Mechanizmy zaprogramowanej śmierci efektorowych limfocytów T Mechanisms of programmed cell death of effector T lymphocytes

Postepy Hig Med Dosw (online), 2013; 67: 1374-1390 e-issn 1732-2693 www.phmd.pl Review Received: 2013.02.27 Accepted: 2013.10.05 Published: 2013.12.30 Mechanizmy zaprogramowanej śmierci efektorowych limfocytów T Mechanisms of programmed cell death of effector T lymphocytes Grzegorz Przybylski 1, Joanna Wielikdzień 2, Piotr Kopiński 2 1 Katedra i Klinika Chorób Płuc, Nowotworów i Gruźlicy, Collegium Medicum, Uniwersytet Mikołaja Kopernika, Bydgoszcz/Toruń 2 Katedra i Zakład Genoterapii, Collegium Medicum, Uniwersytet Mikołaja Kopernika, Bydgoszcz/Toruń Streszczenie Prawidłowa czynność limfocytów T jest niezbędna w obronie przed patogenami. Przejściowe zaburzenie homeostazy układu odpornościowego pojawia się, gdy wyjściowo dziewicze komórki T podejmują stymulowaną swoistymi antygenami ekspansję i nabywają czynności efektorowych. Następnie efektorowe limfocyty T albo ulegają zjawisku zaprogramowanej śmierci (programmed cell heath PCD), zachodzącej zwykle w wyniku masywnej apoptozy w fazie kontrakcji odpowiedzi immunologicznej, albo przeżywają jako komórki pamięci. W pracy omówiono dwa główne szlaki PCD komórek T: śmierć komórkową indukowaną aktywacją (activation induced cell Heath AICD), tj. odmianę apoptozy zewnątrzpochodnej oraz śmierć z zaniechania (neglect induced heath NID), stanowiącą przykład apoptozy wewnątrzpochodnej. Wcześniejsze badania na modelach in vitro wsparły pogląd o przeważającym znaczeniu AICD w kontrakcji układu immunologicznego, zwłaszcza wskutek swoistej mobilizacji receptora TCR. Zabrakło jednak potwierdzenia zarówno w badaniach eksperymentalnych in vivo, jak i w klinicznych pracach autorów niniejszej publikacji, które dotyczyły apoptozy uczulonych antygenowo komórek T w przewlekłych chorobach zapalnych dolnych dróg oddechowych. Obecnie uważa się, że krytyczne w wygaszaniu odczynu w komórkach T są białka rodziny Bcl-2 i proces NID. Najbardziej prawdopodobnymi kandydatami na czynniki regulujące kontrakcję limfocytów T są: antyapoptotyczna cząsteczka Bcl-2 i jej proapoptotyczny antagonista Bim, oba pod nadrzędną kontrolą autokrynnej interleukiny 2. Przedyskutowano także inne możliwe mechanizmy regulujące proces kontrakcji, takie jak ligacja receptorów śmierci, udział cytokin i znaczenie czynnika transkrypcyjnego NF-κB. Dodatkowo zwrócono uwagę na potencjalną rolę regulowania przeżycia/apoptozy limfocytów w przyszłych próbach terapii nowotworów i włóknienia płuc. Słowa kluczowe: apoptoza śmierć komórkowa indukowana aktywacją (AICD) białka Bcl-2 efektorowe limfocyty T śmierć z zaniechania (NID) Summary T cell adequate function is critical for defense against pathogens. Transient disruption of T cell homeostasis occurs when primarily naive cells undergo antigen-driven expansion and acquire effector functions. Effector T cells then either undergo programmed cell death (PCD, it occurs usually as massive apoptosis during the contraction phase of the immune response) or survive to become memory cells. Two main pathways of effector T cell PCD are discussed in the review: activation-induced cell death (AICD), which is a form of extrinsic apoptosis, and neglect-induced death (NID), which is an intrinsic one. Initial studies using in vitro models supported a role of AICD, mostly initiated by TCR receptor triggering in immune contraction. However, 1374 Postepy Hig Med Dosw (online), 2013; 67

Przybylski G. i wsp. - Mechanizmy zaprogramowanej śmierci... it was not finally supported by either recent in vivo experiments or current review authors clinical studies concerning primed T cell apoptosis in chronic inflammatory lower airway diseases. Actually, Bcl-2 family members seem to be critical for the culling of T cell responses. The antiapoptotic molecule Bcl-2 and its proapoptotic antagonist Bcl-2, both under upstream control of autocrine interleukin-2, are the most probable candidates for regulators of T cell contraction. Other possible mechanisms regulating the process of contraction such as death receptor ligation, the impact of cytokines, as well as the importance of transcription factor NF-κB, are discussed. Additionally, attention is turned to the potential role of T cell survival/ apoptosis regulation in future therapies of some diseases, including tumors and lung fibrosis. Keywords: apoptosis activation-induced cell death Bcl-2 proteins effector T cells neglect-induced death Full-text PDF: Word count: Tables: Figures: References: http://www.phmd.pl/fulltxt.php?icid=1085092 6836 2 2 101 Adres autora: Wykaz skrótów: dr n.med. Grzegorz Przybylski, Katedra i Klinika Chorób Płuc, Nowotworów i Gruźlicy, Collegium Medicum, Uniwersytet Mikołaja Kopernika, Bydgoszcz/Toruń, ul. Seminaryjna 1, 85-326 Bydgoszcz; e-mail: gprzybylski@cm.umk.pl AICD śmierć komórkowa indukowana aktywacją (activation-induced cell death); APAF-1 czynnik aktywujący proteazy w apoptozie (apoptotic protease-activating factor-1); AP-1 czynnik transkrypcyjny AP-1 (activator protein 1); APC komórka prezentująca antygen (antigen presenting cell); Bad białko proapoptotyczne podrodziny BH3-only (Bcl-2 antagonist of cell death); Bak białko proapoptotyczne podrodziny Bax (Bcl-2 antagonist killer 1); BAL płukanie oskrzelowo-pęcherzykowe (bronchoalveolar lavage); Bax białko proapoptotyczne podrodziny Bax (Bcl-2-associated protein X); Bcl-2 rodzina endogennych białkowych regulatorów apoptozy (B-cell leukemia/lymphoma-2); Bcl-xL inhibitorowe białko apoptozy (B-cell lymphoma-extra large); Bid aktywatorowe białko proapoptotyczne podrodziny BH3-only (BH3 interacting domain death antagonist); Bim aktywatorowe białko proapoptotyczne podrodziny BH3-only (Bcl-2 interacting mediator of cell death); Bok białko proapoptotyczne podrodziny Bax (Bcl-2-related ovarian killer); cflip białko antyapoptotyczne, hamuje kaspazę 8 (FLICE inhibitory protein); CTL limfocyt cytotoksyczny (cytotoxic lymphocyte); DC komórka dendrytyczna (denditic cell); DISC kompleks sygnalizacyjny indukujący śmierć komórki (death-inducing signaling complex); DR4,5 receptor śmierci 4,5 (death receptor 4,5); FasL ligand Fas; GZMA (B) granzym A (B); HPK1 hematopoetyczna progenitorowa kinaza 1 (hematopoietic progenitor kinase 1); HPK-C kadłubowa (C-końcowa) izoforma kinazy HPK; IFN-γ interferon γ; IKK kinaza inhibitora κb, (I kappa B kinase); JAK kinaza Janusowa; JNK N-końcowa kinaza c-jun (c-jun N-terminal kinase); Mcl-1 antyapoptotyczne białko podrodziny Bcl-2 (myeloid cell leukemia-1); NF-κB transkrypcyjny czynnik jądrowy κb (nuclear factor κb); Noxa białko proapoptotyczne podrodziny BH3-only (łac. noxa uszkodzenie); PCD zaprogramowana śmierć komórki (programmed cell death); Puma białko proapoptotyczne podrodziny BH3-only (p53 upregulated modulator of apoptosis); ROS wolne rodniki tlenowe (radical oxygen species); STAT-5 czynnik transkrypcyjny (signal transduced and activator of transcription 5); TNFR receptor czynnika martwicy nowotworu (tumor necrosis factor receptor); TNF-α czynnik martwicy nowotworu α (tumor necrosis factor α); TRADD związane z TNFR1 białko adaptorowe z domeną śmierci (TNFR associated death domain-containing protein); TRAIL ligand martwicy nowotworu indukującego apoptozę (TNF-related apoptosis inducing ligand-receptor). 1375

