Technologia organiczna surowce i procesy przemysłu organicznego. Synteza enzymatyczna wprowadzenie / Niebieskie fragmenty tekstu wykraczają poza obowiązujący zakres materiału./ Człowiek od dawna, na co dzień stykał się nieświadomie z działaniem enzymów, na przykład przy takich procesach jak produkcja wina lub piwa, wytwarzanie serów, czy psucie się produktów Ŝywnościowych. W 1897 r bracia Buchner przeprowadzali fermentację alkoholową poza komórką za pomocą płynu wyciśniętego z droŝdŝy. W 1926 r Summer otrzymał pierwszy enzym w stanie krystalicznym(ureazę). becnie znanych jest tysiące enzymów klasyfikowanych zgodnie z powszechnie stosowanym systemem. Wszystkie enzymy podzielono na sześć klas głównych, a mianowicie: 1. Hydoreduktazy (katalizujące reakcje oksydoredukcyjne) 2. Transferazy (reakcje przenoszenia grup pomiędzy poszczególnymi związkami) 3. Hydrolazy (reakcje hydrolizy), naleŝą do nich m.in. lipazy. 4. Liazy (odłączenie grup od substratu) 5. Izomerazy (reakcje izomeryzacji) 6. Ligazy (wytwarzanie wiązań między dwiema cząsteczkami) Enzymy hydrolityczne (temat naszego ćwiczenia), pamiętamy, Ŝe hydroliza to rozpad związku pod wpływem wody, są nam doskonale znane z Ŝycia codziennego. Hydrolizie tłuszczy, tak zwanemu jełczeniu, towarzyszy niemiły zapach wolnych kwasów tłuszczowych. Szczególnie łatwo jełczeniu ulega masło. Zawiera przecieŝ ~20% wody, jest emulsją. Jako układ lipidowo-wodny, stanowi idealne środowisko do działanie hydrolaz. Enzymatyczne proszki do prania zawierają proteazy (hydroliza białek) a często i lipazy (hydroliza tłuszczy) i stąd ich efektywne działanie w łagodnych warunkach. Konie i inne zwierzęta trawoŝerne z poŝytkiem zjadają bogate w celulozę zdrewniałe części roślin. Człowiek nie, bo w przewodzie pokarmowym nie posiada mikroorganizmów wytwarzających enzymy (celulazy) hydrolizujące celulozę do cukrów prostych. Hydrolazy bywają skrajnie niebezpieczne. Jad większości Ŝmij (a moŝe i teściowych) ma w swym składzie fosfolipazy, enzymy hydrolizujące fosfolipidy, podstawowy budulec błon komórkowych. Taka fosfolipaza doprowadzając do rozpadu błon komórkowych powoduje
martwice tkanek a w konsekwencji cięŝkie ich uszkodzenie, stanowiąc śmiertelne zwykle zagroŝenie dla ich właściciela. Wniosek ogólny: to nie Ŝywe organizmy, dokonują bezpośrednio przemian związków chemicznych, a produkowane przez nie enzymy. Wcale nie Ŝywe droŝdŝe mają umiejętność przetwarzania niektórych węglowodanów na alkohol, a produkowane przez nie martwe białkowe katalizatory. Podobnie nie bakterie kwasu mlekowego (Lactobacillus) wytwarzają kwas mlekowy (kefir, jogurt, kiszona kapusta, kiszone ogórki, itd.), a enzymy produkowane zresztą przez wiele innych organizmów. biektem naszego zainteresowania są lipazy, jedna z klas enzymów hydrolitycznych, hydrolaz. Lipazy moŝemy zdefiniować, jako 3.1.1.1. acyloglicerolazy, czyli katalizatory hydrolizy naturalnych triglicerydów, tłuszczy. Gdzie poszczególne liczby kodu oznaczają: hydrolazy 3.1.1.3 wiązania estrowe kwasy karboksylowe triacyglicerole Nasz wybór nie jest przypadkowy. Z natury lipazy działają w środowisku lipidowym, niewodnym, a ściśle mówiąc na granicy faz woda-lipidy. kazało się, Ŝe większość lipaz jest stosunkowo mało specyficzna. Katalizuje nie tylko hydrolizę triglicerydów a równieŝ szereg innych zwykłych reakcji chemicznych, pochodnych kwasów karboksylowych. W zasadzie do roku 1970 panowało przekonanie, Ŝe enzymy mogą działać jedynie w środowisku wodnym. Nikt do tamtej pory nie zwrócił uwagi na prace opublikowane juŝ w latach trzydziestych ubiegłego stulecia przez polskiego uczonego, profesora Politechniki Gdańskiej, Ernesta Aleksandra Syma, mimo, Ŝe artykuły te zamieszczane były w bardzo dobrych, międzynarodowych czasopismach. kazuje się, Ŝe Sym stworzył podstawy zastosowań rekcji enzymatycznych w rozpuszczalnikach organicznych, na których obecnie opiera się ogromny przemysł produkcji czystych chemikaliów, wykorzystujący specyficzne właściwości enzymów. Biokatalizatory zwiększają szybkość reakcji poprzez (ogólnie ujmując istotę rzeczy): - selektywne zbliŝenie substratów reakcji duŝe ich stęŝenie w centrum aktywnym 2
