Charakterystyka właściwości probiotycznych bakterii kwasu mlekowego izolowanych z przewodu pokarmowego kurczaków Hanna Złotkowska, Danuta Juszczakiewicz, Anna Misiewicz INSTYTUT BIOTECHNOLOGII PRZEMYSŁU ROLNO-SPOŻYWCZEGO Zakład Mikrobiologii Technicznej i Biochemii Streszczenie Z przewodu pokarmowego kurczaków (treść z wola, treść z jelita ślepego) wyizolowano łącznie 39 monokultur bakterii fermentacji mlekowej. W wyniku przeprowadzonej wstępnej kilkustopniowej selekcji na podstawie wielkości strefy rozjaśnienia wokół wyrośniętych na stałym podłożu Szembera kolonii oraz oceny makroskopowej i mikroskopowej do dalszych badań wytypowano pięć szczepów. Wybrane drobnoustroje wykazywały zdolność do wytwarzania pożądanych metabolitów w aspekcie ich przydatności do otrzymywania preparatów probiotycznych. Po 24 godzinach hodowli w warunkach beztlenowych, w temp. 37 o C szczepy charakteryzowały się wzrostem rzędu 10 9-10 10 komórek w 1ml ciekłego podłoża MRS. Wykazywały znaczną tolerancję na niskie ph środowiska oraz obecność w środowisku soli żółciowych.. Badane szczepy wytwarzały metabolity, które skutecznie hamowały wzrost testowanych drobnoustrojów patogennych.na podstawie analizy cech morfologicznych oraz wyników testu API 50CHL oraz testu Rapid ID 32A wyizolowane szczepy zakwalifikowano do gatunków: Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus plantarum i Bifidobacterium adolescentis. Słowa kluczowe: bakterie kwasu mlekowego, probiotyki Isolation of lactic acid bacteria as probiotics strains from chicken gut SUMMARY 39 LAB strains were isolated from chicken. As a result of preliminary selection 5 of them for further work were chosen. Lactobacillus sp. and Bifidibacterium sp. strains on the basis of morphological and biochemical properties of strains were identified. Tested microorganisms demonstrated capacity for the production of desirable metabolites in the aspect of their usefulness as probiotics. Tested microorganisms showed good tolerance to low ph and oxgall. The strains produced metabolites that inhibited the growth all used pathogenic strains. Key words: lactic acid bacteria, LAB, probiotics I. WPROWADZENIE Bakterie kwasu mlekowego stanowią grupę drobnoustrojów o stale rosnącym znaczeniu w biotechnologii. Pierwotnym i podstawowym celem stosowania tych drobnoustrojów była potrzeba utrwalania żywności. Również w dzisiejszych czasach ten właśnie cel jest nadal jednym z podstawowych, ale już nie jedynym sposobem przemysłowego ich wykorzystania. Obecnie znacząco wzrasta zainteresowanie czystymi specjalnie wyselekcjonowanymi kulturami bakterii kwasu mlekowego o określonych właściwościach, stanowiącymi główny składnik probiotyków 37
określanych jako preparaty biologiczne, korzystnie wpływające na równowagę mikroflory bakteryjnej przewodu pokarmowego ludzi i zwierząt. Do najważniejszych cech biotechnologicznych uznawanych za kryterium przydatności szczepów do otrzymywania preparatów probiotycznych należą: zdolność do adhezji i kolonizacji powierzchni śluzówki przewodu pokarmowego [Fooks i in. 1999, Mattila-Sandholm i in. 1999, Ouwehand i in. 1999,Perez i in. 1998], zdolność do zahamowania rozwoju drobnoustrojów patogennych i toksynotwórczych [Chateau i in. 1993, Daly 1991, Marteau i Rambaud 1993, Martirosian i Meisel- Mikołajczyk 2000, Mitall i Gang 1995], efektywność biosyntezy kwasów organicznych w szczególności mlekowego podczas fermentacji cukrów prostych jak i złożonych [Ziińska i in. 1996, 1997], wysoka koncentracja drobnoustrojów tj. rzędu 10 9 w 1 ml cieczy hodowlanej, odporność na działanie kwasów i soli żółciowych oraz enzymów trawiennych [Fooks i in. 1999, Grzybowski i in. 1997, Ouwehand i in. 1999], zdolność do biosyntezy wybranych metabolitów [Bardowski 2000, Klewicka i Libudzisz, Lee i Salminen 1995, Moteva i in. 1998, Stecka i in. 1997], a także wysoka przeżywalność w kolejnych etapach procesu produkcyjnego preparatu. Bakteriami wykazującymi takie właściwości są najczęściej ziarniaki i