Postepy Hig Med Dosw (online), 2013; tom 67: 1374-1390 Wprowadzenie Autorzy niniejszej pracy badali w ostatnich latach apoptozę limfocytów pochodzących z płukania oskrzelowo- -pęcherzykowego (broncholaveolar lavage BAL), czyli tzw. limfocytów pęcherzykowych, w chorobach zapalnych dolnych dróg oddechowych [46]. Opracowując otrzymane wyniki spostrzeżono, że niewiele wiadomo o udziale apoptozy w regulacji liczby i czynności obwodowych, uczulonych antygenowo komórek T, a z takich składają się limfocyty BAL [1]. Było to przyczynkiem do zawartej tu rekapitulacji aktualnych poglądów dotyczących tego zagadnienia. Przez wzgląd na złożoność problemu i celem nadania pracy zwartości, opis apoptozy przedstawiono zwięźle w poglądowy sposób. W pracy skoncentrowano się na mechanizmach, które w myśl aktualnych przekonań pełnią główną rolę w przebiegu odczynu zapalnego w puli antygenowo uczulonych efektorowych limfocytów T. W skrócie odniesiono się do zagadnień apoptozy/przeżycia: 1) tymocytów (zwłaszcza w przebiegu dokładniej poznanej tzw. selekcji negatywnej w grasicy); 2) nieuczulonych antygenowo (naiwnych) komórek T oraz 3) komórek pamięci T. Te dodatkowe informacje mogą być przydatne, per analogiam, do analizy mechanizmów zaprogramowanej śmierci efektorowych komórek T. Podstawowe pojęcia apoptozy Ważnym elementem homeostazy układu odpornościowego jest kontrola cyklu życiowego limfocytów, a więc alternatywnych procesów proliferacji i zaprogramowanej śmierci komórek (programmed cell death PCD). Oba zjawiska są podstawowe dla prawidłowego działania układu komórek T, zasadniczego narzędzia adaptacyjnej odpowiedzi immunologicznej. Ważnym mechanizmem PCD jest apoptoza, przebiegająca typowo ( kanonicznie ) z udziałem enzymów grupy kaspaz i z charakterystyczną kondensacją jąder komórkowych [37]. Stanowi ona realizację własnego programu genetycznego komórki, umożliwia więc jej niejako samobójczą śmierć w sposób planowy i uporządkowany (m.in. zależny od dostawy energii). Apoptoza uczestniczy w rozwoju i czynności układu immunologicznego, w tym w regulacji odpowiedzi limfocytów T na obce antygeny. Podsumowując, istnieją dwa główne szlaki apoptozy: 1) zewnątrzpochodny (receptorowy), uruchamiany przyłączeniem (ligacją) białek rodziny czynnika martwicy nowotworu (tumor necrosis factor - TNF) do swoistych receptorów, znanych jako receptory śmierci, należących z kolei do rodziny receptora czynnika martwicy nowotworu, TNFR oraz 2) wewnątrzpochodny (mitochondrialny), rozpoczynający się dezintegracją błon mitochondriów i przedostaniem się induktorów apoptozy do cytosolu. W pierwszym przypadku komplementacja par ligand:receptor śmierci (typowe pary to ligand Fas(FasL):Fas, TNF-α:TNFR1, TRAIL:DR4/DR5) prowadzi do zmian konformacyjnych części cytoplazmatycznych receptorów śmierci. Obecne na tych ostatnich motywy, znane jako domeny śmierci, przyłączają homologiczne domeny białek adaptorowych (dla pary TNF-α:TNFR1 białko adaptorowe TRADD, dla pozostałych FADD). Powstaje tzw. kompleks DISC (death-inducing silencing complex), zawierający m.in. prokaspazę 8; zachodzi w nim aktywacja tej ostatniej do czynnej kaspazy 8. Antagonistą procesu jest nieczynny enzymatycznie homolog tej kaspazy, białko cflip [3]. Natomiast w szlaku wewnątrzpochodnym przepuszczalność błon mitochondriów kontroluje rodzina białek Bcl-2, do których należą zarówno czynniki pro- i antyapoptotyczne, podzielone na trzy podrodziny. Do pierwszej z nich należą Bax, Bak i Bok (podrodzina Bax). Rozszczelniają one błony, ich znaczenie jest więc proapoptotyczne. Przeciwnie działają czynniki podrodziny Bcl-2 (w komórkach T właściwe białko Bcl-2, a także Bcl-xL, Mcl-1 i A1). Wzajemna równowaga tych dwóch grup czynników podlega z kolei kontroli ze strony białek trzeciej podrodziny (tzw. BH3-only), których wpływ jest silnie proapoptotyczny (w limfocytach T wykryto obecność następujących czynników podrodziny: Bim, Bid, Bad, Puma, Noxa, NIX i BNIP3) [92]. Uwolniony z mitochondriów cytochrom c wiąże się z białkiem APAF-1 i prokaspazą 9. Powstaje kompleks zwany apoptosomem, w obrębie którego zachodzi aktywacja kaspazy 9 [3]. Oba szlaki, zewnątrz- i wewnątrzpochodny, aktywują kaskadę kaspaz, enzymów charakterystycznych dla apoptozy. Jak wspomniano, aktywacja inicjatorowej kaspazy 8 (oraz 10) jest najważniejszym zdarzeniem rozpoczynającym szlak receptorowy, zaś droga mitochondrialna zaczyna się od aktywacji inicjatorowej kaspazy 9. Uważa się, że zjawisko PCD staje się nieodwracalne wraz z aktywacją kaspaz efektorowych: (3, 6, 7). Kaspaza 3 jest najbardziej charakterystycznym enzymem fazy efektorowej apoptozy, degradując białka odpowiedzialne za strukturę i integralność komórki [20]. Istnieje dodatkowa droga, w której limfocyty o czynności cytotoksycznej (T i NK) zabijają komórki docelowe za pomocą perforyny i granzymów (tzw. szlak perforyny/ granzymów). Nosi ona nazwę szlaku pseudoreceptorowego, a ostateczną śmierć komórki indukuje granzym B (GZMB) i niekiedy granzym A (GZMA) [25]. Szlaki: zewnątrz- i wewnątrzpochodny oraz pseudoreceptorowa droga zależna od GZMB, zbiegają się we wspólnej fazie wykonawczej apoptozy, w miejscu aktywacji kaspaz efektorowych, zwłaszcza kaspazy 3. Skutkuje to zmianami morfologicznymi i biochemicznymi, typowymi dla apoptozy. GZMA może inicjować PCD, omijając kaspazę 3 [59]. Zaprogramowana śmierć limfocytów T zachodzi przypuszczalnie pod wpływem wszystkich trzech wyżej wymienionych mechanizmów (ryc. 1). Problem apoptozy limfocytów T wymaga wprowadzenia dwóch ważnych pojęć. Są to: śmierć komórkowa indukowana przez aktywację (activation-induced cell death - AICD) i śmierć z zaniechania (neglect indu- 1376

