki, guzy lite Nie Nie Białaczki, guzy lite limfopenia Skróty: Ig Immunoglobuliny SCID cięŝki złoŝony niedobór odporności (ang. severe combined immune deficiency) MDS zespół mielodysplastyczny (ang. myelodysplastic syndrome) 1.2. CHŁONIAKI NIEZIARNICZE (ang. nonhodgkin lymphoma NHL) 1.2.1. Klasyfikacja chłoniaków nieziarniczych Chłoniaki stanowią heterogenną grupę złośliwych rozrostów układu chłonnego róŝniących się manifestacją kliniczną, przebiegiem oraz rokowaniem. Powstają w wyniku transformacji 13

prowadzącej do patologicznego rozrostu z reguły jednego rodzaju komórek limfoidalnych (rozrost klonalny). Od dziesięcioleci podejmowano próby sklasyfikowania chłoniaków mając świadomość, Ŝe od tego w duŝym stopniu zaleŝą wyniki ich leczenia. We wcześniejszych systemach klasyfikacji, Kilońskiej [68] i WF (Working Formulation) [69], na podstawie obrazu histopatologicznego rozróŝniano chłoniaki o niskiej, pośredniej i wysokiej złośliwości. Stały postęp wiedzy w zakresie rozwoju i funkcji układu limfatycznego, jak równieŝ biologicznych patomechanizmów prowadzących do rozwoju chłoniaków oraz wdraŝanie nowych metod diagnostycznych, w tym cytogenetycznych i molekularnych, miały wpływ na systematyczne wprowadzanie zmian klasyfikacji tych rozrostów. Doprowadziło to do opracowania załoŝeń obowiązującej obecnie klasyfikacji WHO [70], opartej na wcześniejszej klasyfikacji REAL (Revised EuropeanAmerican Classification) [71]. Wykorzystując metody umoŝliwiające ustalenie pochodzenia tzw. komórki wyjściowej (cell of origin) oraz stopień zróŝnicowania komórek nowotworowych w guzie w klasyfikacji WHO rozróŝnia się trzy zasadnicze kategorie chłoniaków: chłoniaki nieziarnicze wywodzące się z komórek B chłoniaki nieziarnicze wywodzące się z komórek T/NK chłoniak Hodgkina Chłoniaki nieziarnicze mogą wywodzić się z komórek będących na róŝnym etapie róŝnicowania, od wczesnych komórek prekursorowych (pro i pre B i T), aŝ po dojrzałe limfocyty. Stopień zróŝnicowania limfocytów określa się na podstawie profilu antygenów eksponowanych na powierzchni komórki. Klasyfikacja WHO 2001 [70] określa typ danego rozrostu na podstawie kilku parametrów, takich jak: (1) obraz morfologiczny, (2) immunofenotyp, (3) zmiany genetyczne, (4) obraz kliniczny. W 2008 wprowadzono nową modyfikację klasyfikacji WHO [72]. Pełną klasyfikację rozrostów limfoidalnych wg klasyfikacji WHO 2001 przedstawiono w Tabeli 1 w Aneksie. 1.2.2. Epidemiologia chłoniaków nieziarniczych U pacjentów poniŝej 18 roku Ŝycia chłoniaki są trzecią co do częstości (po białaczkach i guzach mózgu) grupą nowotworów, stanowiącą około 13 % wszystkich złośliwych rozrostów rozpoznawanych w tym wieku. Chłoniaki nieziarnicze stanowią około 60%, a choroba Hodgkina około 40%. Standaryzowany współczynnik zachorowalności w Europie i Stanach Zjednoczonych wynosi 79/1 milion dzieci/rok [73], w Polsce szacowany jest na 11/1 milion 14

