Powszechnie uznaje się, że astma jest chorobą, której wielu chorych jest nieświadomych, a ci ze zdiagnozowaną astmą nie zawsze objęci są

Transkrypt

1 Warszawa, dr hab. Marta Mendel Zakład Farmakologii i Toksykologii Wydział Medycyny Weterynaryjnej Szkoła Główna Gospodarstwa Wiejskiego w Warszawie RECENZJA rozprawy doktorskiej mgr IZABELI GREGORCZYK pt. Wpływ hamowania jądrowego czynnika transkrypcyjnego κb oraz blokady interakcji RANK/RANK-L na wybrane komórki immunokompetentne w przebiegu doświadczalnej astmy alergicznej u myszy Przedstawiona do recenzji praca doktorska została wykonana w Katedrze Farmakologii i Toksykologii Wydziału Medycyny Weterynaryjnej Uniwersytetu Warmińsko-Mazurskiego w Olsztynie, pod kierunkiem promotora dr hab. Tomasza Maślanki, prof. UWM oraz promotora pomocniczego dr n. wet. Huberta Ziółkowskiego. Podstawą formalną przygotowania recenzji jest Uchwała Rady Wydziału Medycyny Weterynaryjnej Uniwersytetu Warmińsko- Mazurskiego w Olsztynie z dania 26 czerwca 2019 oraz pismo Dziekana Wydziału Medycyny Weterynaryjnej Uniwersytetu Warmińsko-Mazurskiego prof. dr hab. Bogdana Lewczuka dnia 16 lipca Astma jest jedną z najważniejszych chorób niezakaźnych o przewlekłym przebiegu z nawracającymi atakami kaszlu, duszności i świszczącego oddechu, których nasilenie i częstotliwość są różne u poszczególnych pacjentów. Podczas ataków astmatycznych dochodzi do obrzęku nabłonka w drzewie oskrzelowym, co znacząco zwęża światło oskrzelików i hamuje przepływ powietrza do i z płuc. Nawracające objawy astmy mogą powodować zaburzenia snu, aż do bezsenności, uczucie zmęczenia w ciągu dnia, zmniejszoną wydolność fizyczną, a także zwiększać absencję uczniów w szkole, a pracowników w miejscu pracy. Pomimo dużej uciążliwości dla chorego, astma cechuje się stosunkowo małą śmiertelnością w porównaniu do innych chorób o przebiegu przewlekłym. Według danych Światowej Organizacji Zdrowia (WHO) około 235 milionów ludzi cierpi z powodu objawów astmy. Choroba ta jest jednocześnie najczęściej występującą chorobą niezakaźną pośród dzieci, a przyczyną śmierci głównie u osób starszych. Jej występowanie jest niezależne od poziomu rozwoju kraju, ale liczba zgonów pacjentów z astmą jest zdecydowanie wyższa u mieszkańców krajów o średnich i niskich dochodach. 1