pałeczki należące do gatunków: Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, L. acidophilus, L. rhamnosus, L. reuteri, L. casei, Bifidobacterium bifidum, Bif. longum, Bif. breve, Bif. infantis, Streptococcus thermophilus i Enerococcus faecium [Fooks i in. 1999]. Oprócz bakterii w skład preparatów probiotycznych mogą wchodzić również drożdże i grzyby oraz ich metabolity. Trudno jest wyobrazić sobie współczesny przemysł rolno-spożywczy oraz farmaceutyczny bez ich obecności [33-40]. Tak więc drobnoustroje o udokumentowanych cechach probiotycznych posiadające status bakterii bezpiecznych dla ludzi i zwierząt mogą być składnikami zarówno produktów spożywczych (fermentowane wyroby mleczarskie, chleb, fermentowane kiełbasy, ryby itp.) [34-36], preparatów do kiszenia pasz (Lactamyl, Lactacel, Lacctosil), jak też preparatów farmaceutycznych (Trilac, Lakcid, Lacidofil). W ostatnich latach opracowane zostały w IBPRS nowe technologie preparatów probiotycznych dla zwierząt, zawierających w swoim składzie żywe kultury drożdży i bakterii PROBIOMIX i PROBIOSACC [41]. Odopwiednio dobrany skład jakościowy i ilościowy mikroorganizmów zdolnych do biosyntezy określonych metabolitów powodował lepszą przyswajalność paszy przez zwierzęta pełniąc jednocześnie w ich organiżmie rolę regulatora równowagi ekologicznej mikroflory przewodu pokarmowego Skuteczność działania na organizm zwierzęcy wyselekcjonowanych szczepów drobnoustrojów jako składników preparatów probiotycznych sprawdzona została w Instytucie Zootechniki, w badaniach z udziałem cieląt, kurcząt i brojlerów [Brzóska i in. 1999, 2000, Juszczakiewicz i in. 2003]. Zwierzęta, które 38
otrzymywały w diecie preparaty probiotyczne charakteryzowały się wyższymi przyrostami masy ciała w porównaniu do grup kontrolnych (dieta bez preparatów) oraz zmniejszoną liczbą upadków. Ponadto uzyskane wyniki wskazywały na możliwość stosowania w diecie preparatów probiotycznych w zastępstwie antybiotyków i świadczyły o znacznej poprawie stanu zdrowia badanych zwierząt. Od roku 2000 w Zakładzie Mikrobiologii Technicznej i Biochemii IBPRS prowadzone są badania nad izolacją szczepów bakterii kwasu mlekowego o cechach probiotycznych. W wyniku dotychczas przeprowadzonych prac z różnych środowisk (kiszonki, przewód pokarmowy bydła) wyizolowano kilkanaście szczepów z rodzaju Lactobacillus i Bifidobacterium, które po przeprowadzeniu dodatkowych badań technologicznych mogą potencjalnie stanowić składnik preparatów probiotycznych [Juszczakiewicz i in. 2002, 2003, Złotkowska i in. 2002]. W 2003 roku, w ramach kontynuacji wyżej wymienionych badań prowadzono dalsze prace dotyczące izolacji i selekcji bakterii kwasu mlekowego o cechach probiotycznych z przewodu pokarmowego kolejnej grupy zwierząt hodowlanych tj. kurcząt. II. METODY BADAŃ 1. Materiał do badań Materiałem do izolacji szczepów o potencjalnych cechach probiotycznych była treść przewodu pokarmowego kurcząt. Izolację prowadzono z materiału pobranego z jelita ślepego i wola kurcząt. 2. Mikroorganizmy. Czyste kultury szczepów bakteryjnych wyizolowane z przewodu pokarmowego kurcząt przechowywano w temp. 4 o C w ciekłym podłożu MRS, przeszczepiano co 3 tygodnie i hodowano w temp. 37 o C w warunkach beztlenowych oraz przechowywano w stanie głębokiego zamrożenia (ciekły azot, temp.-150 o C). Do określenia zdolności hamowania wzrostu przez wyizolowane bakterie kwasu mlekowego zastosowano 9 szczepów patogennych, które otrzymano z ZTF IBPRS. Były to: Salmonella D, Salmonella CO, Listeria innocua, Salmonella enteritidis, Listeria monocytogenes, Escherichia coli hem. Piwet, Escherichia coli hem. K, Escherichia coli hem. C. Stosowane do badań szczepy przechowywano w temp. -150 o C (ciekły azot). 3. Podłoża 39