dzieci/rok. [74]. Szczyt zachorowań u dzieci to przedział wieku 7 10 lat; pacjenci przed ukończeniem 2 roku Ŝycia chorują wyjątkowo. Chłopcy chorują dwa do trzech razy częściej niŝ dziewczęta [75,76]. Chłoniaki występują w kaŝdym wieku, ale częstość występowania poszczególnych typów chłoniaków nieziarniczych róŝni się znacznie pomiędzy populacją dziecięcą i populacją dorosłych. Generalnie, zdecydowana większość chłoniaków nieziarniczych wywodzi się z limfocytów B. U osób dorosłych przewagę stanowią chłoniaki o niskiej złośliwości i powolnym przebiegu takie jak chłoniaki grudkowe (35%), rzadziej chłoniaki rozlane z duŝych komórek (30%) czy chłoniak strefy brzeŝnej z komórek B (10%) [77,78]. W populacji dziecięcej spotyka się prawie wyłącznie chłoniaki o wysokiej złośliwości, a ich spektrum ogranicza się do czterech głównych typów: (1) chłoniaki Burkitt/Burkittlike (BL/BLL) około 50% zachorowań, (2) chłoniaki limfoblastyczne (85% z komórek T i 15% z komórek B) ponad 30% zachorowań, (3) chłoniaki z duŝych komórek B (DLBCL) około 1015% i (4) chłoniaki anaplastyczne wielkokomórkowe (ALCL) około 510% zachorowań [76,79,80,81,82,83,84]. Inne chłoniaki, takie jak chłoniak grudkowy (FL) czy chłoniak strefy brzeŝnej, oraz chłoniak z obwodowych komórek T występują u dzieci bardzo rzadko [81,85]. 1.2.3 Patogeneza chłoniaków nieziarniczych Cechą fizjologiczną limfocytów jest duŝa zmienność materiału genetycznego w obrębie określonych obszarów DNA, pozwalająca na wytworzenie ogromnej ilości (10 89 ) immunoglobulin i receptorów limfocytów T swoistych dla niezliczonych antygenów. Wykorzystywane są do tego następujące mechanizmy: (i) rekombinacji V(D)J (genów Ig i TCR), (ii) przełączania izotypów (klas) (genów Ig), (iii) somatycznych hipermutacji (genów Ig). Te procesy generują ogromną róŝnorodność przeciwciał, ale jednocześnie powodują niebezpieczeństwo takiej rearanŝacji genów, która moŝe stać się punktem wyjścia dla chłoniaka. Jedną z podstawowych przyczyn transformacji nowotworowej jest zaburzenie ekspresji genów, których produkty biorą udział w kontrolowaniu procesów podziału komórki i/lub wewnątrzkomórkowego przekazywania sygnałów. Wśród czynników stymulujących rozrost nowotworowy mogą być zarówno czynniki wewnętrzne jak i zewnętrzne. Wśród czynników wewnętrznych znaczenie mają: (i) pierwotne (wrodzone) zaburzenia odporności (m.in. w zespole Nijmegen, czy zespole ataksja teleangiektazja) [11,42,43], (ii) nabyte zaburzenia odporności (np. w AIDS, czy w wyniku jatrogennej immunosupresji po 15

przeszczepieniach narządów oraz w chorobach z autoagresji) [86,87]. Do czynników zewnętrznych zaliczamy promieniowanie jonizujące, czy związki chemiczne, ale równieŝ długotrwałą stymulację antygenami bakteryjnymi lub wirusowymi, bądź ingerencję materiału genetycznego wirusów w genom gospodarza [88,89,90]. Molekularne mechanizmy onkogenezy Molekularne podłoŝe kaŝdego rozrostu nowotworowego stanowią zmiany powodujące zaburzenie struktury i funkcji genomu. Do chwili obecnej zidentyfikowano setki genów, które mają związek z inicjacją procesu nowotworowego i/lub jego progresją. WyróŜnia się trzy klasy takich genów: (i) onkogeny, (ii) geny supresorowe, (iii) geny mutatorowe. Onkogeny są zaktywowaną formą protoonkogenów. Protoonkogeny to fragmenty prawidłowego DNA człowieka zawierające sekwencje homologiczne do genów onc obecnych w retrowirusach, które w nomenklaturze określa się jako conc. Produktami onkogenów są białka, które pełnią niezwykle istotne funkcje w komórce, m.in. jako czynniki regulujące proliferację oraz róŝne etapy cyklu komórkowego, od których zaleŝy jego progresja lub skierowanie komórki na drogę apoptozy [91]. Aktywacja szeregu onkogenów jest podłoŝem rozwoju nowotworów wywodzących się z tkanki limfoidalnej, w tym takŝe chłoniaków nieziarniczych [92]. Geny supresorowe, nazywane inaczej antyonkogenami kodują białka pełniące rolę hamującą procesy