Przybylski G. i wsp. - Mechanizmy zaprogramowanej śmierci... Ryc. 1. Główne szlaki apoptozy limfocytu. Przyłączenie do receptorów śmierci (TNFR1, FAS, DR4/DR5) ich ligandów (TNF-α, FASL, TRAIL) uruchamia szlak zewnątrzpochodny, dalszymi mediatorami są białka adaptorowe (FADD, TRADD) i kaspaza 8. Szlak wewnątrzpochodny zależy od równowagi pomiędzy białkami podrodziny BCL-2 (działają antyapoptotycznie uszczelniając błony mitochondriów) a białkami podrodziny BAX (rozszczelniają błony). Równowaga ta znajduje się pod kontrolą proapoptycznych białek podrodziny BH3-only, za pomocą których oddziałują induktory apoptozy szlaku mitochondrialnego. Szlak pseudoreceptorowy uruchamiają limfocyty (CTL lub NK), tworząc za pomocą perforyny, PER, kanały w błonie atakowanej komórki. Do wnętrza docierają przez nie granzymy A i B (GZMA, GZMB). Większość dróg indukcji apoptozy, w tym szlak aktywnej kaspazy 8 (zewnątrzpochodny) i kaspazy 9 (wewnątrzpochodny), schodzą się w miejscu aktywacji kaspazy 3 (początek fazy wykonawczej). Granzymy mogą działać niezależnie od kaspazy 3 ced death - NID). AICD jest odmianą szlaku zewnątrzpochodnego i polega na tym, że bodźce receptorowe aktywujące czynność danej komórki paradoksalnie uczulają ją na apoptozę, np. poprzez automatyczną, równoległą indukcję ekspresji błonowych receptorów śmierci [62]. Zjawisko NID jest natomiast odmianą szlaku wewnątrzpochodnego. Wiele komórek (nie tylko limfocytów) dysponuje tu domyślnym, spontanicznym szlakiem samobójczej śmierci, który jest w nich czasowo zablokowany dzięki działaniu obecnych w otoczeniu mediatorów (hormonów, czynników wzrostu, cytokin). Umożliwiają one komórce dalsze życie, najczęściej wskutek podtrzymania aktywności szlaku kinazy fosfatydyloinozytolu 3 (PI3K) oraz kinazy Akt. Ta ostatnia fosforyluje m.in. Bad, ważny proapoptotyczny mediator rodziny BH3-only, który staje się wówczas nieaktywny. I przeciwnie, gdy czynników przeżycia brak lub spada ich biologiczna dostępność, apoptoza zachodzi pod wpływem NID samorzutnie [20]. Apoptoza w procesie selekcji tymocytów Tymocyty są prekursorami limfocytów T, dojrzewającymi czynnościowo (nabywającymi immunokompetencji) w centralnym organie immunologicznym, jakim jest grasica, poprzez stadia selekcji, kolejno beta, pozytywnej i negatywnej. Istotą selekcji jest masywna apoptoza tymocytów. Na obwód przedostają się wyłącznie komórki, które swym receptorem TCR potrafią rozpoznać obcy antygen w kontekście cząsteczek układu MHC. Komórki nietworzące połączeń z własnymi cząsteczkami MHC, a także komórki autoreaktywne są eliminowane [60]. Najlepiej poznano mechanizmy apoptotycznej negatywnej selekcji autoreaktywnych klonów komórek T (delecji klonalnej). Ten fizjologiczny proces zależy od kaspaz efektorowych (3 i 7, przebiega więc kanonicznie ), jednak dokładny mechanizm aktywacji kaspaz nie został precyzyjnie opisany [54]. Główną rolę przypisuje się białkom Bcl-2. Jak wykazano w modelach knock-out 1377

Postepy Hig Med Dosw (online), 2013; tom 67: 1374-1390 u myszy, najważniejsze są: czynnik Bim (podrodziny BH3-only) oraz Bax i Bak (podrodziny Bax). Blokowanie innych białek podrodziny BH3-only (Bad, Bid i Noxa) nie wpływa na przebieg selekcji [92]. Przypuszcza się, iż krytycznym mediatorem jest czynnik Bim, a znaczenie cząsteczek Bax i Bak jest wtórne i polega na modyfikacji siły bodźców proapoptotycznych w mitochondriach. U myszy z niedoborem Bim pojawia się masywna ekspansja obwodowa limfocytów pochodzących z grasicy i cechy autoimmunoagresji [72]. Podobne objawy występują w niedoborze kinazy serynowo-treoninowej (misshapen-nck-interacting kinase), umiejscowionej na szlaku przewodzenia sygnału z receptora TCR tymocytu do aktywnej cząsteczki Bim. O ważnej roli molekuły Bim świadczy też to, że jej niedobór zapobiega negatywnej selekcji skuteczniej, niż transgeniczna nadekspresja przeciwstawnie działających czynników Bcl-2 i Bcl-xL [92]. Jest charakterystyczne, że uruchomienie kaspaz efektorowych w przebiegu negatywnej selekcji prawdopodobnie odbywa się bez udziału drogi receptorowej. Delecja klonalna występuje bowiem także po doświadczalnym zahamowaniu ekspresji czynnika TRAIL, receptorów śmierci Fas, białek adaptorowych FADD i kaspazy 8 [14,67]. Zasadniczy mechanizm delecji klonalnej jest więc bez wątpienia wewnątrzpochodny. Nie jest oczywiste, czy te wnioski można przenieść na dalsze fazy życia komórki T. Przeżycie nieuczulonych antygenowo limfocytów T Limfocyty T, nabywszy immunokompetencji w grasicy, przeżywają na obwodzie przez wiele lat, jako komórki antygenowo dziewicze. Tworzą populację długo żyjących spoczynkowych limfocytów, recyrkulujących między krwią, chłonką i drugorzędowymi narządami limfatycznymi. U zdrowych dorosłych osób wskutek działania mechanizmów homeostatycznych całkowita ich liczba jest w przybliżeniu wielkością stałą, podziały mitotyczne są limitowane i utrzymują się na niezmiennym poziomie. Jest to tzw. proliferacja minimalna (podstawowa) [58]. Za przeżycie antygenowo dziewiczych komórek T odpowiedzialne są przekaźniki obu zasadniczych szlaków PCD, zwykle działające antyapoptotycznie, zwłaszcza interleukina 7 [99]. Przeniesienie naiwnych komórek T do zwierzęcia pozbawionego limfocytów T powoduje ich intensywne podziały. Jest to tzw. proliferacja limfocytów T kierowana przez mechanizmy homeostazy (homeostasis-driven T cell proliferation). Ma na celu wypełnienie istniejących w nowym otoczeniu pustych nisz dla limfocytów [68]. U gospodarza działają wówczas nasilone czynniki przeżycia, a na naiwnych komórkach T pojawiają się przejściowo markery limfocytów efektorowych i/lub pamięci. Komórki T wykazują też częściowo ekspresję genów fazy wykonawczej odpowiedzi immunologicznej [24]. Wzbudzeniu podlegają receptory TCR antygenowo dziewiczych limfocytów, w procesie tym uczestniczą zaś czą- steczki własnych antygenów, prezentowane w restrykcji MHC. Przypuszczalnie zjawisko to przebiega podobnie do fazy pozytywnej selekcji grasiczej. Niezbędna jest obecność IL-7, a przeżycie limfocytów zależy bezpośrednio od aktywacji antyapoptotycznych białek podrodziny Bcl-2 [22,86]. Interleukina 7 jako czynnik przeżycia limfocytów T Interleukina 7 odpowiada przede wszystkim za przeżycie spoczynkowych limfocytów T, zarówno komórek antygenowo dziewiczych, jak i komórek pamięci T [86]. IL-7 hamuje ekspresję własnego receptora, jest więc ekonomicznie zużywana przez współzawodniczące o nią limfocyty [34]. U zwierząt z niedoborem IL-7 przeżycie obwodowych komórek T i pamięć immunologiczna są upośledzone. Przeciwnie, transgeniczna nadekspresja IL-7 prowadzi do wzrostu liczby limfocytów T [24]. W grasicy wrażliwość tymocytów na IL-7 (i ekspresja receptora dla tej interleukiny) jest najwyższa na etapie selekcji beta, a później spada [2,66]. Ponownie receptory w wysokim mianie występują na obwodowych dziewiczych komórkach T (po opuszczeniu grasicy) i znikają z powierzchni komórek efektorowych, by później pojawić się na komórkach wraz z generacją limfocytów pamięci T. Interleukina 7 działa jako czynnik przeżycia szlaku mitochondrialnego apoptozy. Po pierwsze, poprzez kinazy JAK i czynniki transkrypcyjne rodziny STAT-5, aktywuje ekspresję czynnika BCL-2 [42]. Po drugie, podobnie do innych czynników wzrostu, poprzez szlak kinaz PI-3K/ Akt fosforyluje i tym samym dezaktywuje proapoptotyczne białko Bad [98]. Po trzecie, wykorzystując szlak tych kinaz oraz zależnego od nich czynnika transkrypcyjnego FOXO3a, hamuje ekspresję białka Bim [42,73]. Inhibicja genu Bim (lub wprowadzenie transgenu Bcl-2) zapobiega śmierci limfocytów u zwierząt pozbawionych genu receptora IL-7 [62]. Ważną konsekwencją uczulenia komórki T wskutek swoistej stymulacji TCR jest wzrost poboru glukozy i nasilona glikoliza, niezbędne do proliferacji i podjęcia czynności efektorowych. Pod nieobecność tej stymulacji, w dziewiczych antygenowo limfocytach T to właśnie IL-7 zabezpiecza metabolizm spoczynkowy, pobór glukozy (pośrednikiem jest aktywna kinaza Akt) i glikolizę (poprzez STAT-5) [33,93]. Receptor IL-7 (IL-7R) składa się z dwóch podjednostek: łańcucha α (IL-7Rα, CD127, wspólnego ze zrębową limfopoetyną grasiczą) i łańcucha γ (CD122), znanego jako wspólny łańcuch receptorowy gamma (common γ chain receptor), gdyż jest identyczny z podjednostkami receptorów IL-2, -4, -9, -15 i -21 [22]. Wszystkie te interleukiny są ważnymi czynnikami przeżycia limfocytów, co zależy właśnie od obecności na powierzchni komórek tego wspólnego, nieswoistego łańcucha CD122. Natomiast swoiste dla poszczególnych cytokin łańcuchy 1378

