Genscreen HIV-1 Ag Assay 2 płytek

Genscreen HIV-1 Ag Assay 2 płytek - 192 71120 TEST IMMUNOENZYMATYCZNY DO WYKRYWANIA ANTYGENU p24 WIRUSA HIV -1 W LUDZKIEJ SUROWICY, OSOCZU I SUPERNATANCIE HODOWLI KOMÓRKOWYCH 883669-2014/01

SPIS TREŚCI 1. ZNACZENIE KLINICZNE 2. ZASADA TESTU Genscreen HIV-1 Antigen Assay 3. SKŁAD ZESTAWU Genscreen HIV-1 Antigen Assay 4. INNE NIEZBĘDNE MATERIAŁY 5. HIGIENA I BEZPIECZEŃSTWO PRACY 6. ŚRODKI OSTROŻNOŚCI 7. POBIERANIE I PRZECHOWYWANIE PRÓBEK 8. PRZYGOTOWANIE ODCZYNNIKÓW 9. PRZECHOWYWANIE I TRWAŁOŚĆ ODCZYNNIKÓW 10. PROCEDURA 11. OBLICZENIA I INTERPRETACJA WYNIKÓW 12. SPEKTROFOTOMETRYCZNA WERYFIKACJA PIPETOWANIA PRÓBEK I KONIUGATU 13. CHARAKTERYSTYKA TESTU 14. OGRANICZENIA TESTU 15. LITERATURA 2 [PL]

1 - ZNACZENIE KLINICZNE Czynnikiem etiologicznym zespołu nabytego upośledzenia odporności (AIDS) jest retrowirus zwany wirusem ludzkiego niedoboru odporności (human immunodeficiency virus = HIV). Wirus HIV izolowano od pacjentów z HIV a także od osób zdrowych z grup wysokiego ryzyka rozwoju AIDS 1,2. Transmisja wirusa odbywa się na drodze intymnych kontaktów seksualnych, poprzez używanie zakontaminowanych igieł, poprzez transfuzję zakażonych produktów krwiopochodnych, oraz wewnątrzmacicznie od zakażonej matki do płodu lub dziecka 1-8. Dowodem uprzedniej ekspozycji na kontakt z wirusem HIV jest zazwyczaj wykazanie obecności wirusowo-swoistych przeciwciał obecnych w surowicy lub osoczu osób poddanych ekspozycji. Przed pojawieniem się wykrywalnych przeciwciał, występuje krótki okres gdy we krwi występują krążące, wolne antygeny wirusowe. Jednym z tych antygenów jest p24, główne białko rdzenia wirusa. Testy skierowane przeciw antygenom wirusa mogą być używane do wykrywania antygenów krążących i tym samym zakażenia HIV przed fazą serokonwersji. Okres antygenemii poprzedzający pojawienie przeciwciał anty-hiv ma zmienną długość i może trwać kilka dni lub kilka tygodni u osób zakażonych. Z chwilą serokonwersji, swoiste przeciwciał anty-wirusowe tworzą kompleksy z antygenami krążącymi, powodując spadek poziomu wolnych antygenów lub ich całkowity zanik we krwi 9-11. Antygenemia może rozwijać się ponownie później, w miarę progresji choroby 12. Test Genscreen HIV-1 Antigen Assay jest testem przesiewowym, służącym do badania oddawanej krwi i osocza oraz jako test pomocny w diagnostyce i prognozowaniu zakażenia wirusem HIV-1. 2 - ZASADA TESTU Genscreen HIV-1 ANTIGEN ASSAY Test Genscreen HIV-1 Antigen Assay jest immunoenzymatycznym testem do wykrywania antygenu rdzeniowego (p24) wirusa HIV-1 w ludzkiej surowicy lub osoczu. Test Genscreen HIV-1 Antigen Confirmatory (nr kat. 71121) jest testem dodatkowym, używanym razem z HIV-1 Antigen Assay, w celu potwierdzenia obecności antygenu p24 HIV w próbkach powtarzalnie dodatnich. Test Genscreen HIV-1 Antigen Assay wykorzystuje fazę stałą opłaszczoną mysimi przeciwciałami monoklonalnymi przeciwko antygenowi HIV-1, koniugat pierwszy zawierający biotynylowane, owcze przeciwciało monoklonalne anty-p24 i koniugat drugi Raiforta z awidyną skoniugowaną z peroksydazą. Wykonanie testu składa się z następujących etapów: 1. Do dołków mikropłytki dodawany jest rozcieńczalnik próbek. Do odpowiednich dołków dodawane są próbki badane oraz kontrole. Jeżeli w próbce obecne są antygeny p24, zwiążą się one z przeciwciałami, którymi jest opłaszczona mikropłytka. W trakcie kolejnych płukań, antygen HIV-1 pozostanie związany w dołkach. Rozcieńczalnik próbek zmienia barwę z zielonej na niebieską potwierdzając dodanie próbki (kontroli) do dołków mikropłytki. 2. Naniesienie do studzienek koniugatu 1 i inkubacja. Biotynylowane przeciwciała owcze anty-p24 obecne w koniugacie 1 zwiążą się z HIV-1 Ag wychwyconym na ściankach dołków. W trakcie kolejnych płukań, w dołkach pozostaną związane kompleksy antygen-przeciwciało. 3. Dodanie koniugatu 2 i inkubacja. Obecna w koniugacje 2 awidyna, wiąże się z obecnym na ściankach dołków kompleksem przeciwciało-antygen HIV-1. Niezwiązany koniugat jest odmywany w trakcie płukań. 3 [PL]