podziału komórki (ang. gatekeepers) lub stabilizującą / integrującą genom poprzez uczestniczenie w róŝnych szlakach naprawy DNA (ang. caretakers) [93]. Geny związane z naprawą DNA i utrzymaniem stabilności genomu dziedziczą się autosomalnie recesywnie, a u osób, u których uszkodzone są w wyniku mutacji oba allele, odnotowuje się wysoką zachorowalność na nowotwory, zwłaszcza chłoniaki. Przykłady takich chorób to, m.in., zespół ataksja teleangiektazja (gen ATM), zespół Nijmegen (gen NBN/NBS1), defekt ligazy DNA IV (gen DNA LIG4) [9,17,87]. Geny mutatorowe odpowiadają za naprawę błędów w strukturze DNA. Do tej grupy naleŝą geny związane z naprawą błędnie sparowanych zasad (ang. mismatch repair; MMR), m.in. MSH2, MSH6, MLH1. Nie powodują one bezpośrednio transformacji nowotworowej, ale poprzez lawinowy wzrost liczby mutacji w obrębie róŝnych genów destabilizują genom i taką transformację ułatwiają [94,95]. Zmiany genetyczne w chłoniakach nieziarniczych Mechanizmy genetyczne leŝące u podłoŝa rozwoju chłoniaków są bardzo zróŝnicowane i obejmują następujące typy zdarzeń [96,97]: mutacje (somatyczne) zmieniające strukturę genu, 16

amplifikacje powodujące zwielokrotnienie liczby kopii genów, delecje genów lub ich fragmentów, translokacje chromosomowe, w wyniku których gen zostaje przeniesiony w sąsiedztwo locus innych genów. Mutacje somatyczne w chłoniakach nieziarniczych dotyczą głównie genów cmyc, bcl2 (z towarzyszącą translokacją obejmującą locus IgH) i bcl6 (z translokacją IgH lub niezaleŝnie od niej) [92,96]. Wykazanie mutacji w genie bcl6 wskazuje na pochodzenie rozrostu z centrum rozrodczego węzła chłonnego. Mutacje w genie supresorowym p53, podobnie jak delecje, prowadzą do utraty jego prawidłowej funkcji w kontroli cyklu komórkowego [98]. Amplifikacje liczby kopii genów prowadzą do wielokrotnie zwiększonej produkcji białek odpowiadających za proliferację lub oporność na cytostatyki. W chłoniakach nieziarniczych wykazano amplifikację genów cmyc, bcl2 czy REL [99]. Delecje, zwłaszcza w obrębie genów supresorowych (np. p53), prowadzą do utraty ich funkcji i promocji rozwoju chłoniaków w wyniku braku aktywności w punktach kontrolnych cyklu komórkowego. W genie p53 dochodzi najczęściej do delecji eksonów od 5 do 8, a właśnie ten fragment DNA ma zasadniczy wpływ na aktywność biologiczną białka p53 [100]. Znacznie częściej moŝe dochodzić do utraty pojedynczych nukleotydów i tzw. niestabilności mikrosatelitarnej [96]. RearanŜacje (translokacje) chromosomowe Opisanie w 1976 roku [101] pierwszej zmiany w kariotypie z komórek chłoniaka Burkitta w postaci translokacji t(8;14) zapoczątkowało intensywne badania, które, dzięki zastosowaniu coraz bardziej wyszukanych molekularnych technik cytogenetycznych, umoŝliwiają wnikanie w istotę zmian genetycznych w róŝnych typach chłoniaków. Najczęściej występują translokacje zrównowaŝone (wzajemne), stwierdzane u ponad 50% pacjentów z chłoniakami nieziarniczymi [102], rzadziej translokacje niezrównowaŝone, w wyniku których dochodzi do delecji lub duplikacji [97]. Translokacje wzajemne są głównym mechanizmem aktywacji protoonkogenów w chłoniakach B i Tkomórkowych wywodzących się z dojrzałych limfocytów [103]. W przypadku chłoniaków Bkomórkowych elementy regulatorowe pochodzą z genów dla Ig, natomiast dla Tkomórkowych z genów TCR. Przemieszczenie sekwencji kodujących protoonkogenu w bezpośrednie sąsiedztwo silnego promotora innego genu skutkuje niekontrolowaną translacją i nadekspresją fizjologicznie nieaktywnych białek, które biorą udział w regulacji cyklu komórkowego lub przenoszeniu sygnałów wewnątrz komórki [104]. 17