Do izolacji szczepów stosowano ciekłe podłoże MRS [4], stałe podłoże Szembera [Złotkowska i Ilnicka-Olejniczak 1996] i podłoże ACA wg Rogosa i wsp. [Chateau 1993]. Do hodowli i przechowywania czystych kultur stosowano ciekłe podłoże MRS. (Merck) Ocenę zdolności do wzrostu mikroorganizmów prowadzono w ciekłym podłożu MRS (Merck) Biosyntezę kwasu mlekowego prowadzono w ciekłym podłożu MRS zawierającym jako źródło węgla zarówno cukry proste jak i złożone. Do określenia zdolności hamowania wzrostu wybranych szczepów patogennych stosowano podłoże z agarem odżywczym o stężeniu 0,7 % [Burbianka i Pliszka 1983, Pilet i n. 1995]. Do oznaczania tolerancji na niskie ph i obecność w środowisku soli żółciowych stosowano ciekłe podłoże MRS o ph równym 2,0 i podłoże MRS z dodatkiem 0,3% oxgalu (mieszanina kwasów żółciowych oraz agarowe podłoże MRS do liczenia wyrośniętych kolonii. 4. Izolacja monokultur i określenie ich cech gatunkowych Otrzymywanie czystych kultur bakterii kwasu mlekowego z mieszaniny drobnoustrojów prowadzono metodą kolejnych rozcieńczeń i posiewów na stałe podłoże Szembera. Następnie izolowano pojedyncze kolonie, wokół których widoczne były największe strefy rozjaśnienia podłoża i w celu uzyskania monokultury przeszczepiano na stałe podłoże MRS. Wielkość średnicy strefy rozjaśnienia podłoża świadczyła o intensywności wytwarzania kwasu.. Charakterystykę morfologiczną i biochemiczną wybranych szczepów bakterii oraz określenie ich przynależności rodzajowej wykonywano zgodnie z metodyką Bergey a dla rodzaju Lactobacillus [Sneath 1986]. Określenie przynależności gatunkowej wybranych szczepów bakterii wykonywano przy pomocy testu diagnostycznego API 50 CHL, pozwalającego na ocenę zdolności do fermentacji mlekowej 49. węglowodanów oraz testu mini API Rapid ID32A dla bakterii beztlenowych. Zdolność testowanych szczepów do fermentowania poszczególnych węglowodanów oceniono w czasie 24 i 48 godzinnej hodowli prowadzonych w temp. 37 o C. Na podstawie otrzymanych wyników, przeprowadzono analizę danych przy zastosowaniu programów: API 50 CHL IDENTIFICATION SYSTEM V4.0 TAXONOMY AND CLASSIFICATION OF LACTIC ACID BACTERIA oraz RAPID ID 32A IDENTIFICATION SYSTEM FOR ANAEROBES V3.0. Określane zostały cechy morfologiczne kolonii i komórek, wzrost w temperaturze 15 C, 30 C, 37 C i 45 C, zdolność do wytwarzania katalazy, a także określona została forma izomeryczna wytwarzanego kwasu mlekowego tj. L(+) i D(-). 5. Charakterystyka wyizolowanych szczepów bakterii pod kątem przydatności do otrzymywania preparatów probiotycznych 40
Charakterystyka szczepów obejmowała: 1. Zdolność do biosyntezy kwasu mlekowego - na podstawie wyników prób fermentacyjnych w podłożu MRS przy zastosowaniu dodatku 2% glukozy. Do hodowli stosowano 24-godzinne inokulum w dawce 10 % namnażane w płynnym podłożu MRS. Czas hodowli w temp. 37 C wynosił 24-48 godzin, hodowle prowadzono w warunkach beztlenowych, wysysając środowisko hodowlane dwutlenkiem węgla. 2. Wzrost bakterii (j.t.k./ml) - metodą płytkową po 24 godzinach inkubacji w temp. 37 C na podłożu MRS w warunkach beztlenowych (w środowisku dwutlenku węgla) i tlenowych. 3.Tolerancję na niskie ph - metodą kolejnych rozcieńczeń, w płynnym podłożu MRS o ph 2,0. Po 4 godz. inkubacji w temp. 37 o C badany materiał wysiewano w odpowiednim rozcieńczeniu na agarowe podłoże MRS. Na podstawie liczby kolonii, które wyrosły po 48 godz. inkubacji na płytkach w temp. 37 C określano zdolność badanych szczepów do przeżycia w środowisku o niskim ph. Przeżywalność kultur bakterii wyrażano w procentach obliczonych z logarytmów liczb jednostek tworzących kolonie po 4 godzinach inkubacji w środowisku o ph 2 w stosunku do logarytmów liczb jednostek tworzących kolonie po 4 godzinach inkubacji w środowisku o optymalnym ph (5,7). 4. Tolerancję na obecność soli żółciowych - metodą kolejnych rozcieńczeń, w płynnym podłożu MRS z dodatkiem 0,3% oxgalu. Po 4 godz. inkubacji w temp. 37 o C badany materiał wysiewano w odpowiednim rozcieńczeniu na agarowe podłoże MRS. Na podstawie liczby kolonii, które wyrosły po 48 godz. inkubacji na płytkach w temp. 37 C określano zdolność badanych szczepów do przeżycia w obecności soli żółciowych. Przeżywalność kultur bakterii wyrażano w procentach obliczonych z logarytmów liczb jednostek tworzących kolonie po 4 godzinach inkubacji z dodatkiem soli żółciowych w stosunku do logarytmów liczb jednostek tworzących kolonie po 4 godzinach inkubacji bez dodatku soli żółciowych do pożywki. 