4. Do dołków mikropłytki dodawany jest roboczy roztwór TMB i mikropłytka jest inkubowana. Proporcjonalnie do ilości antygenu HIV-1 obecnego w próbce, pojawia niebieskie lub niebiesko-zielone zabarwienie. Reakcje barwna jest hamowana przez dodanie kwasu, co powoduje zmianę barwy z zielononiebieskiej na żółtą. Gęstość optyczna próbek i kontroli jest oznaczana poprzez odczyt spektrofotometryczny przy długości fali 450/620-700 nm. 3 - SKŁAD ZESTAWU Genscreen HIV-1 ANTIGEN ASSAY Oznaczenie Charakterystyka odczynnika Opakowanie 71120 R1 Microplate Mikropłytka 2 płytek 12 pasków po 8 studzienek opłaszczonych mysimi przeciwciałami monoklonalnymi przeciwko antygenowi p24 HIV-1 R2 Concentrated washing solution (20X) Stężony bufor płuczący (20X) Bufor Tris NaCl, ph 7.4 Konserwant: ProClin 300 (0.04%) 1 fiolka 235 ml R3 Specimen diluent C0 Negative control C1 Positive control R4 Concentrated conjugate 1 R5 Concentrated conjugate 2 R6 Conjugate diluent R8 Substrate buffer R9 Chromogen: TMB solution (11X) R10 Stopping solution Rozcieńczalnik próbek Triton X-100 (2%) Lithium Chlorid (2%) Wskaźnik dodania próbek (zielony) Konserwant: ProClin 300 (0.5%) Kontrola ujemna Ludzkie osocze, ujemne pod względem antygenu HBs, antygenów HIV i przeciwciał anty-hiv1, anty-hiv2, anty-hcv i anty-htlv-1 Siarczan gentamycyny 0.005% Konserwant: ProClin 300 (0.5%) Dodatnia kontrola Oczyszczony antygen HIV-1, inaktywowany Konserwant: ProClin 300 (0.5%) Stężony koniugat 1 (100X) Owczy koniugat anty-p24 HIV1, 0.005% siarczan gentamycyny Konserwant: ProClin 300 (0.5%) Stężony koniugat 2 (100X) Koniugat awidyna-hrp, 0.005% siarczan gentamycyny Konserwant: ProClin 300 (0.5%) Rozcieńczalnik koniugatu Bufor ze stabilizatorami białkowymi Konserwant: ProClin 300 (0.5%) Bufor substratu Bufor kwas cytrynowy/octan sodu, ph 4.0, zawierający H 2 O 2 (0.015%) i DMSO (4%) Chromogen Tetrametylobenzydyna (TMB) Roztwór zatrzymujący 1 N kwas siarkowy 1 fiolka 20 ml 1 fiolka 10 ml 1 fiolka 7 ml 1 fiolka 1 ml 1 fiolka 1 ml 1 fiolka 100 ml 1 fiolka 60 ml 1 fiolka 5 ml 2 fiolki 2 x 28 ml 4 [PL]

4 - INNE NIEZBĘDNE MATERIAŁY NIE DOSTARCZONE W ZESTAWIE Woda destylowana. Wybielacz domowy (5-8% podchloryn sodu), który może być rozcieńczony do minimalnego stężenia 10% wybielacza (lub 0.5% podchlorynu sodu). Opcjonalne dezynfektanty: 70% etanol lub 0.5% Wescodyne (West Chemical Products, Inc.). Precyzyjne pipety pobierające 10 do 200 µl, 1 ml, 5 ml i 10 ml (dokładność +/- 10%). Pipeta wielokanałowa pobierająca 100 lub 200 µl opcjonalnie. Cylindry miarowe o pojemności 25 ml, 100 ml i 1000 ml. Pojemnik na odpady zakaźne. Łaźnia wodna lub suchy inkubator z termostatem*, nastawiony na 37 C ± 1 C lub 40 C ± 1 C. Manualna, automatyczna lub pół-automatyczna płuczka do mikropłytek (*). Czytnik mikropłytek z filtrami 450/620-700 nm (*). Puste paski mikropłytki do częściowego badania w układach automatycznych. Pojemniki na odczynniki EIA opcjonalnie. Rękawiczki jednorazowe. Bibuła. Czyste pojemniki plastikowe (polistyrenowe lub polipropylenowe) do przygotowywania roboczego roztworu koniugatów oraz roztworu TMB. Podłoże do hodowli tkankowych, np. RPMI-1640, zawierające 10% płodową surowicę cielęcą, ekwiwalentne do używanego do hodowli zainfekowanych komórek (jeżeli badanie jest prowadzone dla supernatantu hodowli komórkowych). (*) Informacji w sprawie wyposażenia w sprzęt udzieli serwis techniczny Bio-Rad. 5 - HIGIENA I BEZPIECZEŃSTWO PRACY Wszystkie odczynniki zestawu służą do diagnostyki in vitro. Podczas pracy z odczynnikami i próbkami używać rękawiczek jednorazowych i dokładnie myć ręce. Nie pipetować ustami. Materiał pochodzenia ludzkiego, użyty do sporządzenia kontroli ujemnej (R3) był ujemny pod względem antygenu powierzchniowego wirusa hepatitis B (HBsAg), antygenów HIV-1, przeciwciał przeciwko wirusowi hepatitis C, przeciwciał przeciwko HTLV1/HTLV2 i przeciwciał przeciwko ludzkim wirusom upośledzenia odporności (HIV 1 i HIV 2). Kontrola dodatnia HIV Ag została zinaktywowana termicznie z czynnikiem dysocjującym. Ponieważ nie ma metod absolutnie wykluczających obecność czynników zakaźnych, odczynniki pochodzące z materiału ludzkiego i surowice badane powinny być uważane za materiał potencjalnie zakaźny. Sprzęt mający kontakt z badanymi próbkami i odczynnikami pochodzenia ludzkiego oraz bufory, należy traktować jako materiał potencjalnie zakaźny. Unikać rozlania próbek i odczynników je zawierających. Zanieczyszczone powierzchnie czyścić 10% roztworem podchlorynu sodu. Jeżeli nastąpiło zanieczyszczenie kwasem, należy go najpierw zneutralizować dwuwęglanem sodu, następnie przemyć wybielaczem i wysuszyć bibułą. Materiał używany do czyszczenia wyrzucić do pojemnika na skażone odpady. Próbki, odczynniki pochodzenia ludzkiego i materiały zanieczyszczone biologicznie dekontaminować przed wyrzuceniem: - przez moczenie w 5% podchlorynie sodu (1 objętość podchlorynu na 10 objętości zanieczyszczonego płynu lub wody) przez 30 minut, 5 [PL]