Translokacje w chłoniakach z dojrzałych limfocytów B Największe zmiany cytogenetyczne zachodzą w chłoniakach z dojrzałych limfocytów B. W populacji dziecięcej dotyczy to chłoniaka Burkitta i DLBCL. W patogenezie chłoniaka Burkitta kluczowe znaczenie ma aktywacja onkogenu cmyc. Najczęściej występuje translokacja t(8;14)(q24;q32) (85% przypadków BL), w wyniku której onkogen cmyc zostaje przeniesiony w region promotora genu kodującego łańcuchy cięŝkie immunoglobulin (IGH) na chromosomie 14, rzadziej (10%) w region genu dla łańcuchów lekkich λ (IGL) na chromosomie 22 t(8;22)(q24;q11), czy genu dla łańcuchów lekkich κ (IGK) na chromosomie 2 t(2;8)(p12;q24) stanowiąca około 5%. Skutkuje to aktywacją protoonkogenu cmyc i zwiększoną ekspresją jego produktu białkowego białka cmyc stymulującego procesy proliferacji limfocytów poprzez aktywację fazy G2 cyklu komórkowego [105]. Translokacje onkogenu cmyc towarzyszą głównie chłoniakowi Burkitta [92], rzadziej DLBCL (15%) czy BALL [106, 107]. W około 30% przypadków chłoniaka typu DLBCL stwierdza się translokację t(14;18)(q32;q21), w wyniku której dochodzi do nadekspresji inhibitora apoptozy, genu bcl2, znajdującego się na chromosomie 18q21. WzmoŜona synteza białek Bcl2 zapobiega programowanej śmierci limfocytów B, a więc działa jak czynnik immortalizujący komórki B, niezaleŝnie od sygnałów promujących apoptozę [92]. Nieco rzadziej stwierdza się translokacje t(8;14)(8q24;14q32) i t(3q27;14q32), zaburzające ekspresję genów cmyc (8q24) i bcl6 (3q27) [106,107]. Białko Bcl6, poprzez działanie supresyjne na proces apoptozy, pozwala na przeŝycie komórkom z niewielką ilością pęknięć DNA. Nadekspresja Bcl6 związana z translokacją onkogenu bcl6 z chromosomu 3 (3q27) w pobliŝe genów dla łańcuchów cięŝkich IGH t(3;14) lub lekkich IGL t(3;22) i IGL t(2;3) moŝe prowadzić do przeŝywania komórek pomimo istniejących zaburzeń w obrębie DNA i ich zwiększonej proliferacji [108]. Translokacje te są wykrywane w 3040% przypadków chorych z DLBCL [109]. Translokacje w chłoniakach Tkomórkowych W chłoniakach Tkomórkowych typowym przykładem translokacji jest t(2;5)(p23;q35), częsta w przypadku ALCL, skutkująca pojawieniem się białka hybrydowego (fuzyjnego) NPMALK. Na skutek fuzji NPMALK, ALK posiada konstytutywną aktywność kinazy tyrozynowej co moŝe skutkować fosforylacją substratów mitogennych i prowadzić do transformacji nowotworowej [110]. W TLBL, najczęstszym chłoniaku z komórek T w populacji dziecięcej, dochodzi do wielu zaburzeń cytogenetycznych, obejmujących liczne protoonkogeny (TAL1, TAL2, LMO1, 18

LMO2, HOX11, HOX11L2, LYL1, cmyc, NOTCH1, LCK), co powoduje deregulację ich ekspresji poprzez przemieszczenie w pobliŝe locus TCRB na chromosomie 7q34 lub łańcucha TCRD na chromosomie 14q11 i zwiększenie transkrypcji [111]. W 30% przypadków TLBL dochodzi do uszkodzenia genu TAL1 [112]. U 510% chorych z TLBL występują translokacje powodujące nadekspresję genu HOX11, częściej obejmujące kompleks łańcucha TCRD na chromosomie 14q11 t(10;14)(q24;q11), rzadziej locus łańcucha TCRB na chromosomie 7 t(7;10)(q35;q24); prowadzą one do transaktywacji ekspresji wielu innych genów biorących udział w patogenezie TLBL [112,113]. Translokacje powstające w wyniku rearanŝacji genów IG/TCR Analiza molekularna translokacji w chłoniakach potwierdza, Ŝe głównym mechanizmem odpowiadającym za ich powstanie są procesy rearanŝacji genów IG oraz TCR zachodzące wyniku pęknięcia obu nici DNA podczas dojrzewania limfocytów [114,115]. Przykładem translokacji powstałych w wyniku błędów w procesie przełączania klas są translokacje t(8;14) (IGH/MYC) w chłoniaku Burkitta oraz t(3;14) (IGH/BCL6) w DLBCL. Świadczą o tym pęknięcia w loci genów kodujących regiony C [115]. Rola wirusów w patogenezie chłoniaków nieziarniczych Wirusy od dawna były wiązane z onkogenezą, ale bezpośrednie dowody na udział zakaŝeń wirusowych w etiopatogenezie chłoniaków istnieją dotychczas jedynie dla dwóch wirusów: EBV (EpsteinBarr virus) dla chłoniaka Burkitta w postaci endemicznej i postransplantacyjnego zespołu limfoproliferacyjnego (PTLD) oraz wirusa HTLVI dla chłoniaka/ białaczki z komórek T typu dorosłych ATLL (adult Tcell lymphoma/leukemia). Wirus EBV wiązany jest teŝ z etiopatogenezą DLBCL u pacjentów z zaburzeniami odporności, z rakiem nosogardła, chorobą Hodgkina, rakiem Ŝołądka [116,117]. Dla takich wirusów jak: HIV1 i HIV2, CMV, HCV, HHHV8 oraz SV40 i HTLVII, istnieją dowody sugerujące, Ŝe odgrywają one rolę w powstawaniu chłoniaków nieziarniczych, ale roli tej w pełni nie potwierdzono [118,119]. 1.2.4. Chłoniaki nieziarnicze w ogólnej populacji dzieci i młodzieŝy Objawy kliniczne Kliniczna manifestacja chłoniaków moŝe być bardzo róŝnorodna i zaleŝy od typu histologicznego i biologii nowotworu, lokalizacji ogniska pierwotnego oraz stadium zaawansowania choroby. W przeciwieństwie do chłoniaków występujących u osób dorosłych, manifestujących się głównie powiększeniem węzłów chłonnych, u dzieci często zajęte są obszary pozawęzłowe. Chłoniaki dziecięce mogą mieć przebieg bardzo gwałtowny, zwłaszcza 19

dotyczy to chłoniaków limfoblastycznych oraz chłoniaka Burkitta, gdzie czas podwojenia komórek moŝe dochodzić do kilkunastu godzin i w rezultacie, ponad połowa pacjentów w momencie rozpoznania ma chorobę bardzo zaawansowaną miejscowo lub rozsianą [82]. Symptomatologia chłoniaków zaleŝy od lokalizacji zmian i szybkości ich rozprzestrzeniania się: W jamie brzusznej częściej rozwijają się chłoniaki Bkomórkowe (zwłaszcza chłoniak Burkitta) a objawami mogą być: bóle brzucha, objawy dyspeptyczne, nudności, wymioty, zaburzenia pasaŝu jelitowego (niedroŝność, wgłobienie) oraz objawy przedmiotowe: zniekształcenie powłok, macany palpacyjnie opór w jamie brzusznej. W części przypadków jednym z pierwszych objawów jest wgłobienie krętniczokątnicze. W obrębie klatki piersiowej częściej występują chłoniaki limfoblastyczne Tkomórkowe (TLBL), a pierwszymi objawami choroby mogą być: kaszel, nawracające infekcje dróg oddechowych, ból w klatce piersiowej, wysięk w opłucnej, zespół Ŝyły głównej górnej. MoŜe teŝ wystąpić objaw Hornera. Gwałtowne narastanie objawów moŝe prowadzić do niewydolności oddechowej. Okolica głowy i szyi najczęściej zajęta jest w chłoniaku Burkitta (zwłaszcza pierścień Waldeyera), ale teŝ w DLBCL, chłoniakach limfoblastycznych zarówno z komórek B jak i T, czy ALCL. Obserwuje się powiązania pomiędzy poszczególnymi lokalizacjami, np. jedna czwarta pacjentów z zajętym pierścieniem Waldeyera ma takŝe zajęty przewód pokarmowy i odwrotnie, a u pacjentów z zajęciem jąder lub zatok obocznych nosa istotnie