- stabilizację stanu przejściowego Mechanizm działania hydrolaz jest dość dobrze poznany. Niektóre z enzymów udało się przeprowadzić do formy krystalicznej, co umoŝliwiło rentgenoskopowe zbadanie ich struktury. My pominiemy istotne dla działania hydrolaz elementy przestrzennej konformacji. Popatrzymy tylko na uproszczoną skrajnie, chemiczną stronę biokatalizy. Spróbujmy przyjrzeć się reakcji alkoholizy estru, czyli substytucji w estrze jednego alkoholu drugim. CH 2CHCH CH 2 CH HN N +H + -H + HN NH NH N NH 2 NH N NH 2 imidazol aminokwas histydyna hormon histamina Ser enzym H R C ester I H Ser C R Ser C acyloenzym alkohol "stary" + RH H alkohol "nowy" R' H R' R' + C Ser C acyloenzym Ser C Ser H enzym ester II Zasadniczą rolę grają tu dwa aminokwasy: seryna, dysponująca grupą H, swoisty alkohol i histydyna, której elementem struktury jest imidazol, bardzo silna zasada organiczna, nukleofil zdolny do wiązania protonu. tydyna polaryzuje wiązania H w serynie ułatwiając nukleofilowy na grupę karbonylową estru I. W rezultacie powstaje przejściowy związek acyloenzym, czyli ester seryny z kwasem karboksylowym, a stary alkohol odchodzi. ZbliŜający się do centrum reakcyjnego nowy alkohol, aktywizowany jest przez histydynę i łączy się z grupą karbonylową acyloenzymu. Wtedy nasz przejściowy kompleks rozpada się: dostajemy ester nowego alkoholu i odtworzony do postaci pierwotnej enzym katalizator. Zalety katalizy enzymatycznej reakcje przebiegają w łagodnych warunkach (temperatura pokojowa, ph~7), co ma duŝe znaczenie szczególnie wtedy, gdy mamy do czynienia z niestabilnymi substratami oraz produktami 3
wymagane są mniejsze nakłady energii oraz mniej skomplikowana aparatura, co pozwala na znaczne obniŝenie kosztów prowadzenia procesu charakterystyczny jest brak produktów ubocznych, jeśli natomiast produkty takie się pojawią, są one nieszkodliwe dla środowiska i biodegradowalne enzymy mają określoną specyficzność działania i dlatego mogą prowadzić ściśle wybrane reakcje (wysoka selektywność enancjo- regio- i substratowa) działanie enzymów moŝe być łatwo kontrolowane w czasie procesu i łatwo przerywane, gdy jest on dostatecznie zaawansowany, na przykład przez ogrzanie produkcja enzymów nie wymaga deficytowych surowców, a jedynie soli mineralnych i tanich zwykle odpadowych węglowodanów Są i teŝ wady: cena preparatów enzymatycznych bywa wysoka łagodne warunki reakcji nie zawsze są korzystne z procesowego i ekonomicznego punktu widzenia wiele substancji dezaktywuje a wręcz trwale denaturuje białkową strukturę enzymu Zwróćmy uwagę na enancjoselektywność działania enzymów. Tym aspektem zajmujemy się na naszych ćwiczeniach. ChociaŜ enancjomery mają identyczne właściwości chemiczne w niechiralnym środowisku, w przyrodzie oŝywionej asymetria optyczna odgrywa duŝą rolę. Jest tak poniewaŝ natura sama w sobie jest niesymetryczna. rganizmy Ŝywe są zbudowane z optycznie czynnego, chiralnego materiału. Dwa enancjomery tej samej substancji mogą mieć zupełnie inne, bywa przeciwstawne działanie fizjologiczne. W związku z tym rozdział enancjomerów ma bardzo duŝe znaczenie w wielu gałęziach przemysłu a szczególnie produkcji leków. Czystość optyczne jest bardzo waŝną właściwością leków, gdyŝ w mieszaninie racemicznej mogą występować enancjomery, z których jeden ma właściwości lecznicze, a drugi albo ich nie posiada, albo wręcz jest szkodliwy rganizm przekształca kaŝdy z enancjomerów innym szlakiem metabolicznym prowadząc tym samym do róŝnej aktywności farmakologicznej. Chiralność jest obecnie głównym zagadnieniem w projektowaniu, produkcji, ulepszaniu, wdraŝaniu i dystrybucji nowych leków. W ostatnich dekadach farmakopea zdominowana była przez racematy, jednak od kiedy, w 4