- lub przez autoklawowanie w temp. 121 C przez minimum 2 godziny. Autoklawowanie jest najlepszą metodą inaktywacji wirusów HIV oraz HBV. UWAGA: NIE AUTOKLAWOWAĆ ROZTWORÓW ZAWIERAJĄCYCH PODCHLORYN SODU Karta Charakterystyki Substancji jest dostępna na życzenie. Unikać kontaktu substratu, chromogenu i kwasu ze skórą i śluzówkami. (możliwość zatrucia, podrażnienia lub poparzenia). Nie zapominać o neutralizacji lub autoklawowaniu roztworów, zużytego buforu płuczącego i innych płynów zawierających materiał biologiczny przed wylaniem ich do zlewu. Podczas pracy z odczynnikami chemicznymi należy przestrzegać zasad Dobrej Praktyki Laboratoryjnej. W celu zapoznania się z zaleceniami dotyczącymi zagrożeń i środków ostrożności związanych z niektórymi substancjami chemicznymi zawartymi w niniejszym zestawie należy skorzystać z piktogramów wskazujących rodzaj zagrożenia znajdujących się na etykietach i w informacjach zamieszczonych na końcu instrukcji obsługi. Karta charakterystyki jest dostępna na stronie internetowej www.bio-rad.com. 6 - ŚRODKI OSTROŻNOŚCI Uzyskanie prawidłowego wyniku zależy od przestrzegania zasad Dobrej Praktyki Laboratoryjnej: Nazwa testu, oraz specjalny numer identyfikacyjny danego testu są podane na obramowaniu każdej mikropłytki. Ten sam numer identyfikacyjny znajduje się też na każdym pasku Genscreen HIV-1 Ag Assay: Specific ID number = 49. Sprawdź specjalny numer identyfikacyjny przed każdym użyciem testu, jeżeli numeru identyfikacyjnego brak lub różni się od podanego powyżej, paska nie należy używać. Nie używać odczynników po upływie terminu przydatności. Nie zmieniać opisanej procedury. Uważnie rekonstytuować odczynniki nie dopuszczając do ich zanieczyszczenia. Podczas jednego oznaczenia używać wyłącznie odczynników o tym samym numerze serii. UWAGA: Podczas danego oznaczenia można używać odczynników z innej ale identycznej serii w przypadku: roztworu płuczącego (R2, oznaczonego: 20X na zielono), buforu do peroksydazy (R8, oznaczonego: TMB buf na niebiesko), chromogenu (R9, oznaczonego: TMB 11X na purpurowo) oraz roztworu zatrzymującego reakcję (R10, oznaczonego: 1N na czerwono) Odczynników tych można używać w niektórych innych testach Bio-Rad. Ponadto, prawidłowo rekonstytuowany roztwór płuczący (R2, oznaczony: 20X na zielono) może być używany wymiennie z dwoma innymi roztworami płuczącymi obecnymi w zestawach testowych firmy Bio-Rad (R2, oznaczony: 10X na niebiesko lub 10X na pomarańczowo); pod warunkiem stosowania jednego rodzaju buforu w serii oznaczeń. Szczegółowych informacji udzieli serwis techniczny. Przed użyciem przenieść odczynniki w celu stabilizacji do temperatury pokojowej (18-30 C) Nie wykonywać testu w obecności reaktywnych par związków (zasadowych, kwasów i aldehydów) oraz kurzu mogących wpływać na aktywność enzymatyczną koniugatu. Używać dokładnie umytego szkła wypłukanego w wodzie destylowanej lub najlepiej sprzętu jednorazowego. 6 [PL]

Nie dopuszczać do wysuszenia mikropłytki pomiędzy etapem płukania a dodawaniem kolejnego odczynnika. Do każdej badanej próbki zmieniać końcówkę pipety. Sprawdzać, czy pipety i sprzęt są prawidłowo nastawione oraz, czy aparatura prawidłowo pracuje. Płukanie: aby uzyskać maksymalną jakość oznaczenia dokładnie wykonywać opisaną procedurę. Nigdy nie używać tego samego pojemnika do koniugatu i roztworu substratu. Reakcja enzymatyczna jest bardzo wrażliwa na działanie jonów metali. Unikać kontaktu elementów metalowych z roztworami koniugatu i substratu. Roztwór wykrywający reakcję (bufor do substratu + substrat-chromogen) powinien mieć barwę różową. Zmiana tej barwy wkrótce po rekonstytucji świadczy o nie przydatności roztworu do użycia. Roztwór należy przygotowywać w jednorazowym plastikowym pojemniku przy pomocy jednorazowych pipet lub tipsów, lub używając szkła płukanego 1N kwasem solnym, a następnie wodą destylowaną i wysuszonego. Roztwór należy chronić od światła. 7 - POBIERANIE I PRZECHOWYWANIE PRÓBEK Próbki krwi należy pobierać zgodnie z rutynową procedurą. Oznaczenie może być wykonywane rozcieńczonej surowicy, osocza lub supernatantu hodowli komórkowej. Następujące antykoagulant zostały sprawdzone i uznane za kompatybilne: EDTA, heparyna, cytrynian sodowy, CPDA-1, i ACD). Pobierając próbki do probówek z antykoagulantem, należy je wypełnić zgodnie z opisem na naklejkach, aby uniknąć niewłaściwego rozcieńczenia. Jak najszybciej oddzielić surowicę lub osocze od czerwonych krwinek lub skrzepu, aby zapobiec hemolizie. Silna hemoliza może wpływać na jakość uzyskanego wyniku. Próbki z widocznymi cząstkami organicznymi należy odwirować przed oznaczeniem. Cząstki lub agregaty fibryny w próbce mogą być przyczyną fałszywie dodatnich wyników. NIE UŻYWAĆ PRÓBEK INAKTYWOWANYCH TERMICZNIE Jeśli test będzie wykonany w ciągu 7 dni, próbki można przechować w temperaturze +2-8 C. Jeśli test będzie wykonany później, należy je zamrozić w temperaturze -20 C. Osocze należy szybko rozmrażać, umieszczając na kilka minut w łaźni wodnej o temperaturze 40 C (aby uniknąć precypitacji fibryn). Biorąc pod uwagę niestabilność antygenu HIV-1, nie stosować temperatur powyżej 40 C. Próbki można zamrozić i rozmrozić najwyżej 3 razy. Do transportu próbki należy zapakować zgodnie z przepisami określającymi zasady przewożenia materiałów zakaźnych. NIE UŻYWAĆ PRÓBEK ZANIECZYSZCZONYCH, HIPERLIPEMICZNYCH ANI SILNIE ZHEMOLIZOWANYCH UWAGA: Na oznaczenie nie wywiera wpływu obecność w surowicy do 80 mg/l bilirubiny, 36 mg/l immunoglobulin M lub G, poziom lipemii odpowiadający 5 g/l lipidów, ani hemoliza wynosząca do 2,5 g/l hemoglobiny. 7 [PL]