częściej dochodzi do zajęcia opon mózgowych. Izolowane zajęcie kości objawiające się bolesnością zajętej okolicy najczęściej występuje w przebiegu prekursorowego chłoniaka z komórek B lub DLBCL. Ucisk rdzenia kręgowego przez nieprawidłową masę zewnątrzoponową moŝe być jednym z pierwszych objawów chłoniaka Burkitta lub DLBCL i objawiać się nagłą paraplegią. Zajęcie OUN moŝe manifestować się bólami głowy, wymiotami, drgawkami, poraŝeniem nerwów czaszkowych, O zajęciu szpiku świadczyć mogą: bladość powłok, wybroczyny, podbiegnięcia krwawe,, krwawienia z nosa czy śluzówek jamy ustnej, bóle kości długich. Stadium zaawansowania NHL określa się wg klasyfikacji St. Jude [120], którą przedstawiono w tabeli 2. 20

Tabela 2. Klasyfikacja stadiów zaawansowania NHL wg St. Jude Stadium I II III IV Lokalizacja zmian nowotworowych pojedynczy guz pozawęzłowy lub pojedyńcze umiejscowienie węzłowe (bez lokalizacji śródpiersiowej i brzusznej) pojedynczy guz pozawęzłowy z zajęciem regionalnych węzłów chłonnych; dwa lub więcej umiejscowień węzłowych po tej samej stronie przepony; dwa pojedyńcze guzy pozawęzłowe po tej samej stronie przepony z/lub bez zajęcia regionalnych węzłów chłonnych; pierwotny guz przewodu pokarmowego z/lub bez zajęcia regionalnych węzłów chłonnych krezkowych który moŝe być radykalnie usunięty chirurgicznie dwa pojedyncze guzy pozawęzłowe po obu stronach przepony; dwie lub więcej lokalizacji węzłowych po obu stronach przepony; wszystkie pierwotne guzy w klatce piersiowej; wszystkie rozległe lokalizacje brzuszne; wszystkie guzy okołordzeniowe KaŜde z powyŝszych umiejscowień, jeśli współistnieje z zajęciem OUN i/lub szpiku kostnego Diagnostyka chłoniaków nieziarniczych u dzieci i młodzieŝy Podstawą diagnostyki chłoniaków nieziarniczych u dzieci i młodzieŝy jest całościowa ocena wyników badania podmiotowego i przedmiotowego oraz badań pomocniczych, w tym badań laboratoryjnych i obrazowych (radiografia, ultrasonografia, tomografia komputerowa, rezonans magnetyczny, scyntygrafia z uŝyciem Tc99 i Ga, pozytronowa tomografia emisyjna) Do ostatecznego rozpoznania chłoniaka kluczowe i niezbędne jest badanie histopatologiczne materiału pobranego z guza, płynu z opłucnej lub otrzewnej, płynu mózgowordzeniowego, punkcji aspiracyjnej i/lub biopsji szpiku. Standardem w diagnostyce chorób limfoproliferacyjnych jest badanie histopatologiczne oraz immunohistochemiczne z zastosowaniem panelu przeciwciał monoklonalnych skierowanych przeciwko określonym antygenom komórek chłoniaka [121]. Metody te pozwalają określić nie tylko linię rozwojową, z której wywodzą się komórki nowotworowe, ale i stopień ich dojrzałości. Pomocne bywa oznaczanie transferazy nukleotydów terminalnych (Tdt) obecnej tylko w chłoniakach z komórek prekursorowych, czy białka Bcl6 związanego z centrum rozrodczym węzła chłonnego, obecnego tylko w chłoniakach z dojrzałych komórek B. W przypadkach wątpliwych rolę rozstrzygającą ma wykrycie poszczególnych translokacji chromosomowych, charakterystycznych dla konkretnych typów chłoniaka, choć badanie cytogenetyczne nie jest wykonywane powszechnie i jeszcze nie wszędzie jest dostępne. Metodą cytometrii przepływowej bada się immunofenotyp komórek, (nad)ekspresję onkogenów Bcl2 czy ALK i obecność łańcuchów lekkich immunoglobulin κ lub λ. Technika PCR i/lub SplitFISH 21