5. Aktywność antybakteryjną wyizolowanych szczepów określono metodą Pilet zmodyfikowaną przez Chabłowską [Grajek i n. 1996, Pilet i in. 1995]. Zasada metody oparta jest na pomiarze wielkości stref zahamowania wzrostu wokół wyrośniętych kolonii bakterii kwasu mlekowego w podłożach zaszczepionych szczepami patogennymi (II. 2) 6. Metody analityczne W prowadzonych próbach fermentacyjnych oznaczano zawartość: - kwasu mlekowego ogółem (kwasowość ogólna w przeliczeniu na kwas mlekowy), metodą miareczkową z NaOH [Drzazga 1974], 41
- kwasu L(+) i D(-) mlekowego metodą enzymatyczną (testy biochemiczne firmy Boehringer Mannheim GmbH) [32], - cukrów y prostych metodą z DNS po uprzedniej hydrolizie sacharozy [21]. 42
IV. WYNIKI BADAŃ I 1. Izolacja bakterii kwasu mlekowego z przewodu pokarmowego kurcząt Izolację bakterii prowadzono z jelita ślepego i wola kurcząt. Początkowo otrzymano 39 szczepów, z których po przeprowadzeniu wstępnej selekcji do dalszych badań wybrano 13 szczepów charakteryzujących się zdolnością do wytwarzania kwasu mlekowego wstępnie określoną na podstawie wielkości stref rozjaśnienia podłoża Szembera wokół wyrośniętych kolonii. Wszystkie wyizolowane szczepy rosły w warunkach beztlenowych w ciekłym podłożu MRS w temp. 20 o C, 37 o C i 45 o C już po 24 godzinnej inkubacji. Charakterystykę intensywności wzrostu badanych szczepów w różnych temperaturach przedstawiono w tabeli 1. Tabela 1. Wpływ temperatury i czasu na wzrost wyizolowanych bakterii Symbol szczepu 20 o C 37 o C 45 o C 24 godz. 48 godz. 24 godz. 48 godz. 24 godz. 48 godz. 1K + ++ + ++ + ++ 2K + ++ ++ ++ ++ ++ 3K + ++ ++ ++ + ++ 4K ++ ++ ++ ++ ++ ++ 5K + ++ ++ ++ ++ ++ 6K + + + ++ ++ ++ 7K ++ ++ ++ ++ ++ ++ 8K + ++ + ++ ++ ++ 9K + ++ + ++ + ++ 10K ++ ++ ++ ++ ++ ++ 11K + ++ ++ ++ ++ ++ 12K + ++ ++ ++ ++ ++ 13K ++ ++ ++ ++ ++ ++ Legenda: + - słaby wzrost (słabe zmętnienie podłoża) ++ - intensywny wzrost ( bardzo duże zmętnienie podłoża z widocznym osadem) Wszystkie badane szczepy charakteryzowały się wzrostem w temperaturach 20 o C, 37 o C i 45 o C już po 24 godz. Hodowli (tabela 1).. W tabeli 2 przedstawiono charakterystykę morfologiczną komórek otrzymanych szczepów po hodowli w warunkach beztlenowych. Większość wyizolowanych szczepów w obrazie mikroskopowym określono jako krótkie lub bardzo krótkie pałeczki proste lub lekko zgięte występujące pojedynczo lub po dwie, czasami po trzy i cztery komórki. Niektóre z nich tworzyły łańcuszki, inne występowały pojedynczo w postaci tzw. ziarniako-pałeczek. 43
Tabela 2. Charakterystyka morfologiczna otrzymanych szczepów hodowanych w warunkach beztlenowych Symbol Obraz mikroskopowy szczepu 1K 2K 3K 4K 5K 6K 7K 8K 9K 10K 11K 12K 13K krótkie proste pałeczki, układające się pojedynczo lub po dwie, trzy komórki krótkie proste pałeczki, układające się po kilka (2, 3) w krótkie łańcuszki krótkie proste pałeczki, układające się pojedynczo lub po dwie, trzy komórki krótkie proste pałeczki, układające się po kilka (2, 3) w krótkie łańcuszki bardzo krótkie ziarniako-pałeczki, układające się pojedynczo średniej długości i długie proste pałeczki bardzo krótkie ziarniako-pałeczki, najczęściej układające się po dwie komórki średniej długości proste pałeczki układające się pojedynczo średniej długości, lekko zgięte komórki układające się pojedynczo krótkie proste pałeczki tworzące małe skupiska (po 3, 4 komórki) średniej długości, lekko zgięte komórki układające się pojedynczo krótkie pałeczki tworzące łańcuszki bardzo krótkie, drobne ziarniako-pałeczki 2. Charakterystyka wzrostu badanych szczepów bakterii Wzrost szczepów bakterii wyizolowanych z przewodu pokarmowego kurcząt charakteryzowano na podstawie liczby komórek oznaczonych po 24 godzinach hodowli w płynnym podłożu MRS w temperaturze 37 C. Tabela 3. Charakterystyka wzrostu wyizolowanych szczepów w podłożu MRS o ph 5,7 Symbol szczepu Liczba jtk/ml wyizolowanych szczepów po 24 h hodowli w podłożu MRS w. 37 o C Warunki tlenowe warunki beztlenowe 1K 1,2 x 10 7 2,2 x 10 8 2K 8,5 x 10 6 2,2 x 10 8 3K 7,8 x 10 6 9,5 x 10 8 4K 7,1 x 10 5 8,3 x 10 7 5K 8,0 x 10 6 9,0 x 10 8 6K 9,0 x 10 6 6,0 x 10 9 7K 1,0 x 10 9 5,0 x 10 9 8K 7,5 x 10 6 3,0 x 10 8 9K 6,3 x 10 5 4,9 x 10 7 10K 2,2 x 10 9 1,3 x 10 10 11K 4,0 x 10 8 1,0 x 10 9 12K 3,0 x 10 7 6,5 x 10 9 13K 6,5 x 10 6 5,4 x 10 9 44