8 - PRZYGOTOWANIE ODCZYNNIKÓW Uwaga: przed użyciem odczynniki przenieść do temp. pokojowej (18-30 C), poza stężonym koniugatem 1 i 2 (R4 oraz R5). Odczynniki gotowe do użycia: Odczynnik R1: Mikropłytka Każda ramka zawierająca 12 pasków zapakowana jest w torebkę z zamknięciem strunowym. Torebkę należy przeciąć nożyczkami lub skalpelem 0.5-1 cm powyżej zamknięcia. Otworzyć opakowanie, wyjąć potrzebną liczbę pasków. Pozostałe paski umieścić w torebce. Torebkę należy szczelnie zamknąć i przechowywać w temperaturze +2-8 C. Odczynnik R3: Rozcieńczalnik próbek Odczynnik C0: Kontrola ujemna Odczynnik C1: Kontrola dodatnia Odczynnik R10: Roztwór zatrzymujący reakcję Odczynniki do rekonstytucji Roztwór płuczący (20X): Odczynnik R2 Rozcieńczyć wodą destylowaną 1:20. 800 ml rozcieńczonego roztworu płuczącego wystarcza na 1 płytkę = 12 pasków. Roboczy roztwór koniugatu 1 (R4 + R6) i roboczy roztwór koniugatu 2 (R5 + R6): Koniugaty 1 (R4) i 2 (R5) są dostarczane w formie koncentratu (100x). Przygotować roboczy roztwór koniugatu 1 oraz roboczy roztwór koniugatu 2 poprzez rozcieńczenie każdego koncentratu 1:101 w rozcieńczalniku koniugatu (R6). Rozcieńczenie wykonywać w czystym, plastikowym pojemniku. Na pojemniku zanotować numer serii koniugatu, datę i czas rekonstytucji, datę i czas przydatności do użycia (24 godziny od przygotowania). Wymieszać roztwory robocze przed użyciem. Po wymieszaniu, roboczy roztwór koniugatu 1 przyjmuję żółty kolor, a roboczy roztwór koniugatu 2 jest zielony. Przygotowywanie roboczego roztworu koniugatu 1 lub 2 w przeliczeniu na ilość pasków testowych Liczba używanych pasków 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12* 24** Ilość stężonego koniugatu (µl) 20 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 240 Ilość rozcieńczalnika koniugatu (ml) 2 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 24 * jedna pełna płytka, ** dwie pełne płytki Substrat dla reakcji enzymatycznej (R8 + R9) Rozcieńczyć stężony roztwór chromogenu (R9) w stosunku 1:11 w buforze do substratu (R8) (np. 1 ml odczynnika R9 + 10 ml odczynnika R8). 10 ml jest wystarczające i konieczne do oznaczenia wykonywanego na 1-12 paskach. Zhomogenizować. 8 [PL]

9 - PRZECHOWYWANIE I TRWAŁOŚĆ ODCZYNNIKÓW Zestaw przechowywać w temperaturze +2-8 C. Każdy z odczynników zestawu Genscreen HIV-1 Ag Assay, przechowywany w tej temperaturze, może być wykorzystywany do daty ważności podanej na opakowaniu (z wyjątkiem specjalnych zaleceń). R1: Po otwarciu torby, paski mikropłytki przechowywane w szczelnie zamkniętej torbie, w temperaturze +2-8 C, mogą być wykorzystywane przez miesiąc. R2: Rozcieńczony bufor płuczący może być przechowywany w temperaturze +2-30 C przez dwa tygodnie. Stężony bufor płuczący (R2) może być przechowywany w temperaturze +2-30 C. R8+R9: Po rekonstytucji, odczynnik przechowywany w ciemności, w temperaturze pokojowej (+18-30 C) może być używany przez 6 godzin. R4-R5: Po rekonstytucji, roboczy roztwór koniugatu przechowywany w temperaturze pokojowej (+18-30 C) może być używany przez 24 godziny. 10 - PROCEDURA Poniżej podano opis dwóch procedur wykrywania antygenu p-24 HIV-1 w ludzkiej surowicy, osoczu lub supernatancie hodowli komórkowych. Procedura 37 C 40 C próbki statyczna 37 ± 1 C, suchy blok grzejny, 60 ± 5 min. statyczna 40 ± 1 C, suchy blok grzejny, 60 ± 5 min. z koniugatem 1 statyczna 37 ± 1 C, suchy blok grzejny, 30 ± 5 min. statyczna 40 ± 1 C, suchy blok grzejny, 30 ± 5 min. z koniugatem 2 statyczna 37 ± 1 C, suchy blok grzejny, 30 ± 5 min. statyczna 40 ± 1 C, suchy blok grzejny, 30 ± 5 min. Reakcja barwna statyczna 18-30 C, w ciemności, 30 ± 5 min statyczna 18-30 C, w ciemności, 30 ± 5 min Dla próbek oryginalnie oznaczanych w temperaturze 37 C lub 40 C, jakiekolwiek powtórne oznaczenia lub potwierdzenia muszą być wykonywane z użyciem tej samej procedury. Przewidywany czas oznaczenia dla opisywanej procedury to ok. 2h30 godziny od rozpoczęcia pierwszej inkubacji. Każda seria oznaczeń musi być wykonana od początku, bez przerw, do samego końca opisanej procedury. Na każdej płytce należy uwzględnić dwa dołki dla kontroli dodatniej oraz trzy dołki dla kontroli ujemnej. Jeżeli wykonywane są oznaczenia dla supernatantu hodowli komórkowych, zamiast trzech kontroli ujemnych (C0) należy użyć trzech dołków dla medium hodowlanego. Punkt odcięcia dla próbek pacjentów jest wyznaczany w oparciu o kontrole oznaczane na danej płytce. Unikać ekspozycji płytek na światło na etapie finalnej inkubacji (po dodaniu roboczego roztworu TMB). Ściśle przestrzegać podanej procedury oznaczenia i postępować zgodnie z zasadami Dobrej Praktyki Laboratoryjnej. 9 [PL]