wykorzystywana jest do wykrywania klonalnych rearranŝacji w genach Ig/TCR lub aberracji chromosomowych [122,123]. W tabeli 3 przedstawiono róŝnice w w/w badaniach obserwowane w poszczególnych typach rozrostów. Tabela 3. RóŜnice w badaniach immunohistochemicznych i cytogenetycznych w poszczególnych podtypach nieziarniczych chłoniaków wieku dziecięcego. Marker Burkitt DLBCL pblbl TLBL PTCL ALCL TdT + + CD34 + + CD1a +/ CD3 /+ +/ /+ CD4 /+ +/ /+ CD5 /+ +/ +/ /+ CD7 +/ +/ /+ CD8 /+ /+ /+ CD10 + +/ +/ +/ CD19 + + + CD20 + + +/ CD30 /+ /+ + CD56 /+ /+ CD79a + + + Bcl 6 + +/ Pax 5 + + + Alk 80% + Cytogenetyka t(8;14) t(2;8) t(8;22) t(14;18) t(8;14) t(3;14) t(1;14) t(11;14) del TAL1 t(2;5) t(1;2) DLBCL rozlany chłoniak z duŝych komórek B,,TLBL chłoniak limfoblasyczny Tkomórkowy, pblbl chłoniak limfoblastyczny z komórek preb, ALCL chłoniak anaplastyczny wielokomórkowy, + dodatni, ujemny, +/ często dodatni, /+ często ujemny Wykrywanie i identyfikacja zmian genetycznych ma coraz większe znaczenie nie tylko dla precyzyjnego zakwalifikowania rozrostu do danego podtypu, ale takŝe dla prognozowania przeŝycia i konieczności intensyfikacji leczenia u chorych z obecnością określonych translokacji [122] oraz dla opracowania nowych metod leczenia z wykorzystaniem odpowiednich celów molekularnych [124,125]. Badanie choroby resztkowej (ang. minimal residual disease MRD) Rozrosty limfoidalne zawierają klonalne rearranŝacje genów Ig/TCR które mogą być zidentyfikowane w badaniu MRD. Badanie choroby resztkowej w białaczkach przyczyniło się do opracowania nowej klasyfikacji pacjentów uwzględniającej grupy ryzyka wyraźnie róŝniące się rokowaniem (6letnie EFS 98%, 75% i 20% dla grup o niskim, pośrednim i 22

wysokim ryzyku) [126,127]. Podobne próby zostały podjęte u pacjentów z chłoniakami. O ile poszukiwanie MRD w szpiku i/lub krwi obwodowej moŝe być efektywne u chorych z chłoniakami limfoblastycznymi czy chłoniakiem Burkitt/Burkittlike, o tyle w przypadkach o mniejszej tendencji do rozsiewu, jak DLBCL czy ALCL, efektywność tych metod spada. W praktyce, badanie MRD wykonuje się tylko w 3 typach NHL: FL, MCL (mantle cell lymphoma) i BL, badając obecność translokacji t(14;18), t(11;14) i t(8;14) [128]. 1.2.5. Leczenie chłoniaków nieziarniczych u dzieci i młodzieŝy: W terapii chłoniaków u dzieci znalazły zastosowanie wszystkie metody leczenia przeciwnowotworowego: chemioterapia, chirurgia i radioterapia. Udział w/w metod jest róŝny w zaleŝności od lokalizacji, stopnia zaawansowania i immunofenotypu komórek nowotworowych. Chłoniaki dziecięce zaliczane są do nowotworów o największej dynamice przebiegu klinicznego. W związku z faktem, Ŝe wielkość frakcji wzrostowej moŝe dochodzić prawie do 100%, a długość cyklu komórkowego do kilkunastu godzin, są to nowotwory wybitnie chemiowraŝliwe i u większości chorych wyleczenie moŝna uzyskać samą chemioterapią. Chirurgia odgrywa rolę marginalną, polegającą na pobraniu materiału do badania histopatologicznego i ewentualnym usunięciu resztkowej masy pozostałej po wstępnej chemioterapii. Radioterapia stosowana jest u pacjentów z zajęciem OUN i coraz rzadziej w profilaktyce jego zajęcia. W wybranych przypadkach napromienia się śródpiersie u pacjentów z zespołem Ŝyły głównej górnej oraz lokalnie resztkową masę guza niemoŝliwą do weryfikacji histopatologicznej. Obecnie wyróŝnia się trzy główne grupy chłoniaków wieku dziecięcego, w których stosuje się odmienną strategię leczenia: (1) chłoniaki limfoblastyczne (głównie