2 Powszechnie uznaje się, że astma jest chorobą, której wielu chorych jest nieświadomych, a ci ze zdiagnozowaną astmą nie zawsze objęci są wystarczającą opieką medyczną i leczeniem. Podstawą postępowania terapeutycznego u pacjentów z astmą jest przyjmowanie wziewnych steroidowych leków przeciwzapalnych, czyli glikokortykosteroidów (GKS), które znoszą lub ograniczają nasilenie ostrych objawów ataku astmatycznego oraz spowalniają dalszy rozwój choroby. Szacuje się, że u około 10% pacjentów podawanie GKS nie przynosi zadawalających efektów terapeutycznych, a ponadto długotrwałe podawanie leków z tej grupy wiąże się z ryzykiem wystąpienia działań niepożądanych takich jak zapalenie gardła i krtani, czy infekcje grzybicze górnych dróg oddechowych. W tym kontekście przedstawiona do recenzji rozpraw doktorska mgr Izabeli Gregorczyk wpisuje się w światowy trend poszukiwania nowych, skutecznych celów terapeutycznych w astmie alergicznej, które stanowiłyby alternatywę dla standardowo podawanych steroidowych leków przeciwzapalnych. Należy zatem stwierdzić, że podjęta tematyka wychodzi naprzeciw współczesnym oczekiwaniom, a badania jej poświęcone są w pełni uzasadnione. Rozprawa doktorska przedstawiona przez mgr Izabelę Gregorczyk stanowi 168-stronicową monografię, w tym streszczenie w języku polskim i angielskim, wykaz piśmiennictwa, skrótów, rycin oraz tabel. Wykaz piśmiennictwa obejmuje imponującą liczbę 253 pozycji, w dużej mierze z lat (ok. 40 % wszystkich pozycji), co dowodzi rzetelności Doktorantki w śledzeniu najnowszej literatury i pozwoliło na konfrontację własnych wyników z aktualnymi spostrzeżeniami innych zespołów. Ponadto treści przedstawione w manuskrypcie zostały zobrazowane na 30 rycinach i w 4 tabelach. W dysertacji generalnie posłużono się terminem figura, choć wkradły się także odniesienia przywołujące termin rycina (np. str. 68), a dla niektórych z nich (Fig. 1 & 2) brakuje również odniesienia w treści manuskryptu. Przedstawiona do oceny praca ma typowy dla tego typu opracowań układ monograficzny. W liczącym 28 stron Wstępie mgr Izabela Gregorczyk w niezwykle dokładny i wnikliwy sposób przedstawiła ogólną charakterystykę astmy oskrzelowej oraz szczegółowy opis komórek zaangażowanych w patogenezę tej choroby, a także charakterystykę celów terapeutycznych, którym poświęcone zostały badania. Charakteryzując komórki regulatorowe z populacji limfocytów T CD4 + i związane z nimi cytokiny (podrozdział 1.2.5) Doktorantka przybliża rolę i aktywność IL-10 oraz TGF-ß, brakuje natomiast opisu funkcji IL-35, tj. głównej cytokiny produkowanej przez Tr35. Istotną część tego rozdziału stanowi także uzasadnienie podjętych badań oraz przedstawienie głównych hipotez badawczych. W tym miejscu chciałabym podkreślić, że uważam za odważne i godne pochwały podjęcie decyzji o weryfikacji mechanizmu odpowiedzialnego za przeciwastmatyczne działanie blokady kinazy 2

3 inhibitora jądrowego czynnika transkrypcyjnego κb (IKK) i translokacji jądrowego czynnika transkrypcyjnego κb (NF-κB) do jądra komórkowego, który polegać miałby na indukcji rekrutacji komórek ntreg do węzłów chłonnych śródpiersiowych (MLN) i/lub płuc, bądź indukcji lokalnego generowania komórek itreg. Opierając się na danych uzyskanych w doświadczeniach na szczurzym modelu ciężkiego nadciśnienia płucnego oraz na mysim modelu reumatoidalnego zapalenia stawów, logicznym wydawało się podjęcie badań oceniających wspomniany mechanizm. Słuszności o podjęciu tego zagadnienia badawczego nie umniejsza fakt, że zaproponowana hipoteza została ostatecznie odrzucona na podstawie otrzymanych wyników. Podobnie interesującym i odważnym wydaje mi się pomysł sprawdzenia czy mechanizmy przedstawione w opisanych hipotezach badawczych leżą u podstaw przeciwastmatycznego działania związanego z blokadą interakcji RANK/RANK-L pomimo braku danych o udziale osi OPG/RANK/RANK-L w patogenezie astmy alergicznej w czasie inicjacji badań. Przyznaję, że cele oraz hipotezy ogólne i szczegółowe zaplanowanych badań zostały przedstawione bardzo szczegółowo i konsekwentnie, choć wydaje się, że wyodrębnienie rozdziału poświęconego celom pracy wpłynęłoby korzystnie na przejrzystość całości dysertacji. W rozdziale Materiały i Metody Doktorantka zawarła szczegółowy i klarowny opis układu grup eksperymentalnych oraz przebieg doświadczeń in vivo, a także przedstawiła dokładny schemat badań, którym poddawane były tkanki i płyny ustrojowe pozyskiwane od zwierząt, w tym analizie histopatologicznej, izolacji i znakowaniu poszczególnych subpopulacji komórek oraz ich analizie cytometrycznej. Bardzo przydatne i porządkujące są tabele przedstawiające układ grup kontrolnych i eksperymentalnych, dawki oraz objętości badanych substancji i ich rozpuszczalników oraz metyloprednizolonu, a także figura ilustrująca przebieg eksperymentów. Za prawidłowe uważam kompleksowe dobranie aż trzech grup kontrolnych, tj. uwzględnienie w eksperymencie grupy myszy nieimmunizowanych, grupy myszy z modelem astmy alergicznej, u których nie stosowano badanych substancji oraz grupy myszy uczulananych i otrzymujących standardowo wykorzystywany lek w terapii astmy alergicznej. Dla przejrzystości pracy lepiej byłoby, gdyby omawiany rozdział rozpoczynał się na nowej stronie. Najobszerniejszą część dysertacji stanowi rozdział Wyniki. Na 40 stronach Doktorantka metodycznie przedstawia uzyskane dane, ilustrując je 26 figurami. W pierwszej części rozdziału zawarte zostały wyniki badania histopatologicznego płuc oraz składu leukocytarnego popłuczyn oskrzelowo-pęcherzykowych, które potwierdziły zdolność BMS (BMS ), DHMEQ (dehydroksymetyloepoksychinomycyny) i OPG (osteoprotegeryny), a więc 3