1. Starannie ustalić rozkład używanych studzienek. 2. Przygotować rozcieńczony roztwór płuczący. 3. Wyjąć ramkę i potrzebną liczbę pasków (R1) z opakowania ochronnego. 4. Nanieść kolejno, bez uprzedniego płukania: 50 µl rozcieńczalnika do każdej studzienki 150 µl kontroli ujemnej (C0) do studzienek A1-B1-C1 150 µl kontroli dodatniej (C1) do studzienek D1-E1 150 µl próki do studzienki G1, etc... Zależnie od wykorzystywanego systemu, możliwe jest modyfikowanie pozycji kontroli i rozkładu nanoszonych odczynników. wykonywane są oznaczenia dla supernatantu hodowli komórkowych, zamiast trzech kontroli ujemnych (C0) należy użyć trzech dołków dla medium hodowlanego. Upewnić się, iż rozcieńczalnik próbek jest dobrze wymieszany z próbkami (kontrolami). N.B.: Etap dodawania próbek może być kontrolowany wizualnie: po dodaniu próbki rozcieńczalnik zmienia barwę z zielonej na niebieską potwierdzając dodanie próbki lub kontroli do dołka. Po prawidłowym wymieszaniu, zawartość każdego dołka przyjmuje jednolity kolor. Supernatant hodowli komórkowych może nie powodować zmiany koloru, zależnie od używanego podłoża. (w sprawie weryfikacji automatycznej patrz rozdział 12: SPEKTROFOTOMETRYCZNA WERYFIKACJA PIPETOWANIA PRÓBKI I KONIUGATU). 5. O ile jest to możliwe, szczelnie zakryć mikropłytkę folią adhezyjną. Dokładnie przycisnąć folię by zapewnić jej prawidłowe przyleganie. 6. Inkubować w suchym inkubatorze mikropłytek, bez wytrząsania, przez 1 godzinę ± 5 minut w temperaturze 37 C ± 1 C lub 40 C ± 1 C. 7. Zdjąć folię adhezyjną. Zaaspirować zawartość studzienek do pojemnika na odpady (z podchlorynem sodu). Do każdej studzienki dodać minimum 0.370 ml roztworu płuczącego i pozostawić go na 20 do 60 sekund. Zaaspirować ponownie. Powtórzyć płukanie co najmniej cztery razy (tj. wykonać 5 cykli płukania). Pozostająca objętość płynu nie może przekraczać 10 µl (w razie konieczności osuszyć odwróconą mikropłytkę na bibule). Używając płuczki automatycznej, stosować identyczną procedurę płukania (patrz rozdział 12: REKOMENDACJE). 8. Szybko nanieść do wszystkich studzienek po 100 µl roboczego roztworu koniugatu 1. Koniugat należy delikatnie wstrząsnąć przed użyciem. N.B.: Etap dodawania koniugatu 1, który ma barwę żółtą, może być kontrolowany wizualnie. 9. O ile jest to możliwe, zakryć mikropłytkę folią adhezyjną i inkubować w suchym inkubatorze mikropłytek, bez wytrząsania, przez 30 ± 5 minut w temperaturze 37 C ± 1 C lub 40 C ± 1 C. 10. Zdjąć folię adhezyjną. Zaaspirować zawartość studzienek do pojemnika na odpady (z podchlorynem sodu). Do każdej studzienki dodać minimum 0.370 ml roztworu płuczącego i pozostawić go na 20 do 60 sekund. Zaaspirować ponownie. Powtórzyć płukanie co najmniej cztery razy (tj. wykonać 5 cykli płukania). Pozostająca objętość płynu nie może przekraczać 10 µl (w razie konieczności osuszyć odwróconą mikropłytkę na bibule). 11. Szybko nanieść do wszystkich studzienek po 100 µl roboczego roztworu koniugatu 2. Koniugat należy delikatnie wstrząsnąć przed użyciem. N.B.: Etap dodawania koniugatu 2, który ma barwę zieloną, może być kontrolowany wizualnie. 10 [PL]