Przybylski G. i wsp. - Mechanizmy zaprogramowanej śmierci... receptorowe modyfikują i ukierunkowują ich funkcje. Interleukiny 7 i 15 są prawdopodobnie najważniejszymi czynnikami przeżycia limfocytów T, a krytyczny szlak sygnalizacyjny prowadzi przez wspomniane wyżej czynniki STAT-5 [58]. Charakterystyczne, że dwie inne interleukiny tej grupy, IL-2 i IL-4, działające również poprzez common γ chain receptor, zdefiniowano jako podstawowe czynniki wzrostu odpowiednio komórek Th1 i Th2 [24,62,65]. Podsumowując, IL-7 zapewnia przeżycie limfocytom T, wpływając w sposób złożony na rodzinę białek BCL- 2, w tym na właściwy czynnik Bcl-2 i Mcl-1 (aktywacja) oraz Bim i Bad (hamowanie) [51]. Najważniejsze wydaje się oddziaływanie Bcl-2:Bim. U myszy knock-out Bcl-2 / udaje się odwrócić nasiloną apoptozę antygenowo dziewiczych limfocytów T, jeśli zahamuje się równoległą ekspresję białka Bim [94]. Należy podkreślić, że głównym celem komórkowym IL-7 są te limfocyty, które nie podlegają bieżącej stymulacji ze strony swoistych antygenów (i nie stanowią zasadniczego tematu niniejszej pracy). Tak więc limfocyt T żyje i w razie potrzeby dzieli się, gdyż działa na niego albo nieswoisty czynnik przeżycia, interleukina 7, albo swoista antygenowo ligacja receptora TCR. W tym drugim przypadku w miejsce IL-7, działa IL-2, a sama komórka podejmuje swą zasadniczą rolę biologiczną, czyli walkę z obcym patogenem. Limfocyty T w przebiegu ekspansji i kontrakcji odpowiedzi immunologicznej Piśmiennictwo traktujące o apoptozie efektorowych komórek T u człowieka jest dość ograniczone. Dane pochodzą głównie z: 1) eksperymentów in vitro; 2) badań nad zwierzętami transgenicznymi; 3) doświadczeń, w których poczesne miejsce zajęły modele ostrej infekcji (np. grypy) u gryzoni [62]. Nawet termin AICD wywodzi się z obserwacji doświadczalnych [26]. Istotny postęp w rozumieniu PCD efektorów odpowiedzi immunologicznej dokonał się ostatnio dzięki tetramerom MHC i limfocytom, do których wprowadzono receptory TCR o pożądanej swoistości (np. przeciw antygenom konkretnego wirusa). Umożliwiło to dokładne prześledzenie losów swoistych antygenowo komórek T w modelach zwierzęcych, ale ze względu na różnorodność zaobserwowanych zdarzeń immunologicznych nie zawsze ułatwiło pełne zrozumienie mechanizmów przeżycia i apoptozy tych komórek [52]. Z kolei prowadzone przez nas badania umożliwiły opisanie apoptozy obwodowych limfocytów T w kategoriach ilościowych i morfologicznych, a wnioski dotyczące mechanizmów PCD wyciągano pośrednio, na podstawie analizy statystycznej wielu danych immunocytologicznych i biochemicznych, zwłaszcza zestawionych z parametrami charakteryzującymi samą apoptozę lub podatność na ten proces [46,48]. Obwodowe komórki T dzielą się na dwie podstawowe pule: antygenowo nieuczulone (dziewicze, naiwne, naive) i antygenowo uczulone (primed). Przełomowym zdarzeniem w życiu limfocytu jest rozpoznanie przez receptor TCR swoistego antygenu na komórce prezentującej antygen (antigen presenting cell - APC), na ogół komórce dendrytycznej (dendritic cell - DC). Jak wiadomo, proces ten podlega restrykcji MHC i przeistacza komórkę dziewiczą w antygenowoswoisty, uczulony limfocyt T [62]. Zależna od limfocytów T swoista odpowiedź nabyta (adaptacyjna) na czynniki chorobotwórcze przebiega poprzez fazy rozpoznania antygenu, aktywacji, proliferacji i migracji do miejsc infekcji (tkanek obwodowych), gdzie komórki T zwykle ponownie napotykają na swoiste antygeny prezentowane przez komórki APC, takie jak makrofagi, limfocyty B i zakażone nabłonki. Podlegają tam ponownemu wzbudzeniu (restymulacji i proliferacji) [1]. Ponieważ uczulenie, a także restymulacja swoistymi antygenami wiąże się zwykle z nasilonymi podziałami komórkowymi i gwałtownym wzrostem liczby efektorów T, fazę tę określa się mianem ekspansji. W ostrych zakażeniach opanowanie zagrożenia prowadzi do rezolucji procesu zwykle w ciągu kilku dni ponad 90% efektorowych komórek T ginie w wyniku nasilonej apoptozy. Ta kolejna faza odpowiedzi, kontrakcja, drastycznie zmniejsza liczebność puli antygenowoswoistych, uczulonych komórek T, są już bowiem zbędne [52]. Pozostałe przy życiu limfocyty różnicują się w populację komórek pamięci T [58]. Wyróżnienie poszczególnych faz odpowiedzi adaptacyjnej jest umowne zachodzą one na siebie. Rozróżnienie ekspansji i kontrakcji może być utrudnione choćby w przewlekłych stanach zapalnych [46]. Opisana tu redukcja puli limfocytów T umożliwia odbudowę równowagi homeostatycznej układu odpornościowego, ograniczając zbędne koszty metaboliczne i zapobiegając autoimmunizacji. W przeciwnym przypadku niegroźne infekcje prowadziłyby do limfadenopatii, a przetrwałe aktywne komórki efektorowe T mogłyby powodować choroby z autoimmunoagresji [62]. Co więcej, niedostateczna kontrakcja zagrażałaby w razie ponownego napotkania patogenu burzliwym, groźnym dla życia odczynem zapalnym [6]. Natomiast nadmierna eliminacja efektorowych komórek T może zaburzyć generację skutecznej pamięci immunologicznej [52]. Uczulenie limfocytów T, zachodzące wskutek napotkania swoistego antygenu prezentowanego na powierzchni komórki DC, np. w węźle chłonnym, stanowi krytyczny sygnał aktywacji (sygnał 1). Uzupełnia go sygnalizacja ze strony cząsteczek kostymulujących, obecnych na komórce DC i rozpoznawanych przez komplementarne receptory limfocytu T (sygnał 2, szczegóły podano niżej). Dodatkowo limfocyty stymulowane są przez obecne w mikrośrodowisku cytokiny, np. interleukinę 12 i interferon γ (sterują polaryzacją komórek w stronę Th1) oraz IL-4 i -13 (Th2). Określa się je niekiedy jako sygnał 3; dopełnia on procesu aktywacji limfocytu w przebiegu uczulenia [7,62]. 1379