latach 80-tych ubiegłego stulecia pojawiły się nowe technologie pozwalające na otrzymywanie czystych enancjomerów w znaczących ilościach, świadomość i zainteresowanie stereochemią działania leków znacznie wzrosło. Światowa sprzedaŝ chiralnych leków w postaci czystych enancjomerów nadal wzrasta. Jednym ze sposobów produkcji czystych enecjomerów jest wykorzystanie reakcji enancjoselektywnych, w tym katalizowanych enzymatycznie. Zwykle wykorzystuje się tak zwany rozdział kinetyczny, czyli róŝnice szybkości reakcji enancjomerów. Na koniec 2 niewinne wzory związane z procesami enancjoselektywnymi: Tak zwana czystość optyczna. czywisty wzór odzwierciedlający proporcje poszczególnych enencjomerów w mieszaninie, proste o ile tę proporcje umiemy oznaczyć: ( A B) ee =, gdzie ( A + B) A i B oznaczają powierzchnie sygnałów chromatograficznych generowanych przez poszczególne enancjomery. I enancjoselektywność, z definicji stosunek stałych szybkości reakcji poszczególnych enancjomerów. Enancjoselektywność w ten sposób zdefiniowaną oznaczyć zwykle trudno, ale moŝna wykorzystać w tym celu wzór Chena, wyraŝający enancjoselektywność E w funkcji czystości optycznej ee s (substratu) i konwersji c: ln[(1 c) x(1 ees )] E= ln[(1 c) x(1 + ee )] s becnie najczęściej wytwarza się preparaty enzymatyczne unieruchomione (immobilizowane) na stałych nośnikach. Stosowanie preparatów immobilizowanych prowadzi do znacznych korzyści, choć jest drogą procedurą, w tym: moŝliwość wielokrotnego uŝycia stabilizacją właściwości i zwiększona odporność na działanie czynników związanych ze środowiskiem reakcji (ph, temperatura, inhibitory) 5
Część eksperymentalna Przedmiotem naszych ćwiczeń będzie reakcja transestryfikacji estrów metylowych kwasów tłuszczowych (EMKT) rozgałęzionym izomerem oktanolu, 2-etyloheksanolem. Produkt reakcji jest cieczą o stosunkowo niskiej lepkości, znajdującą zastosowanie praktyczne, jako komponent tuszu do drukarek. Warto zwrócić uwagę, Ŝe 2-etyloheksanol jest związkiem optycznie czynnym. Biokataliza stwarza szansę uzyskanie optycznie czynnego produktu syntezy, czystego enancjomeru. To istotne, bo jeden z enancjomerów 2- etyloheksanolu jest trujący dla człowieka, wykazuje działanie teratogenne. czywiście reakcję moŝna przeprowadzić konwencjonalnie, ale: - trzeba stosować wysokie temperatury (reagenty ulegają degradacji) - konieczne jest uŝycie zwykle agresywnego katalizatora np. kwasu siarkowego - niezbędna jest specjalistyczna aparatura - produkt wymaga uciąŝliwej rafinacji: separacja katalizatora, produktów ubocznych Reakcję moŝemy schematycznie zapisać: CH 3 CH 2 CH 2 CH 2 CHCH 2 H CH 3 (CH 2 ) 7 CH CH(CH 2 ) 7 CCH 3 CH 2 CH 3 2-etyloheksanol enzym oleinian metylu CH 3 (CH 2 ) 7 CH CH(CH 2 ) 7 CCH 2 CHCH 2 CH 2 CH 2 CH 3 oleinian 2-etyloheksylu CH 2 CH 3 CH 3 H metanol W ramach ćwiczenia będziemy badać róŝne aspekty powyŝszego bioprocesu, wskazywane na bieŝąco przez prowadzącego, w tym: - badanie aktywności katalitycznej preparatów enzymatycznych - wyznaczenie enecjoselektywności reakcji - ocena wpływu temperatury na szybkość i selektywność reakcji Prowadzony proces będzie monitorowany analitycznie metodą chromatografii gazowej. Skład enancjomerów moŝna teŝ i to bardzo precyzyjnie wyznaczyć metodą GC, posługując się specjalną kolumną z optycznie czynną fazą aktywną (cyklodekstryny). Więcej wiadomośći moŝna na ten temat uzyskać z lektury Instrukcji do ćwiczenia Związki optycznie czynne. znaczanie składu enancjomerów teŝ dostępnej na serwerze. Uwaga: Ćwiczenie kończy jak zwykle mały test, podstawa wystawianej oceny za ćwiczenie. Ale nie tylko. ceniany będzie równieŝ sam przebieg ćwiczenia i zaangaŝowanie uczestników. 6