12. O ile jest to możliwe, zakryć mikropłytkę folią adhezyjną i inkubować w suchym inkubatorze mikropłytek, bez wytrząsania, przez 30 ± 5 minut w temperaturze 37 C ± 1 C lub 40 C ± 1 C. 13. Zdjąć folię adhezyjną, zaaspirować zawartość i przepłukać minimum 5 razy tak jak podano powyżej. Pozostająca objętość płynu nie może przekraczać 10 µl (w razie konieczności osuszyć odwróconą mikropłytkę na bibule). 14. Szybko nanieść do wszystkich studzienek po 100 µl roztworu substratu (R8+R9), przygotowanego bezpośrednio przed użyciem. Pozostawić reakcję w ciemności na 30 ± 5 minut w temperaturze pokojowej (18-30 C). Nie zakrywać folią adhezyjną. N.B.: Dodanie roztworu substratu, który ma barwę różową, może być kontrolowane wizualnie: jest wyraźna różnica pomiędzy pustą studzienką a studzienką z różowym roztworem substratu (w sprawie weryfikacji automatycznej patrz rozdział 12: SPEKTROFOTOMETRYCZNA WERYFIKACJA PIPETOWANIA PRÓBKI I ODCZYNNIKA). 15. Dodać do każdej studzienki po 100 µl roztworu zatrzymującego (R10). Roztwór ten dodawać w tej samej kolejności jak roztwór substratu. Wymieszać. N.B.: Dodanie roztworu zatrzymującego reakcję, który jest bezbarwny, może być kontrolowane wizualnie. Po dodaniu tego roztworu znika różowa barwa substratu w przypadku próbek ujemnych, natomiast studzienki z próbkami dodatnimi zmieniają barwę z niebieskiej na żółtą. 16. Wytrzeć spód mikropłytki i po upływie co najmniej 4 minut od zatrzymania reakcji, w ciągu 30 minut zmierzyć gęstość optyczną (przy długości fali 450 / 620-700 nm) w czytniku mikropłytek dla każdej studzienki. 17. Przed opisem wyników sprawdzić zgodność odczytu spektrofotometrycznego i wizualnego z ustalonym na początku rozkładem studzienek. 11 - OBLICZENIE I INTERPRETACJA WYNIKÓW 1 - Walidacja testu Seria oznaczeń jest wykonana prawidłowo, jeżeli spełnione są następujące kryteria ważności: Absorbancja dla każdej kontroli ujemnej (NC) (lub stosownie, kontroli hodowli komórkowej) powinna być większa niż 0.000 AU i mniejsza lub równa 0.100 AU. Jeśli jedna z kontroli ujemnych nie mieści się w tym zakresie, należy ja pominąć i obliczyć średnią z dwóch pozostałych. Średnia wartość NC może być obliczona z dwóch pozostałych wartości. Jeżeli dwie lub więcej kontroli ujemnych nie spełnia kryteriów kontroli, płytka jest nieważna i należy powtórzyć oznaczenie. Średnia wartość absorbancji kontroli dodatnich (PCX) musi być większa lub równa 0.500 AU, a każda wartość pojedyncza musi być w zakresie powtarzalności od 0.65 do 1.35 razy PCX. Żadna z wartości kontroli dodatniej nie może być pominięta. 2 - Obliczenie średniej absorbancji W oparciu o zwalidowane wartości kontroli należy wyliczyć średnią absorbancję dla kontroli ujemnej i kontroli dodatniej dzieląc sumę wartości pojedynczych studzienek przez liczbę zaakceptowanych studzienek. 11 [PL]

3 - Wartość odcięcia (cut-off) Obliczyć wartość cut-off dodając 0.070 do średniej NC (NCX), wg. przykładu poniżej. Cut-off = 0.070 + NCX Przykład: NCX = 0.033 Cut-off = 0.070 + 0.033 = 0.103 4 - Interpretacja wyników Obecność lub brak antygenu HIV-1 jest określana w oparciu o porównanie wartości absorbancji próbek z wartością odcięcia. Próbki o absorbancji poniżej wartości 0.000 AU muszą być oznaczone powtórnie. Próbki dla których uzyskano wartości powyżej górnej granicy odczytu czytnika powinny być raportowane jako reaktywne. Próbki o absorbancji poniżej wartości granicznej cut-off są ujemne w teście Genscreen HIV-1 Antigen Assay i mogą być uznane za ujemne pod względem obecności antygenu HIV-1. Dalsze oznaczenia nie są konieczne. Próbki o absorbancji równej lub wyższej niż wartość cut-off zostają wstępnie uznane za dodatnie w teście Genscreen HIV-1 Antigen Assay. Przed ostateczną interpretacją, próbki wstępnie reaktywne należy ponownie oznaczyć w duplikacie, aby zwalidować wynik pierwotny. Jeśli po powtórzeniu oznaczenia, wartości absorbancji dla obu duplikatów są mniejsze niż wartość cut-off, poprzedni wynik uznaje się za niepowtarzalny i próbka zostaje uznana za ujemną pod względem obecności antygenu HIV-1. Przyczyny uzyskiwania niepowtarzalnych wyników: nieprawidłowe płukania mikropłytki, zanieczyszczenie próbki ujemnej HIV-1 Ag z próbki wysoko dodatniej, zanieczyszczenie roztworu substratu czynnikiem utleniającym (wybielacz, jony metali, etc.), zanieczyszczenie roztworu zatrzymującego reakcję. Jeśli po powtórzeniu oznaczenia wartość absorbancji dla jednego z duplikatów jest równa lub większa niż wartość cut-off, poprzedni wynik uznaje się za powtarzalny i próbka zostaje uznana za dodatnią w teście Genscreen HIV-1 Antigen Assay. Próbki uznane za powtarzalnie reaktywne w teście Genscreen HIV-1 Antigen Assai powinny być zweryfikowane z użyciem zestawu Genscreen HIV-1 Antigen Confirmatory Assay (nr kat. 71121). Próbki mogą być uznane za dodatnie pod względem obecności antygenu HIV-1 tylko, jeżeli antygen HIV-1 może być zneutralizowany w procedurze potwierdzającej. 12 - SPEKTROFOTOMETRYCZNA WERYFIKACJA PIPETOWANIA PRÓBKI I KONIUGATU Spektrofotometryczna weryfikacja pipetowania próbek Po naniesieniu rozcieńczalnika próbek (R3) i próbek, można zweryfikować dodanie próbek badanych poprzez pomiar spektrofotometryczny przy długości fali 620 nm: gęstość optyczna studzienki zawierającej próbkę powinna być wyższa niż 0.250 (wartość niższa wskazuje na niedostateczne dodanie próbki). Uwaga: Zależnie od własności podłoża, dodanie medium do hodowli komórkowych może nie wywoływać zmiany barwy studzienki. W takim przypadku nie wykonywać automatycznej weryfikacji. Weryfikacja pipetowania roztworu substratu Po dodaniu różowego roztworu substratu, można zmierzyć gęstość optyczną studzienek przy długości fali 490 nm. Prawidłowa wartość OD powinna być wyższa od 0.100 (wartość niższa wskazuje na niedostateczne dodanie roztworu substratu). 12 [PL]