Postepy Hig Med Dosw (online), 2013; tom 67: 1374-1390 Antygenowo uczulone komórki CD4 + podlegają różnicowaniu w subpopulacje czynnościowe efektorów odpowiedzi immunologicznej (Th1, Th2, Th17) i komórki o funkcjach regulatorowych, wśród których szczególne znaczenie przypisuje się naturalnym limfocytom regulatorowym, ntreg [21,65,84]. Uczulenie komórek CD8 + (niezbędna jest pomocnicza stymulacja ze strony Th1), prowadzi do generacji puli limfocytów cytotoksycznych CTL. Zabijają one zakażone cele komórkowe, a ogólniej rzecz biorąc wszystkie komórki prezentujące na powierzchni antygeny swoiste dla CTL. Posługują się ligandami receptorów śmierci (jak FasL) i opisaną wyżej drogą pseudoreceptorową [25]. Jak zaznaczono wyżej, przedstawiony tu model adaptacyjnej odpowiedzi immunologicznej odzwierciedla wyniki badań doświadczalnych w ostrych zakażeniach, nie zawsze więc umożliwia odpowiednią interpretację zdarzeń immunologicznych w badanych przez nas chorobach śródmiąższowych płuc, zwykle przebiegających przewlekle. Można jednak założyć, że i w tym ostatnim przypadku nakładają się zjawiska miejscowej ekspansji (z przewagą proliferacji i mechanizmów przeżycia) i kontrakcji (równowaga przesuwa się w stronę apoptozy, która staje się z czasem udziałem większości limfocytów T) [46]. Dla dalszych rozważań istotne jest podsumowanie obecnego stanu wiedzy pochodzącego z badań nad przeżyciem/apoptozą obwodowych efektorowych komórek T faz ekspansji i kontrakcji. Przyjmuje się obecność trzech mechanizmów zaprogramowanej śmierci: 1) AICD, 2) NID oraz 3) usunięcia patogenu z otoczenia i następczego braku pobudzenia receptorów TCR [62]. Ostatni z nich stanowi odmianę zjawiska NID, gdyż eliminacja patogenu w naturalny sposób prowadzi do spadku stężeń cytokin prozapalnych, zwykle działających w odniesieniu do limfocytów, takich jak czynniki przeżycia [71]. Cząsteczki kostymulujące w fazie ekspansji. Receptorowe mechanizmy przeżycia efektorowych limfocytów T Sygnał 2, którego istotą jest oddziaływanie cząsteczek kostymulujących dojrzałych komórek DC na limfocyty T, stanowi dla tych drugich jednoczesny czynnik przeżycia i ochrony przed apoptozą. Zasadniczymi molekułami tej grupy są: CD80/86, OX40L, 4-1BBL i CD70. Odpowiadają im ligandy (koreceptory) limfocytu, kolejno: CD28 (alternatywnie CTLA4), OX40, 4-1BB i CD27 [72]. Krytyczna dla przeżycia i proliferacji uczulonych komórek T jest sygnalizacja CD28:CD80(CD86). Następstwem jest zwiększenie sekrecji IL-2 przez limfocyt i wzrost wewnątrzkomórkowej ekspresji Bcl-xL [10]. Ekspresja CD28 na dojrzałych komórkach T ma charakter konstytutywny i hamuje ich apoptozę przez dłuższy czas. Analiza mutacji punktowych wykazała, że za inhibicję apoptozy limfocytów człowieka (ale nie za ich proliferację ani sekrecję IL-2) odpowiada reszta tyrozynowa Y173 cytoplazmatycznej domeny cząsteczki CD28. Domena ta aktywuje Bcl-xL poprzez szlak przewodzenia sygnału kinazy PI-3K [43,70]. Dodatkowo ekspresja CD28 na powierzchni limfocytu hamuje ekspresję liganda Fas. Niedobór CD28 wskutek nadaktywności układu FasL:Fas prowadzi do poważnych zaburzeń rozwoju i czynności efektorowych komórek T [23]. U myszy CD28 /, a także z podwójnym knock-out genów ligandów dla CD28 (CD80 i CD86), upośledzeniu ulega generacja pamięci immunologicznej, a liczba komórek cytotoksycznych wtórnych narządów limfatycznych jest nieprawidłowo niska [29,61]. Cząsteczka OX40 nie wykazuje konstytutywnej ekspresji, lecz pojawia się po 2 dniach od aktywacji komórek T. Działa więc później, niż CD28. OX40 jest ważną molekułą kostymulującą limfocytów CD4 [15]. Aktywuje szlak kinaz PI-3K/Akt z następczą mobilizacją Bcl-2 i Bcl-xL w komórkach pomocniczych T myszy [77]. Brak kostymulacji OX40/OX40L w limfocytach Th zwiększa ich wrażliwość na PCD w fazie kontrakcji i skutkuje zaburzeniami pamięci immunologicznej [16]. I wreszcie molekuła kostymulująca 4-1BB pojawia się na komórkach T CD8 + w 24-48 godzin po uczuleniu. Działa równolegle do czynności OX40. Jak wykazano w warunkach doświadczalnych, ligacja 4-1BB wzbudza czynność antyapoptotycznych cząsteczek Bcl-xL i A1 poprzez aktywną postać czynnika transkrypcyjnego NF-κB [99]. Podsumowując, początkowo uruchamiany jest szlak sygnalizacyjny cząsteczki CD28. Natomiast molekuły OX40 i 4-1BB uczestniczą w późniejszych fazach aktywacji komórek T, przy czym pierwsza z nich jest najważniejsza dla generacji i przeżycia subpopulacji limfocytów Th (efektorów i komórek pamięci), a druga pełni podobną funkcję w odniesieniu do subpopulacji Tc. Drogi przewodzenia sygnałów uruchomione ligacją cząsteczek kostymulujących CD28, OX40 i 4-1BB wzajemnie się wspierają. Modyfikowane są przez kinazy i fosfatazy, przy czym szczególnie ważny jest szlak przeżycia prowadzący przez kinazy PI3K/Akt do głównej grupy regulowanych przez nie czynników antyapoptotycznych, tj. białek podrodziny Bcl-2 [49]. Receptory śmierci w regulacji apoptozy efektorowych limfocytów T W przeciwieństwie do omówionej wyżej znacznej oporności antygenowo dziewiczych limfocytów na PCD, uczulone komórki T, paradoksalnie wskutek mobilizacji receptora TCR przez swoisty antygen, stają się na apoptozę wyjątkowo wrażliwe. Wzrasta podatność komórki na opisany wyżej proces AICD, który w uczulonych komórkach zachodzi szczególnie łatwo, jako efekt ligacji receptorów śmierci. W rzeczywistości możliwe są dwa różne zdarzenia. Po pierwsze, do zaprogramowanej śmierci limfocytu dojść może już wskutek stymulacji antygenowej, jeśli pobu- 1380

Przybylski G. i wsp. - Mechanizmy zaprogramowanej śmierci... dzenie ze strony sygnałów 2 i 3 jest słabe lub gdy na komórkę zadziałają równolegle ligandy śmierci. Właśnie w takich warunkach wywołano doświadczalnie AICD przed laty [52]. To przed tak inicjowaną apoptozą w pierwszej kolejności chronią limfocyt opisane wyżej ligandy cząsteczek kostymulujących, jak np. CD28. Mechanizm AICD zachodzi in vivo, jednak prawdopodobnie przede wszystkim jako skutek restymulacji swoistym antygenem, np. w naciekach limfocytowych śródmiąższu płuc w chorobach dolnych dróg oddechowych. Niezbędne są wówczas dodatkowe warunki, modelujące miejscową wrażliwość komórki. Po pierwsze, należy do nich brak lub upośledzenie kostymulacji ze strony cząsteczek CD80 i CD86 (nieskuteczny sygnał 2 ze strony komórek APC świadczy o względnie niegroźnym charakterze ekspozycji antygenowej, a więc swoiste klony komórek T przestają być potrzebne). Po drugie, uwrażliwienie limfocytu na apoptozę staje się możliwe dzięki zmniejszonej ekspresji inhibitorów szlaku zewnątrzpochodnego, jak cflip [44]. Po trzecie, dochodzi do zahamowania antyapoptotycznych białek Bcl-2 i Bcl-xL, np. na skutek miejscowego spadku dostępności biologicznej IL-2 i innych czynników przeżycia [81]. Jednak to ostatnie zdarzenie jest raczej egzemplifikacją udziału szlaku wewnątrzpochodnego apoptozy i jako takie zostanie omówione niżej. Jak wspomniano, swoista mobilizacja receptora TCR dostarcza silnego sygnału przeżycia, ale i jednocześnie inicjuje serię procesów molekularnych silnie uwrażliwiających komórkę na śmierć w mechanizmie receptorowym. Możliwa jest jednak sytuacja przeciwna: w zależności od molekularnego kontekstu, to ligacja receptora śmierci może dostarczyć limfocytowi paradoksalnie sygnału przeżycia. Alternatywa, przeżycie limfocytu zachodzi bowiem z udziałem tych samych czynników i mechanizmów. Złożoną, dwuznaczną rolę pełni choćby