4 odpowiednio kinazy inhibitora NF-ĸB, inhibitora translokacji NF-κB do jądra komórkowego oraz antagonisty RANK-L do zapobiegania alergicznemu zapaleniu dolnych dróg oddechowych wywołanego immunizacją, a także do przeciwdziałania indukowanego immunizacją zwiększeniu liczebności eozynofilów, neutrofilów oraz limfocytów w BALF. Wyniki te, obok przesłanek literaturowych, z pewnością stanowiły dla Doktorantki potwierdzenie słuszności założeń pracy. Druga część tego rozdziału poświęcona została przedstawieniu wyników odnoszących się do wpływu badanych substancji na liczebność komórek dendrytycznych oraz poszczególnych subpopulacji limfocytów T CD4 + i CD8 +. W kolejnej części rozdziału opisane zostały wyniki odnoszące się do wpływu badanych substancji na limfocyty T CD4 + w zakresie ich proliferacji w płucach. W ostatnim podrozdziale tej części dysertacji przedstawione zostały dane dotyczące wpływu badanych substancji na limfocyty T CD + i CD8 + w zakresie produkcji przez nie cytokin: IL-4, IL-10, IL-17 oraz TGF-β w MLN i płucach. Odnośnie tej części rozdziału Wyniki należy podkreślić, że słusznym i godnym pochwały założeniem metodycznym okazała się analiza zarówno odsetka jak i bezwzględnej liczby poszczególnych subpopulacji komórek w MLN i płucach. Takie podejście pozwoliło Doktorantce wielokrotnie na szczegółową konfrontację uzyskanych wyników z danymi innych autorów oraz na pogłębienie dyskusji w kontekście poszczególnych mechanizmów wzbudzanych i/lub hamowanych podczas testowania blokady przyjętych celów terapeutycznych. Z obowiązku recenzenta muszę jednak zwrócić uwagę na skłonność Autorki dysertacji do opisywania wyników jako wyraźne w sytuacji, gdy nie mają one uzasadnienia w analizie statystycznej (np. rozdział 3.1.2). Podobne drobne błędy wkradły się podczas dyskutowania uzyskanych wyników w kolejnym rozdziale. W obszernej Dyskusji zaprezentowanej na 30 stronach Doktorantka omówiła znaczenie otrzymanych wyników w kontekście oceny wpływu hamowania NF-κB- za pośrednictwem blokady IKK lub jego translokacji do jądra komórkowego i blokady interakcji RANK/RANK- L na rozwój astmy alergicznej w modelu mysim oraz mechanizmów odpowiadających za obserwowane efekty. W drobiazgowy sposób Doktorantka porównała skuteczność blokady wytypowanych celów terapeutycznych ze sobą oraz ze standardowym lekiem w odniesieniu do hamowania rozwoju modelu choroby i towarzyszącej mu odpowiedzi immunologicznej. Doskonała znajomość literatury i sprawne poruszanie się w tematyce mechanizmów fizjologicznych/patofizjologicznych zaangażowanych w rozwój astmy oskrzelowej, pozwoliły Autorce na przedstawienie bardzo ciekawej i dojrzałej dyskusji uzyskanych wyników. Niejednokrotnie Doktorantka podjęła się konfrontacji otrzymanych danych z dwuznacznymi obserwacjami innych badaczy (np. dotyczącymi indukcji rekrutacji komórek ntreg do MLN 4