Intensywny wzrost wszystkich badanych szczepów stwierdzono już po 24 godzinach hodowli w temperaturze 37 C, zarówno w warunkach beztlenowych jak i tlenowych (tabela 3). Zastosowanie beztlenowych warunków hodowli dla wszystkich badanych szczepów było korzystniejsze, co wyrażało się wyższą liczbą j.t.k. w 1 ml podłoża. Najlepsze hodowle szczepów oznaczone symbolami: 6K, 7K, 10K, 12K i 13K charakteryzowały się w tych warunkach liczebnością komórek rzędu 10 9 10 10 w 1 ml cieczy hodowlanej i na tej podstawie zostały wybrane do dalszych badań. 3. Charakterystyka tolerancji bakterii kwasu mlekowego wobec kwasowości środowiska Charakterystyka tolerancji wybranych do dalszych badań szczepów bakterii kwasu mlekowego na niskie ph środowiska przedstawiono w tabeli 4. Tabela 4. Przeżywalność szczepów po 4 godzinnej ekspozycji w podłożu MRS o ph 2 Symbol szczepu Przeżywalność % Wzrost szczepów w podłożu MRS po 4 godz. ekspozycji Próba kontrolna - w ph 5,7 w ph 2,0 j.t.k./ml log(j.t.k./ml) j.t.k./ml log(j.t.k./ml) 6K 5,8 x 10 9 9,76343 8,8 x 10 4 4,94448 50,6 7K 5,2 x 10 9 9,71600 7,6 x 10 4 4,88081 50,2 10K 1,5 x 10 10 10,17609 2,0 x 10 5 5,30103 52,1 12K 6,3 x 10 9 9,79934 8,5 x 10 4 4,92942 50,3 13K 5,6 x 10 9 9,74819 9,0 x 10 4 4,95423 50,8 Z przedstawionych w tabeli 4 danych, widać, że wszystkie badane szczepy przeżyły 4 godzinną ekspozycję w temperaturze 37 C w podłożu o ph 2,0. Liczba żywych komórek w 1 ml podłoża w w/w warunkach wynosiła w zależności od szczepu od 7,6 x 10 4 do 2,0 x 10 5. Wyniki przeprowadzonych badań wskazują na wysoką oporność wyizolowanych szczepów na niskie ph środowiska. 4. Charakterystyka tolerancji bakterii kwasu mlekowego na obecność w środowisku soli żółciowych Wyniki dotyczące oceny tolerancji badanych szczepów bakterii kwasu mlekowego na obecność soli żółciowych w środowisku przedstawiono w tabeli 5. Wszystkie badane szczepy bakterii przeżyły 4. godzinną inkubację w temperaturze 37 C w podłożu zawierającym 0,3% oxgalu. Liczba żywych komórek w 1 ml podłoża w w/w warunkach była wysoka i wynosiła w zależności od szczepu od 6,4 x 10 7 do 2,0 x 10 8, co świadczy o bardzo wysokiej oporności wyizolowanych szczepów na obecność soli żółciowych. 45
Tabela 5. Przeżywalność szczepów bakterii po 4. godzinnej ekspozycji w podłożu MRS z dodatkiem 0,3% oxgalu Symbol szczepu Populacja szczepów w podłożu MRS po 4 godz. ekspozycji Próba kontrolna - bez dodatku oxgalu z dodatkiem 0,3% oxgalu j.t.k./ml log(j.t.k./ml) j.t.k./ml log(j.t.k./ml) Przeżywalność % 6K 6,3 x 10 9 9,79924 1,2 x 10 8 8,07918 82,4 7K 4,7 x 10 9 9,67210 1,0 x 10 8 8,00000 82,7 10K 1,1 x 10 10 10,04139 2,0 x 10 8 8,30103 82,7 12K 6,8 x 10 9 9,83251 1,9 x 10 8 8,27875 84,2 13K 5,1 x 10 9 9,70757 6,4 x 10 7 7,80618 80,4 5. Ocena zdolności wyizolowanych szczepów bakterii do syntezy kwasu mlekowego Zdolność do biosyntezy kwasu mlekowego z glukozy przez 5 szczepów z uwzględnieniem kwasu mlekowego ogółem i jego form izomerycznych D(-) i L(+) przedstawiono w tabeli 6. W 100 ml podłoża z glukozą jako jedynym źródłem węgla badane szczepy (6K, 7K, 10K, 12K i 13K) po 48 godz. hodowli wytwarzały od 1,15g do 2g kwasu mlekowego. Oznaczono także zawartość izomerów L(+) i D(-) w ogólnej ilości wytwarzanego kwasu przez badane szczepy. Najwięcej kwasu mlekowego w formie izomeru L(+) (1,16 g/100ml pożywki) wytwarzał szczep 6K zaś izomeru D(-) (1,10 g/100 ml pożywki) szczep 7K. Tabela 6. Wydajność syntezy kwasu mlekowego