autokrynny czynnik wzrostu komórek T, interleukina 2, a nawet kaspaza 3 [23]. W przypadku AICD złożony jest zwłaszcza udział kaspazy 8. I tak, inhibicja tego enzymu hamuje zależną od aktywacji receptora TCR autokrynną syntezę IL-2 i proliferację komórek T [41]. Prawdopodobnie kaspaza 8, poprzez kinazę IKK, aktywuje czynnik transkrypcyjny NF-κB [87]. Ostateczny skutek biologiczny w postaci śmierci (lub przeżycia) komórki T w procesie AICD wynika więc nie tyle z odmiennych dróg pobudzenia, lecz przypuszczalnie z nałożenia się w swoistej sekwencji czasowej ligacji TCR i receptorów śmierci oraz działania licznych czynników modyfikujących. Cytokiny w regulacji przeżycia i apoptozy efektorowych limfocytów T Opisany wyżej paradoks, zgodnie z którym zachodząca w czasie uczulenia seria zmian czynnościowych i fenotypowych ułatwia w późniejszych fazach zapalenia odesłanie limfocytu na szlak zaprogramowanej śmierci, jest szczególnie dobrze zilustrowana działaniem głównego autokrynnego czynnika wzrostu i przeżycia komórek T, jakim jest interleukina 2 [62]. Jej wydzielanie przez limfocyty jest jednym z pierwszych efektów zjawiska T cell priming. IL-2 działa przez swój receptor (IL-2R), który jednocześnie w wysokim mianie pojawiają się na komórkach T. Konsekwencją jest nasilona proliferacja z powstaniem klonów antygenowoswoistych komórek, szybko różnicujących się w efektory odpowiedzi immunologicznej. A jednak to właśnie IL-2 uwrażliwia komórki Th1 na zjawisko AICD, co objawia się później, w fazie kontrakcji [31]. Między innymi poprzez szlak kinazy Itk (inducible T cell kinase), powoduje ona wzrost ekspresji cząstek liganda Fas na powierzchni komórek T, co ułatwia ich późniejszą śmierć w mechanizmie receptorowym [76,95]. IL-2, synergistycznie z IL-4, uwrażliwia na proces AICD komórki Th2 [90,101]. Jednak najważniejszą grupą białek, modyfikowanych przez IL-2, pozostają czynniki rodziny Bcl-2 (vide niżej). Rola pozostałych cytokin jest przypuszczalnie drugorzędna. Interleukina 7, ważna w komórkach dziewiczych antygenowo, zdaje się nie wywierać istotnego wpływu na fazę kontrakcji limfocytów antygenowo uczulonych [45,57]. Bardziej jednoznaczne są wyniki badań nad IL-15, tj. inną cytokiną przeżycia komórek T. Możliwe, że jej niedobór, poprzez spadek aktywności czynnika STAT-5 odgrywa pewną rolę, np. w kontrakcji swoistych antygenowo komórek CTL [52]. Także badania nad TNF-α dostarczyły rozbieżnych danych, co zależy prawdopodobnie od szlaku, na który w zadanych warunkach oddziałuje ten czynnik. Problem rozwinięto niżej, wypada jednak zaznaczyć, że wzmożona wrażliwość limfocytów T na proces AICD wskutek ligacji TNF-α:TNFR1 nie budzi wątpliwości [55,89]. Z kolei interferon γ (IFN-γ) w myśl niektórych prac doświadczalnych aktywuje apoptozę efektorowych komórek T; inni autorzy jednak tego nie potwierdzają [62]. Także analiza materiału klinicznego w śródmiąższowych chorobach płuc nie wykazała związku między miejscową sekrecją IFN-γ a miejscową apoptozą limfocytów [47]. Interleukina 10, podobnie do IL-2, ma uwrażliwiać komórki T na proces AICD, gdyż wzbudza powierzchniową ekspresję cząsteczek FasL. Pogląd ten jest też dobrze uzasadniony w uznanej roli IL-10, cytokiny działającej silnie immunosupresyjnie. Pobudzone efektory CD4 + wydają się najważniejszym miejscowym źródłem IL-10 w ostrym odczynie zapalnym [9]. Jednak niedawne badania nad przebiegiem infekcji wirusem grypy u gryzoni nie potwierdziły udziału IL-10 w kontrakcji limfocytów Th [62]. Rozważano też udział transformującego czynnika wzrostu-beta (transforming growth factor-β, TGF-β), jako regulatora ekspansji limfocytów, z tym że mechanizm działania tej cytokiny miałby polegać nie na indukcji AICD, lecz hamowaniu Bcl-2. Blokowanie wpływu TGF-β w wyniku doświadczalnej transfekcji limfocytów 1381

Postepy Hig Med Dosw (online), 2013; tom 67: 1374-1390 transgenem kodującym dominującą negatywną postać receptora tej cytokiny, skutkował nasiloną ekspansją efektorów CD8, był to jednak proces przejściowy [79]. Według obserwacji własnych, powierzchniowy marker CD105, koreceptor TGF-β1, występuje znamiennie częściej na limfocytach dróg oddechowych w chorobach, przebiegających ze wzmożoną apoptozą komórek T, np. w idiopatycznym włóknieniu płuc [8]. W zależności od rodzaju polaryzacji pomocniczych limfocytów efektorowych, czynnikiem przeżycia mogą być różne cytokiny. W tabeli 1 zebrano podstawowe dane dotyczące mechanizmu AICD poszczególnych subpopulacji czynnościowych limfocytów CD4 +. W tym miejscu trzeba zaznaczyć, że w przeciwieństwie do wyników uzyskanych w doświadczalnych modelach ostrej infekcji u gryzoni, w badaniach nad śródmiąższowymi chorobami płuc największa oporność limfocytów na apoptozę wystąpiła w chorobach spolaryzowanych w kierunku Th1 (sarkoidoza, zewnątrzpochodne alergiczne zapalenie pęcherzyków płucnych) [46,62]. Niezgodność ta może wynikać z tego, że analizie poddano przewlekłe odczyny zapalne u ludzi. Alternatywnie, rola mechanizmu AICD w indukcji apoptozy limfocytów efektorowych T jest przeszacowana [52]. Krytyka roli mechanizmu AICD w kontrakcji limfocytów efektorowych T. Udział interleukiny 2 w regulacji zjawiska NID Śmierć komórek T wskutek ich aktywacji zaobserwowano wyjściowo w modelu mysich hybryd komórkowych. Spodziewano się wówczas proliferacji uczulonych limfocytów, jako oczywistego efektu stymulacji receptorów TCR, zamiast tego wystąpiła jednak apoptoza. Wprowadzono więc opisany wyżej termin activation-induced cell death [5,83]. Jednocześnie odkryto spontaniczne mutacje genów dla Fas i FasL. W odpowiadających im szczepach myszy lpr (Fas / ) i gld (FasL / ) wystąpiła limfadenopatia i autoimmunizacja [15,16,52]. Notabene ludzkim odpowiednikiem tych zmian jest zespół Canale a i Smitha, [20]. Gdy w kolejnych pracach doświadczalnych in vitro wykazano, że ligacja FasL do jego receptora powodowała zjawisko AICD limfocytów T, sformułowano ogólnie uznany pogląd, że także w warunkach in vivo apoptoza uczulonych komórek T zachodzi w wyniku AICD, a zasadniczym szlakiem inicjującym jest interak- cja FasL:Fas [18,38]. Część prac doświadczalnych prowadzonych w warunkach in vivo nie potwierdziła jednak tej hipotezy. Niezgodne z założeniami były zwłaszcza doświadczenia z modelem ostrej infekcji i jednorazowej ekspozycji antygenowej [64,82]. Przyjmuje się, że znaczenie procesu AICD dla kontrakcji odpowiedzi odpornościowej, przede wszystkim udział systemu FasL:Fas, jest umiarkowane i jeśli już, to dotyczy przewlekłych odczynów zapalnych z powtarzalną ekspozycją antygenową [91]. Jednak i w tym przypadku pojawiają się wątpliwości. Badania nad apoptozą limfocytów T dolnych dróg oddechowych chorych z sarkoidozą, tj. chorobą z nasilonym odczynem limfocytowym śródmiąższu płuc, w patogenezie której zakłada się przewlekłą i/lub powtarzalną ekspozycję chorego na nieznane antygeny, wykluczyły udział AICD w tym procesie. Limfocyty umierają tu pod wpływem