5 i/lub płuc, bądź indukcji lokalnego generowania komórek Treg, a więc itreg, czy też roli limfocytów T CD8 + w patogenezie astmy alergicznej). Natomiast nieco zaskakujące i chyba przesadne jest drobiazgowe tłumaczenie oryginalności koncepcji podjętych badań w kontekście ich podobieństwa do prac opublikowanych w Allergologia et Immunopathologia przez Yang i współpracowników na początku bieżącego roku. Prowadzenie badań (i publikowanie wyników) przez różne zespoły jest dowodem poruszania istotnych w medycynie problemów i wpisywaniem się w ogólnoświatowe trendy w nauce. Ponadto dowodzi to istotności podjętej tematyki, a porównanie wyników badań własnych z obserwacjami innych zespołów uwiarygadnia otrzymane dane i podnosi ich wartość. Ponadto należy stwierdzić, że wszystkie wyznaczone cele pracy zostały zrealizowane, a sformułowane hipotezy badawcze zweryfikowane. Najważniejszymi osiągnięciami pracy jest potwierdzenie przypuszczenia, że blokada oddziaływania między RANK a RANK-L zapobiega rozwojowi modelu astmy alergicznej. Niemniej istotnym jest spostrzeżenie, że zahamowanie aktywacji NF-κB poprzez blokadę IKK lub translokacji tego czynnika do jądra komórkowego oraz blokada interakcji RANK/RANK-L dają porównywalny efekt przeciwastmatyczny w przebiegu modelu astmy alergicznej, który jest co najmniej równy lub nawet przewyższający efekt standardowo stosowanego glikokortykosteroidu. Ogólnie otrzymane wyniki pozwoliły Doktorantce na sformułowanie siedmiu precyzyjnych wniosków końcowych. Warto również podkreślić potencjalnie aplikacyjny charakter uzyskanych wyników, które stanowią mocne przesłanki do rozpoczęcia klinicznych prac nad opracowaniem antagonisty RANK-L do podawania wziewnego i jego przetestowanie w warunkach doświadczalnej astmy alergicznej. Z pozycji recenzenta, którego zadaniem jest dokładna i krytyczna analiza przedstawionych wyników i ich szczegółowego omówienia, dwa spostrzeżenia/pytania wydają się uzasadnione: Skoro siła oddziaływania poszczególnych związków na niektóre analizowane parametry astmy oskrzelowej indukowanej OVA była różna (np. [1] tylko blokada IKK przez BMS (oraz MP) skutecznie zapobiegała wzrostowi liczebności CD103 + cdc w MLN; [2] z kolei tylko blokada translokacji NF-κB do jądra komórkowego zapobiegała wzrostowi odsetka limfocytów T CD8 + produkujących IL-10; [3] czy też zahamowanie translokacji NF-κB oraz blokada interakcji RANK/RANK-L wykazują hamujący wpływ na produkcję IL-4, IL-10 i IL-17 poprzez komórki CD4 + Teff), czy sensowne byłyby badania kombinacji badanych związków w celu poszukiwania działania synergistycznego? Zastosowanie badanych związków oraz leku standardowo stosowanego w leczeniu astmy alergicznej od 19. do 25. dnia eksperymentu hamowało lub przynajmniej 5

6