z glukozy przez wyizolowane szczepy bakterii Zawartość kwasu mlekowego (g/100 ml)* Symbol izomer L(+) izomer D(-) szczepu ogółem g/100 ml % zawartości % zawartości w g/100 ml w g/100 ml kw. mlekowego kw. mlekowego po 24 godz. po 48 godz. 6K 1,86 1,96 1,16 59,18 0,78 39,80 7K 1,47 1,96 0,84 42,85 1,10 56,12 10K 1,42 1,85 0,94 50,81 0,89 47,09 12K 1,69 1,98 1,01 51,01 0,95 47,98 13K 1,03 1,15 0,58 50,43 0,53 46,09 *Hodowlę bakterii prowadzono w pożywce z glukozą 20g/l. 6. Antybakteryjna aktywność wyizolowanych szczepów bakterii kwasu mlekowego Antybakteryjną aktywność wyizolowanych szczepów bakterii kwasu mlekowego w stosunku do wybranych 2 szczepów wskaźnikowych (Listeria innocua i B. subtilis) i 7 szczepów patogennych (Salmonella D, Salmonella CO, Salmonella enteritidis, L. monocytogenes, 46
Piwet E. coli hemolityczna, K E. coli, S E.coli określono na podstawie średnicy stref zahamowania ich. wzrostu (tabela 7). Każdy z wyizolowanych szczepów charakteryzował się już po 24 hodowli zdolnością hamowania wzrostu, wszystkich szczepów patogennych i wskaźnikowych, przy czym aktywność antagonistyczna poszczególnych szczepów była zróżnicowana. Najwyższą aktywność antagonistyczną wykazywał szczep 10K. Tabela 7. Charakterystyka zdolności hamowania wzrostu wybranych szczepów patogennych Strefa zahamowania wzrostu, mm Symbol szczepu 6 K - KKP/876 10 K - KKP/877 12 K - KKP/807 Czas hodowli, godz. 24 48 72 24 48 72 24 48 72 Salmonella D 10 15 16 16 23 23 16 16 18 Salmonella CO 11 12 15 11 13 13 13 16 18 Listeria innocua 14 14 15 12 18 20 11 15 17 Salmonella enteritidis 10 14 15 11 12 13 12 16 18 L. monocytogenes -10 10 10 8 10 10 12 12 12 Piwet E.coli hemolityczna 14 17 18 11 13 14 11 11 11 K E.coli hemolityczna 18 19 19 20 25 25 14 15 15 S E.coli hemolityczna Szczep13K KKP 808-24h-16, 13, 17, 14, 12, 10, 12, 13 12 13 13 11 12 12 12 12 13 48h-16, 15, 18, 17, 12, 10, 12, 13 72h-17, 15, 18, 19, 12, 12, 15, 13 7. Identyfikacja gatunkowa wyizolowanych bakterii kwasu mlekowego Zdolność wyizolowanych szczepów do fermentacji 48 różnych węglowodanów oceniono przy użyciu testów API. Analizę wyników (danych) uzyskanych z przeprowadzonych testów wykonano przy zastosowaniu programu komputerowego programu API 50 CHL IDENTIFICATION SYSTEM V4.0 TAXONOMY AND CLASSIFICATION OF LACTIC ACID BACTERIA. W celu identyfikacji gatunkowej bakterii, dla których procent identyfikacji w teście API 50CHL był niski lub nie do zaakceptowania przeprowadzono dodatkowe testy identyfikacyjne Rapid ID 32 A firmy biomérieux. Analizę otrzymanych wyników z testu mini API Rapid ID 32A przeprowadzono przy użyciu programu komputerowego API Rapid ID 32A IDENTIFICATION SYSTEM FOR ANAEROBES V3.0. W tabeli 10 przestawiono wyniki tej analizy. 47
Tabela 8. Efekty identyfikacji gatunkowej wyizolowanych szczepów bakterii na podstawie testu API Rapid ID 32 A Nazwa Symbol szczepu Gatunek wg testów API Identyfikacja szczepu Rapid ID32A prawdopodobieństwa % 12K KKP 878 Lactobacillus acidophilus 98,7 13K KKP 879 Bifidobacterium sp. 99,8 Na podstawie dodatkowych testów, szczep 13K został zaklasyfikowany do gatunku Bifidobacterium adolescentis. Wyniki testu uzyskane przy użyciu programu komputerowego przedstawiono w tabeli 9. Tabela 9. Efekty dodatkowych testów dla identyfikacji szczepu Bifidobacterium sp. Szczep CELac ARAac ESC(HYD) SALICINac Bif. adolescentis 90% 90% 95% 95% Bif. breve 95% 5% 95% 75% Bif. bifidum 5% 5% 10% 5% Bif. iinfantis 10% 5% 95% 75% Otrzymane wyniki z testów API 50CHL) oraz wyniki reakcji biochemicznych testu mini API Rapid ID32A) były podstawą do identyfikacji gatunkowej wyizolowanych szczepów. Czterem wyizolowanym szczepom bakterii kwasu mlekowego nadano symbol i włączono do Kolekcji Kultur Drobnoustrojów Przemysłowych. Były to następujące szczepy: - 6K - Lactobacillus acidophilus KKP 876-10K - Lactobacillus plantarum KKP 877-12K - Lactobacillus acidophilus KKP 878-13K - Bifidobacterium adolescentis KKP 879 W charakterystyce szczepu 7K zastosowanie do