NID [30]. Także niedawne nasze badania nad apoptozą komórek efektorowych T w chorobach zapalnych dolnych dróg oddechowych nie wykazały udziału układu FasL:Fas [48]. Nie potwierdzono również znaczenia innego układu ligand:receptor śmierci białka TRAIL i jego receptorów w zjawisku kontrakcji limfocytów [46]. Badacze apoptozy komórek efektorowych T coraz częściej skupiają się na procesie alternatywnym, to jest zaprogramowanej śmierci z zaniechania (NID). Interleukina 2 byłaby tu główną cytokiną regulującą wrażliwość limfocytów na proces apoptozy gdyż, jak wspomniano wyżej, silnie oddziałuje ona na czynniki rodziny Bcl-2. Wykazano in vitro, że transgen Bcl-2 chroni aktywowane komórki T przed zaprogramowaną śmiercią wywołaną deprywacją cytokin, takich jak IL-2. Limfocyty T zwierząt o genotypie Bax / Bak / są oporne na bodźce proapoptotyczne, w tym na niedobór czynników przeżycia [74]. Znaczenie Bax i Bak jest prawdopodobnie wtórne. Obecnie za główny mediator zjawiska NID spośród licznych białek podrodziny BH3-only uważa się czynnik Bim [31]. Szczególnie silnie przeciwstawia mu się właściwe białko Bcl-2. Gwałtowny spadek wewnątrzkomórkowej ekspresji Bcl-2 jest najbardziej uchwytnym zjawiskiem molekularnym obserwowanym w limfocytach efektorowych na krótko przed kontrakcją [52]. Tabela 1. Podatność efektorowych limfocytów Th na apoptozę w zależności od polaryzacji komórek Polaryzacja Th Wg [46,62]. Cytokina różnicująca Krytyczny czynnik transkrypcyjny Główne wydzielane cytokiny Podatność na apoptozę badania doświadczalne Podatność na apoptozę przewlekłe śródmiąższowe choroby płuc Th1 IL-12, IFN-γ T-bet IL-2, IFN-γ, TNF ++++ + Th2 IL-4 GATA-3 IL-4, 5, -13 + +++ Th17 TGF-β, IL-6 ROR-γt IL-17, -21, -22 ++? Treg TGF-β Foxp3 IL-10?? 1382

Przybylski G. i wsp. - Mechanizmy zaprogramowanej śmierci... Udział białek rodziny Bcl-2 w regulacji kontrakcji immunologicznej. Rola czynnika Bim Istnieją dwie, niewykluczające się nawzajem, koncepcje propagacji apoptozy przez czynniki podrodziny BH3-only, odgórnie regulujące szczelność błon mitochondrialnych szlaku wewnątrzpochodnego. W myśl pierwszej z nich białka BH3-only odciągają antyapoptotyczne białka właściwej podrodziny Bcl-2 od cząsteczek Bax i Bak, te z kolei oligomeryzują i inicjują proces PCD (model neutralizacji). Według drugiej koncepcji (model derepresji), czynniki podrodziny Bax są bezpośrednio aktywowane przez molekuły BH3-only, z tym że są wśród nich cząsteczki uczulające, tj. bezpośrednio neutralizujące czynność białek rodziny Bcl-2 (Bad i Noxa) oraz właściwe aktywatory czynników Bax/Bak, jak Bim, Bid i Puma [92]. Oddziaływania są krótkotrwałe, miana aktywnych czynników niskie i nie jest łatwo uchwycić te zdarzenia w badaniach doświadczalnych [46]. Przypuszczalnie białka BH3-only działają w obu wyżej wymienionych mechanizmach [52]. Duża liczba rodzajów cząsteczek tej podrodziny sugeruje ich wielorakie funkcje, złożoną sieć powiązań i odmienną rolę w zależności od fazy i rodzaju odpowiedzi immunologicznej. W zasadzie aktywacja limfocytu T wywołuje spadek stężenia Bcl-2, a wzrost pozostałych cząsteczek podrodziny Bcl-xL, A1 i Mcl-1 [19]. Bcl-xL ma chronić komórki T przed apoptozą w przebiegu infekcji bakteryjnych, Mcl-1 uczestniczy w przeżyciu limfocytów T w warunkach in vitro [100]. Jednak krytyczne wydaje się wzajemne oddziaływanie między czynnikami Bcl-2 i Bim, w drugiej kolejności zaznacza się udział białka Puma [62]. żoną (sarkoidoza), jak i podwyższoną (idiopatyczne włóknienie płuc) apoptozą limfocytów. Neutrofile dolnych dróg oddechowych są uznanym źródłem wolnych rodników. W piśmiennictwie brak jest innego wyjaśnienia dla naszej obserwacji [46]. Wzajemne oddziaływanie Bim na cząsteczkę Bcl-2 jest złożone i wyjątkowe. Podobnych obserwacji nie udało się poczynić dla innych białek grupy BH3-only: Już przed laty wykazano więc, że w limfocytach myszy z niedoborem Bim, stężenie wewnątrzkomórkowe Bcl-2 jest zdecydowanie niższe, jak gdyby ta druga cząsteczka nie była już komórkom w większej liczbie potrzebna [31]. Odwrotnie, limfocyty z wysokim stężeniem Bcl-2, syntetyzują zwiększone ilości białka Bim [52]. Ekspresja Bcl-2 i Bim jest więc zapewne regulowana we wzajemnym mechanizmie zwrotnym, jakkolwiek szczegółów dotąd nie poznano. Pierwotnym sygnałem wzbudzającym ekspresję Bim ludzkich limfocytów jest rekrutacja receptora TCR, działająca przez szlak sygnałowy kinaz JNK i PKC [78]. Uczulone antygenowo komórki T, w których czynnik Bim doświadczalnie zablokowano, stają się oporne na mechanizm NID [73]. Z białkiem Bim współdziałają inne czynniki klasy BH3-only, Puma i Noxa. Aktywacja białka Puma zależy od stresu komórkowego spowodowanego np. działaniem wolnych rodników i uszkodzeniem DNA komórki. Pośrednikiem jest znany supresor cyklu komórkowego, p53 (stąd pochodzi nazwa Puma, vide spis skrótów wyżej). Limfocyt przygotowuje się do takiej sekwencji zdarzeń wcześniej: w indukowanej doświadczalnie fazie ekspansji aktywność Bcl-xL spada; wczesną fazę kontrakcji antygenowoswoistych komórek CD8 + charakteryzuje natomiast wzrost ekspresji białko Noxa [27]. Konsekwencją tych zmian aktywności jest powstanie apoptosomów, indukcja kaspaz efektorowych i śmierć limfocytu (ryc. 2). Bim występuje w trzech izoformach, zależnych od alternatywnego składania genu: BimEL, BimL i Bims. Dla limfocytów typowa jest pierwsza z nich. Jak wspomniano wyżej, promotor Bim zależy od czynnika transkrypcyjnego rodziny FOXO (ściślej od FOXO3a), który przechodzi z cytosolu do jądra komórkowego wyłącznie w postaci defosforylowanej. Dlatego szlak przeżycia, obejmujący Tabela 2. Zestawienie mechanizmów AICD i NID w kontrakcji efektorowych limfocytów T w przebiegu zapalenia AICD NID Wg [4,46,52,62] Szlak Silnym czynnikiem hamującym ekspresję Bcl-2 w limfocytach efektorowych w przebiegu zapalenia jest nadmierne wytwarzanie wolnych rodników tlenowych. Podanie antyoksydantów przedłuża in vitro zależne od Bcl-2 przeżycie komórek T [31]. Z wynikami tymi korespondują obserwacje własne: spośród analizowanych zmiennych cytoimmunologicznych, najsilniej dodatnio z częstością apoptozy limfocytów pęcherzykowych korelowała neutrofilia materiału z płukania oskrzelowo- -pęcherzykowego, co dotyczyło zarówno chorób z obni- zewnątrzpochodny wewnątrzpochodny Zasadniczy mechanizm uczulający swoista antygenowo mobilizacja receptora TCR IL-2 Czynnik inicjujący aktywacja receptorów śmierci (FasL:Fas, TNF-α:TNFR1) Kaspaza efektorowa 8, 10 deprywacja cytokin eliminacja antygenu 9 Główne czynniki regulacji dodatniej FADD Puma Noxa Bim ujemnej cflip PI3K AKT Bcl-xL Bcl-2 Udział w kontrakcji zapalenie przewlekłe zapalenie ostre i przewlekłe 1383