13 - CHARAKTERYSTYKA TESTU Czułość z użyciem testu Genscreen HIV-1 Antigen Assay przebadano i uznano za dodatnie, 138 próbek od pacjentów z różnych faz zakażenia wirusem HIV (AIDS, ARC, inne). Przebadano 20 dobrze scharakteryzowanych paneli konwersyjnych. Uzyskane wyniki SA porównywalne z uzyskanymi z użyciem innych testów do wykrywania HIV-Ag. Co najmniej 64 próbek z wczesnej serokonwersji zbadano za pomocą testu Genscreen HIV-1 Antigen Assay. 55 supernatantów hodowli komórkowych HIV-1 (53 grupy M i 2 grupy O) oraz panel rozcieńczeniowy AgVIHSFTS96 zostało uznane za dodatnie poza dwoma rozcieńczeniami supernatantu hodowli komórkowych grupy O. - 53 supernatanty hodowli komórkowych HIV-1 grupy M obejmowały następujące genotypy: 10 genotypów A, 10 genotypów B, 9 genotypów C, 5 genotypów, 11 genotypów E, 2 genotypy F, 1 genotyp H, 2 genotypy J oraz jeden genotyp N. - Panel rozcieńczeniowy AgVIHSFTS96 obejmuje następujące genotypy: A, B, C, D, E, F, G, H z grupy M oraz 1 z grupy O. Czułość analityczna Graniczną wykrywalności oszacowano na mniej niż 2 jm/ml poprzez przebadanie pierwszego odnośnika WHO - International Reference NIBSC kod 90/636 i wykrycie na poziomie 0,36 jm/ml z 95% przedziałem ufności [0,08-0,65 jm/ml] w 3 różnych partiach w trakcie oceny wewnętrznej. Czułość analityczną testu wyznaczono w serii rozcieńczeń przygotowanych z francuskiego standardu krajowego (oczyszczony lizat wirusa genotypu B rozcieńczony w ujemnym osoczu cytrynianowym) oraz panelu BBI (PRA 801). Limit detekcji ustalono na poziomie 8 pg/ml Ag HIV niezależnie od protokołu. Krzywa kalibracyjna otrzymana po analizie przeprowadzonej na HIV-1 Ag Standard (kod 72217) wykazuje liniowość w zakresie od 0 do 5 IU / ml (lub od 0 do 100 pg/ml). Swoistość diagnostyczna Swoistość badano oznaczając: 4038 próbek dawców krwi, swoistość wynosiła 99.95% 209 próbek klinicznych, swoistość wynosiła 100% Przebadano panel 105 próbek pacjentów, złożony z następujących próbek: Zawierających przeciwciała przeciwko HAV, HCV, HTLV, HSV, EBV, różyczce, T. gondii, T. pallium, CMV. Zawierających autoprzeciwciała, IgG, czynnik reumatoidalny IgM Pochodzących od kobiet ciężarnych, osób z żółtaczką, pacjentów po wielokrotnych transfuzjach i pacjentów z toczniem rumieniowatym układowym. Tylko jedna próbka pochodząca od pacjenta z toczniem rumieniowatym układowym była uznana za reaktywną w teście Genscreen HIV-1 Antigen Assay ale nie została uznana za dodatnią w teście potwierdzenia. Powtarzalność Powtarzalność testu Genscreen HIV-1 Antigen Assay określono, oznaczając 3 próbki dodatnie i jedną ujemną, 30 razy w tym samym teście. Odtwarzalność między-testową określono, oznaczając 3 próbki dodatnie i jedną ujemną przez 5 dni przez dwóch techników. Współczynniki zmienności (CV%) dla próbek dodatnich wynosiły poniżej 10%. 13 [PL]