diagnostyki zarówno testu API 50 CHL jak i testu API Rapid ID 32A nie pozwoliło otrzymać jednoznacznych wyników, co uniemożliwiło określenie przynależności tego szczepu do rodzaju i gatunku. Mimo, że szczep ten wykazywał potencjalne właściwości probiotyczne został odrzucony ze względu na brak możliwości zaklasyfikowania go do bakterii kwasu mlekowego, czyli pośrednio nadania mu statusu bezpiecznej bakterii dla ludzi i zwierząt (GRAS) i w związku z tym brak możliwości zastosowania tego szczepu do produkcji preparatów probiotycznych. V. WNIOSKI Wyniki otrzymane w przeprowadzonych badaniach upoważniaja do sformułowania następujących wniosków: 48
1. Szczepy wyizolowane z przewodu pokarmowego kurcząt należą do gatunku: Lactobacillis acidophilus (2 szczepy), Lactobacillus plantarum i Bifidobacterium adolescentis. 2. Wszystkie badane mikroorganizmy charakteryzują się dobrym wzrostem, po 24 godzinach hodowli w temp. 37 o C ich populacja wynosi 10 9-10 10 w 1 ml. 3. Badane drobnoustroje wykazują znaczną tolerancją na niskie ph środowiska oraz obecność soli żółciowych w środowisku. 4. Wyizolowane szczepy charakteryzują się wysoką zdolnością do wytwarzania kwasu mlekowego z glukozy już po 24 godzinach hodowli w temp. 37 C 5. Wszystkie badane szczepy wytwarzają metabolity, które skutecznie hamują wzrost wszystkich testowanych szczepów patogennych. 6. Wyizolowane cztery szczepy (KKP 876, KKP 877, KKP 878 i KKP 879) wykazujące potencjalne właściwości probiotyczne zostały przekazane do Zakładu Technologii Fermentacji w celu prowadzenia dalszych badań nad przydatnością do produkcji preparatów probiotycznych. VI. PIŚMIENNICTWO 1. Bardowski J. (2000): Katabolizm cukrów u bakterii fermentacji mlekowej badania podstawowe i znaczenie aplikacyjne. Szkoła Letnia, Bakterie Fermentacji Mlekowej klasyfikacja, metabolizm, genetyka, wykorzystanie. Kazimierz Dolny n/wisłą, w. 3 2. Brzóska F., Grzybowski R., Stecka K., Pieszka M. (1999) Efektywność żywieniowa wybranych mikroorganizmów probiotycznych u kurcząt brojlerów. Rocz. Nauk. Zootech. 26 (4), 291-302 3. Brzóska F., Grzybowski R., Stecka K., Pieszka M. (1999) Zastąpienie antybiotyków probiotykami w żywieniu kurcząt brojlerów. Rocz. Nauk. Zootech. 26 (4), 302-316 4. Burbianka M., Pliszka A. (1983): Mikrobiologia żywności. PZWL Warszawa 5. Chateau N., Castellanos J., Deschamps A.M. (1993): Distribution of pathogen inhibition in the Lactobacillus isolates of a commercial probiotic consortium. J. Appl. Bacteriol., 74, 36-40 6. Daly C (1991): Lactic acid bacteria and milk fermentations. J. Chem. Technol. Biotechnol., 51, 544-548 7. Drzazga Bogdan. (1974): Analiza techniczna w przetwórstwie owoców i warzyw. W. Sz. Ped. Warszawa. 8. Fooks L.J., Fuller R., Gibson G.R. (1999): Prebiotics, probiotics and human gut microbiology. International Dairy Journal 9, 53-61 9. Grajek W., Babowicz-Lasocińska T., Sip A. (1996): Production of bacteriocins by Corynebacterium divergens grown in culture media containing hydrolysate of whey, casein and malt roots. Pol. J. Food Nutr. Sci. 5/46 (4). Metoda zmodyfikowana przez Chabłowską B. IBPRS Warszawa. 10. Grzybowski R.A., Stecka K.M. Szkudzińska-Rzeszowiak E.A. i wsp. (1997): Kryteria oceny i selekcja mikroorganizmów jako składników preparatów probiotycznych. Pr. Inst. Lab. Bad. Przem. Spoż., 52, 5-30 11. Grzybowski R.A., Stecka K.M. Szkudzińska-Rzeszowiak E.A., Milewski A. (1998): Bakterie fermentacji mlekowej jako składniki preparatów probiotycznych. Bakterie fermentacji mlekowej. Klasyfikacja, metabolizm, genetyka, wykorzystanie. Łódź: PŁ, s.150-158 12. Juszczakiewicz D., Złotkowska H., Krakowiak A. (2002): Poszukiwanie i selekcja szczepów bakterii kwasu mlekowego przeznaczonych do otrzymywania preparatów probiotycznych. Sprawozdanie z tematu: 1.2.2., Warszawa 13. Juszczakiewicz D., Złotkowska H., Krakowiak A. (2003): Izolacja bakterii kwasu mlekowego o właściwościach probiotycznych z przewodu pokarmowego przeżuwaczy. Pr. Inst. Lab. Bad. Przem. Spoż. 58, 7-18 49