Postepy Hig Med Dosw (online), 2013; tom 67: 1374-1390 Ryc. 2. Regulacja mechanizmu NID w limfocytach człowieka. Głównym zjawiskiem jest interakcja między proapoptotycznym czynnikiem BIM, a antyapoptotycznym białkiem BCL-2. Wspomagające znaczenie mają PUMA i BCL-xL. Cytokinowe czynniki przeżycia i ligacja CD28 hamują apoptozę głównie poprzez szlak PI3K/ AKT. Przyłączenie antygenu do receptora TCR hamuje BIM na szlaku JNK/PKC. Aktywna postać BIM neutralizuje antyapoptotyczne białka podrodziny BCL-2 i umożliwia bezpośrednie otwarcie kanałów mitochondrialnych przez czynniki BAX/BAK. Wolne rodniki tlenowe (ROS, miejscowym źródłem mogą być granulocyty) uszkadzają DNA, co uruchamia zależną od czynnika transkrypcyjnego P53 ekspresję czynnika PUMA. Ze względu na czytelność ryciny ominięto działanie czynnika NF-κB, który wzmaga transkrypcję BCL-2 i BCL-xL, a hamuje BIM. Nie zaznaczono wpływu czynnika transkrypcyjnego Foxo3a na syntezę BIM, gdyż jego udział udowodniono dotąd tylko w naiwnych antygenowo limfocytach T u gryzoni rzeń molekularnych udowodniono tylko dla nieuczulonych limfocytów T. W przypadku komórek efektorowych wykryto tylko zależność wzmożonej ekspresji Bcl-xL od szlaku kinazy Akt (białka Bim nie badano) [35]. Propokolejno ligację opisanego wyżej wspólnego łańcucha receptorowego γ, kinazę PI3K oraz kinazę Akt, hamuje apoptozę limfocytów T (gdyż Akt fosforyluje czynniki FOXO). Należy jednak pamiętać, że taki przebieg zda- 1384

Przybylski G. i wsp. - Mechanizmy zaprogramowanej śmierci... nuje się inne szlaki kontrolujące ekspresję genu Bim na poziomie: a) transkrypcji (poprzez supresor cyklu komórkowego Rb i czynnik transkrypcyjny E2F1); b) translacji (przez cząsteczkę mikro-rna mir-17-92) i c) modyfikacji posttranslacyjnej, gdyż katalizowana przez szlak kinaz aktywowanych mitogenami fosforylacja reszt seryny i treoniny cząsteczki Bim aktywuje tę ostatnią i może uruchamiać apoptozę limfocytów [88]. Działanie czynnika transkrypcyjnego NF-κB W celu zachowania przejrzystości wykładu (tabela 2), rozgraniczono wyraźnie mechanizm AICD od NID. W rzeczywistości jednak oba procesy zachodzą na siebie; na poziomie molekularnym w regulacji apoptozy limfocytów T odbywa się integracja mechanizmów szlaku zewnątrz- i wewnątrzpochodnego. Przykładami są: 1) funkcja czynnika transkrypcyjnego NF-κB oraz 2) efekt mobilizacji receptora typu 1 dla TNF, wskutek przyłączenia jego fizjologicznego liganda, czyli TNF-α. Czynnik NF-κB (ściślej jest to rodzina białek) jest główną cząsteczką regulującą przeżycie komórek T. Jego aktywna postać pojawia się w komórce wskutek ligacji receptora TCR przez antygen. Czynnik wzmaga ekspresję genów odpowiedzi immunologicznej i wzrostu komórek. Jednocześnie przeciwdziała apoptozie, gdyż promuje transkrypcję genów dla Bcl-2 i Bcl-xL. Wpływa więc głównie na drogę wewnątrzpochodną, jednak sam jest inaktywowany przez ligację receptora śmierci Fas, a więc typowe zjawisko szlaku zewnątrzpochodnego [20]. Doświadczalne zahamowanie czynności NF-κB wyzwala serię zdarzeń prowadzących nieuchronnie do śmierci limfocytu: 1) aktywację proapoptotycznego białka Bim; 2) zahamowanie ekspresji Bcl-2 i Bcl-xL; 3) wzrost stężenia wolnych rodników tlenowych oraz 4) ekspresję genu supresora cyklu komórkowego p73, zależnego od białka p53 [4]. Wyjściowo białka rodziny NF-κB blokowane są przez swoisty inhibitor Iκ beta, pełniący swą funkcję w postaci zdefosforylowanej. Dlatego fosforylująca ten inhibitor kinaza IKK, aktywuje czynnik transkrypcyjny NF-κB i hamuje zjawisko PCD. Dodatkowo drogę apoptozy/ przeżycia z udziałem NF-κB regulują izoformy i produkty degradacji czynnika cflip, wspomnianego wyżej inhibitora prokaspazy 8 w obrębie kompleksu DISC. Działają one w komórkach T jak inhibitory apoptozy: produkt degradacji czynnika (p22-flip) aktywuje właśnie kinazę IKK [49]. Czynność białek NF-κB zależy w limfocytach w znacznym stopniu od wzajemnego stosunku prokaspazy 8 i cflip w obrębie kompleksu DISC [40]. Innym ważnym czynnikiem modulującym szlak TCR/ NF-κB jest kinaza HPK1. Dziewicze antygenowo komórki T, oporne na zjawisko AICD, dysponują izoformą kinazy o pełnej długości łańcucha peptydowego. Swoista aktywacja TCR, m.in. pośrednio poprzez działanie IL-2 oraz IL-4, prowadzi do generacji krótszych izoform końcowych fragmentów C i N (HPK1-C, HPK1-N), wykazu- jących odmienną aktywność substratową: podczas gdy wyjściowa cząsteczka HPK1 łączy się i aktywuje kinazę IKK, to krótkie izoformy tylko blokują tę ostatnią [11]. Tak więc i w tym przypadku uczulenie antygenowe limfocytu T (z wyjściowo wysokim poziomem aktywnego czynnika NF-κB) prowadzi równolegle do pojawienia się w komórce wybitnej wrażliwości na apoptozę. Rola czynnika martwicy nowotworu-α (TNF-α) i jego receptorów. Apoptoza czy nekroptoza? W badaniach własnych [46] czułość komórek na proapoptotyczne własności TNF-α oceniono badając ekspresję jego receptorów. W chorobach z mniejszą częstością apoptozy pojawiła się relatywnie niższa ekspresja receptora śmierci TNFR1, szczególnie wyraźnie tendencja ta zarysowała się, gdy zestawiono wyniki ekspresji receptorów TNF-α na AL jako stosunek CD120b + :CD120a +. W piśmiennictwie przyjmuje się, że TNFR1 (CD120a) jest receptorem śmierci, zaś TNFR2 (CD120b), niemając domeny śmierci, mediuje sygnał przeżycia. Receptory TNF typu 1 występują głównie na komórkach nabłonka, stanowiących ważny cel nadzoru układu immunologicznego, zaś komórki obwodowe T, w tym limfocyty pęcherzykowe, wykazują głównie ekspresję receptorów typu 2 i wykorzystują TNF-α, jako czynnik przeżycia [15]. Rola receptorów TNF jest jednak bardziej złożona. W warunkach prawidłowych skutkiem rekrutacji receptora śmierci TNFR1 jest zwykle aktywacja czynnika transkrypcyjnego NF-κB. Dopiero, gdy ekspresja tego ostatniego zostanie zahamowana, wówczas ligacja TNFR1 indukuje apoptozę [17]. Przyłączenie TNF-α do TNFR1 prowadzi bowiem do utworzenia dwóch odmiennych kompleksów białkowych o różnym czasie powstania. Kompleks typu I formuje się na cytoplazmatycznym końcu białka TNFR1 krótko po przyłączeniu TNF-α. Obejmuje czynnik TRADD, białka adaptorowe TRAF1 i TRAF2, kinazę RIP1 (receptor interacting protein 1) i komórkowy inhibitor apoptozy, IAP. Kompleks aktywuje czynnik transkrypcyjny NF-κB z wszystkimi opisanymi wyżej konsekwencjami, sprzyja więc przeżyciu komórki [46,69]. Kompleks typu II formuje się w kilka godzin po uruchomieniu sygnalizacji TNF-α. W przeciwieństwie do kompleksu I, jego powstanie toruje drogę śmierci komórki. Składowymi są TRADD, RIP1, a następnie (co decyduje o roli TNFR1 w indukcji apoptozy), białko adaptorowe FADD i kaspaza 8 (10). Działania czynnika RIP1 nie poznano do końca: może on uczestniczyć w aktywacji czynnika NF-κB, ale i w formowaniu kompleksu typu II. Jest wówczas aktywatorem (wspólnie z FADD) i zarazem substratem kaspazy 8. Produkty tej ostatniej reakcji powodują kompetycyjną inhibicję NF-κB. Czynność kinazy RIP1 zależy od poziomu ubikwitynacji jej cząsteczki: komórki wykazujące ekspresję postaci RIP1 opornej na ubikwitynację odpowiadają na działanie TNF-α apoptozą [69]. Aktywacja (autofosforylacja) kinazy RIP1 może torować drogę zaprogramowanej śmierci komórki 1385