14 - OGRANICZENIA TESTU Wykonując oznaczenia w kierunku obecności antygenu HIV-1 dla próbek surowicy, osocza lub supernatantu hodowli komórkowych należy przestrzegać procedury i sposobu interpretacji wyników dla testu Genscreen HIV-1 Antigen Assay. Użytkownik zestawu powinien przed wykonaniem oznaczenia zapoznać się z instrukcją obsługi niniejszego testu. W szczególności, należy przestrzegać procedury pipetowania próbek i odczynników, płukania płytki, czasów inkubacji na poszczególnych etapach. Stwierdzenie obecności antygenu HIV-1 nie może być postawione na podstawie uzyskania pojedynczego wyniku reaktywnego. Badania dodatkowe, takie jak testy potwierdzenia, są konieczne do ustalenia swoistości reakcji dodatniej w testach przesiewowych. Wszystkie testy immunoenzymatyczne o wysokiej czułości mogą potencjalnie reagować nieswoiście tym samym generować wyniki fałszywie dodatnie. Proporcja wyników reaktywnych, które są fałszywie dodatnie, zależy od czułości i swoistości zestawu. Wynik ujemny można uzyskać w przypadku obecności w badanej próbce zbyt małej ilości markera w porównaniu do progu detekcji testu, lub jeżeli poszukiwany marker jest nieobecny w fazie choroby, w której próbkę pobrano. Zmienność wirusa HIV nie pozwala wykluczyć uzyskania wyników fałszywie ujemnych. Żadna ze znanych metod nie może w pełni zagwarantować wykluczenia obecności wirusa HIV. Niepowodzenie w dodawaniu próbki lub odczynników wg. podanej procedury może prowadzić do uzyskania wyników fałszywie ujemnych. Należy rozważyć ponowne wykonanie badania jeżeli są podstawy kliniczne podejrzenia zakażenia lub wystąpienia błędu proceduralnego. Wynik poniżej 0.000 AU wskazuje na błąd proceduralny lub niesprawność urządzenia i oznacza konieczność wykonania badania powtórnego. Czynnikami, które mogą wpłynąć na walidację oznaczenia są niedodanie próbki do dołka, niewłaściwe przemywanie dołków mikropłytki, nieprzestrzeganie podanych czasów i temperatur inkubacji, dodanie do dołków niewłaściwych odczynników, obecność metali, rozpryski wybielacza powodujące jego przedostanie się do dołków mikropłytki. Test nie został poddany ewaluacji dla próbek uzyskanych post mortem ani dla próbek biologicznych innych niż surowica i plazma lub supernatant hodowli komórkowej. Kolor rozcieńczalnika próbek może nie ulec zmianie po dodaniu supernatantu hodowli komórkowych zależnie od właściwości podłoża do hodowli komórkowych. Mimo, iż w trakcie badan ewaluacyjnych, czułość analityczna testu została oceniona na 8 pg/ml, może ona różnić się zależnie od warunków wykonania oznaczenia oraz w efekcie zmienności międzyseryjnej. W konsekwencji Bio-Rad gwarantuje czułość analityczną na poziomie poniżej 15 pg/ml. Kolorymetryczna metoda weryfikacji dodawania próbek, koniugatu i roztworu substratu nie pozwala na kontrolę dokładności pipetowania. Metoda ta pozwala jedynie wykazać fakt dodania próbki, koniugatu i roztworu substratu do dołków mikropłytki. Ilość błędnych weryfikacji w tej metodzie, jest ściśle powiązana z dokładnością używanego systemu (skumulowany współczynnik zmienności dla pipetowania i odczytu, wynoszący ponad 10%, znacząco obniża jakość weryfikacji). W przypadku bardzo niskiej wydajności płukania po inkubacji z koniugatem, automatyczna weryfikacja pipetowania roztworu substratu (poprzez odczyt OD 14 [PL]

przy 490 nm) może dostarczać nieprawidłowe wyniki z OD powyżej 0.100 pomimo braku roztworu substratu. Tym niemniej, ten przypadek nie został zaobserwowany podczas ewaluacji wykonanej na 939 próbkach. 15 - LITERATURA 1. Barre-Sinoussi F, Chermann JC, Rey F, et al: Isolation of T-lymphotropic retrovirus from a patient at risk for acquired immune deficiency syndrome(aids). Science 220:868-871,1983. 2. Gallo RC, Salahuddin SZ, Popovic M, et al: Frequent detection and isolation of cytopathic retroviruses (HTLV-lll) from patients with AIDS and at risk for AIDS. Science 224:500-503,1984. 3. Coffin J, Haase A, Levy JA, et al: What to call the AIDS virus? Nature 321:10, 1986. 4. Van der Graff M, Diepersloot R: Transmission of human immunodeficiency virus (HIV/ HTLV-III/ LAV): a review, Infection 14:203-211,1986. 5. Weis R: Retrovirus and human disease. J Clin Pathol 40:1064-69,1987. 6. Tovo P, Gabiano C, Riva C, et al: Specific antibody and virus antigen expression in congenital HIV infection, Lancet 1:1201,1987. 7. Tegtmeier G: Current tests for serologic detection of HlV-1 infection. J Clin lmmunoassay 11:123-125,1988. 8. Schumacher R, Garrett P, Tegtmeier G, et al: Comparative detection of anti-hiv in early HIV seroconversion. J Clin lmmunoassay 11:130-134,1988. 9. Casey JM, Kim Y, Andersen PR, et al: Human T-cell lymphotropic virus type III: immunologic characterization and primary structure analysis of the major internal protein, p24. J Virology 55:417-423,1985. 10. Ritter J, Escaich S, Trepo C, et al: HIV antigen detection in antibody negative sera. Abstract 1627, IV International Conference on AIDS, 1988. 11. Veronese FD, Sarngadharan MG, Rahman R, et al: Monoclonal antibodies specific for p24, the major core protein of human T-cell Leukemia virus type III. Natl Acad Sci USA, 82:5199-5202,1985. 12. Schaeffler B, Flesher A, Shriver K, Tam MR: Monoclonal antibody detection of p25 HIV antigen in the serum and CSF of patients within the AIDS spectrum. Abstract 7759, IV International Conference on AIDS, 1988. 13. Bos ES, van der Doelen AA, van Rooy N, Schurs AHWM: 3,3',5,5' - Tetramethylbenzidine as an Ames test negative chromogen for horseradish peroxidase in enzyme immunoassay. J lmmunoassay 2:187-204,1981. 14. Garner RC, Walpole AL, Rose FL: Testing of some benzidine analogues for microsomal activation to bacterial mutagens. Cancer Letters 1:39-42,1975. 15. Resnick L, Veren K, Salahuddin SZ, et al: Stability and inactivation of HTLV- III/LAV under clinical laboratory environments. JAMA 255:1887-1891,1986. 16. Sarngadharan MG, Markham PD: The role of human T-Lymphotropic retroviruses in leukemia and AIDS, in Wormser GP (ed.): AIDS and Other Manifestations of HlV Infection. New Jersey, Noyes Publications 1987, pp 218-220. 17. Bond WW, Favero MS, Petersen NJ, et al: Inactivation of Hepatitis B virus by intermediate-to-high level disinfectant chemicals. J Clin Micro 18:535-538,1983. 15 [PL]

16 [PL]

17 [PL]

18 [PL]

19 [PL]

20 [PL]