14. Klewicka E., Libudzisz Z. (1998): Aktywność antagonistyczna bakterii mlekowych. Szkoła Letnia Bakterie Fermentacji Mlekowej klasyfikacja, metabolizm, genetyka, wykorzystanie. Ciechocinek, s. 13 15. Lee Y.K. Salminen S. (1995): The coming of age of probiotics. Trends Food Sci. Technol., 7(6) 16. Marteau P., Rambaud J-C. (1993): Potential of using lactic acid bacteria for therapy and immunomodulation in man. FEMS Microbiol. Rev., 12, 207-220 17. Martirosian G., Meisel-Mikołajczyk F. (2000): Probiotyki a beztlenowa mikroflora jelitowa. Szkoła Letnia, Bakterie Fermentacji Mlekowej klasyfikacja, metabolizm, genetyka, wykorzystanie. Kazimierz Dolny n/wisłą, w. 6 18. Mattila-Sandholm T., Matto J., Saarela M. (1999): L: Lactic acic bacteria with health claims interactions and interference with gastrointestinal flora. International Dairy Journal 9, 25-35 19. Mitall B.K., Gang S.K. (1995): Anticarcinogenic, hypocholesterolemic and antagonistic activities of Lactobacillus acidiphilus. Crit. Rev. Microbiol., 21, 175-214 20. Moteva V., Stefanova T., Budakov I. I wsp. (1998): Characterization of bacteriocins produced by strains from traditional Bulgarian dairy products. Systematic Appl. Microbiol. 21 (1), 151-161 21. Miller G.L: Analiza chemiczna. 1969, 426-428 22. Ouwehand A.C., Kirjavainen P.K, Shortt C., Salminnen S. (1999): Probiotics: mechanisms and established effects. Inter. Dairy J. 9 43-52 23. Perez P.F., Minnaard Y., Disalvo E.A., de Antoni G.L. (1998): Surface Properties of Bifidobacterial Strains of Human Origin. Appl. a. Environm. Microbiol., 64 (1), 21-26 24. Pilet M.-F., Dousset X., Barre R., Novel G., Desmazeaud M., Piard J.-Ch. (1995): Evidence for two bacteriocins produced by Carnobacterium piscicola and Carnobacterium divergens isolated from fish and active against Listeria monocytogenes. J. Food. Prot., 58, 256-262 25. Sneath P.H.A. (1986): Bergey s Manual of Systematic Bacteriology, t. II, Baltimore. 26. Stecka K.M., Szkudzińska-Rzeszowiak E.A., Grzybowski R.A., Milewski J.A. (1997): Wpływ wybranych parametrów hodowli na wzrost bakterii fermentacji mlekowej i wytwarzanie niektórych metabolitów. Prace Inst. Lab. Bad. Przem. Spoż., 52, 31-53 27. Zielińska K., Sawicka-Żukowska R., Stecka K., Jędrychowska B., Miecznikowski A. (1996): Poszukiwanie drobnoustrojów zdolnych do wytwarzania kwsu mlekowego z natywnej skrobi ziemniaczanej. Prace Inst. Lab. Bad. Przem. Spoż. 51, 67-81 28. Zielińska K., Miecznikowski A., Suterska A. (1997): Poszukiwanie bakterii fermentacji mlekowej zdolnych do wykorzystywania celulozy lub ksylanu jako jedynego źródła węgla. Prace Inst. Lab. Bad. Przem. Spoż. 52, 54-65 29. Zielińska K., Chabłowska B., Suterska A. (1999): Selekcja szczepów bakterii fermentacji mlekowej w kierunku ich aktywności celulolitycznej. Prace Inst. Lab. Bad. Przem. Spoż. 54, 5-19 30. Złotkowska H., Ilnicka-Olejniczak O. (1996): Ocena zdolności fermentacyjnej szczepów Lactobacillus delbrueckii ze szczególnym uwzględnieniem kwasu L(+) mlekowego. Pr. Inst. Lab. Bad. Przem. Spoż., 51, 82-94 31. Złotkowska H., Juszczakiewicz D., Krakowiak A. (2002): Selekcja szczepów bakterii kwasu mlekowego o właściwościach probiotycznych. Pr. Inst. Lab. Bad. Przem.-Spoż. 57, 71-86 32. /-/ Metoda oznaczania kwasu L(+) i D(-) mlekowego i kwasu octowego. Testy biochemiczne firmy Boehringer Mannheim GmBH) 33. /-/ Prospekt firmy Chr Hansesn - Lactic acid bacteria as probiotic ingredients. 34. /-/ Prospekt firmy Chr. Hansen - Your natural partner in food ingredients. 35. /-/ Prospekt firmy Hansen - Exact. 36. /-/ Prospekt firmy Hansen - Yo-Flex. 37. /-/ Prospekt firmy Morinaga - Morinaga Lyophilized Bifidobacteria BB536 Bifidobacterium longum. 38. /-/ Prospekt firmy StarLab - Lactic Acid Bacteria. Strategic & Applied Research. 39. /-/ Prospekt firmy Wiesby Probiotics. 40. /-/ Prospekt firmy Wiesby - Using Probiotic Bacteria Strains in Dairying 41. /-/ Technologia probiotyków - oferta Zakładu Technologii Fermentacji IBPRS 50