z komórek T, rzadko z prekursorowych komórek B), (2) chłoniaki z dojrzałych komórek B (chłoniaki Burkitta i DLBCL) oraz (3) chłoniaki anaplastyczne wielokomórkowe ALCL. W 1993 roku Anderson i wsp. [129] opublikowali wyniki randomizowanego badania Children s Cancer Group (CCG551), w którym porównali wyniki leczenia chłoniaków nieziarniczych dwoma róŝnymi protokołami i stwierdzili, Ŝe: (1) róŝne protokoły chemioterapii wywoływały róŝne efekty w poszczególnych typach chłoniaków; (2) róŝnice w skuteczności leczenia dotyczyły głównie zaawansowanych stadiów choroby; (3) w zaawansowanych stadiach skuteczność leczenia pacjentów z chłoniakami limfoblastycznymi była większa przy stosowaniu programu LSA2L2 opartego na programie leczenia białaczek limfoblastycznych, a dla pacjentów z BL na programie COMP. 23

Obecnie w chłoniakach limfoblastycznych strategia leczenia opiera się na stałej ekspozycji na cytostatyki przez długi okres czasu, podobnie jak ma to miejsce w ALL. Cały cykl leczenia trwa od 18 do 24 miesięcy. Przeciwna strategia, oparta na krótkich, intensywnych, powtarzanych kursach chemioterapii okazała się bardzo skuteczna w leczeniu BALL i chłoniaków z dojrzałych komórek B, w tym takŝe w DLBCL [79,130,131]. Natomiast pacjenci z ALCL wymagają odmiennej strategii leczenia ze względu na inne czynniki prognostyczne i wysoką skłonność do nawrotów. Jednocześnie osiągają oni wysoki odsetek przeŝyć po wystąpieniu wznowy w porównaniu z pozostałymi typami chłoniaków [132]. Od kilku lat stosuje się odrębny protokół dla leczenia ALCL [133]. Dla rzadkich chłoniaków w wieku dziecięcym, takich jak jak chłoniak z obwodowych komórek T/NK czy chłoniak grudkowy, nie ma jeszcze ustalonego programu leczenia; moŝna stosować program CHOP lub inne z kliniki dorosłych. Strategia leczenia chłoniaków limfoblastycznych W leczeniu TLBL (i znacznie rzadziej BLBL) najczęściej stosowane były kolejne protokoły grupy BFM (86, 90, 96) lub LSA2L2 i jego modyfikacje [79,134]. Oba protokoły obejmowały zastosowanie kolejno faz cytoredukcji, indukcji, konsolidacji i reindukcji leczenia oraz wielomiesięcznego leczenia podtrzymującego trwającego od 18 24 miesięcy od początku leczenia, z uŝyciem podobnych leków (kortykosterydy, winkrystyna, antracykliny, Lasparaginaza, cyklofosfamid, metotreksat, cytarabina, 6merkaptopuryna i 6 tioguanina), a róŝniły się głównie wcześniejszym stosowaniem Lasparaginazy i wysokich dawek metotreksatu w programie BFM. Stosowano w nich takŝe profilaktyczne napromienianie OUN. Ostatnio stosowany program wypracowany przez Europejską Grupę ds. Leczenia Nieziarniczych Chłoniaków u Dzieci (EICNHL, European Intergroup Cooperation on Childhood nonhodgkin Lymphoma) EUROLB02 jest bardzo zbliŝony do wcześniejszego protokołu grupy BFM, a róŝni się stosowaniem deksametazonu zamiast prednizonu, rezygnacją z profilaktycznego napromieniania OUN, oraz próbą skrócenia leczenia z 24 do 18 miesięcy. Nie ma na razie opracowań podsumowujących wyniki leczenia protokołem EUROLB02 ze względu na zbyt krótki okres jego stosowania. Próby skrócenia leczenia podtrzymującego u pacjentów w I i II stadium zaawansowania do 24 tygodni po 9 tygodniowej fazie indukcji spowodowały spadek EFS z 88% do 63% [135]. Wydaje się więc, Ŝe biologiczne podobieństwo do ALL jest waŝniejsze niŝ niskie stadium zaawansowania i pacjenci wymagają leczenia protokołem bliŝszym leczeniu białaczek [82]. 24