- rozpoznanie - dojrzewanie - transport - inicjację - dojrzewanie - aktywację Analiza promotorów genów Marcin Łukaszewicz, Jan Szopa* Instytut Genetyki i Mikrobiologii, *Instytut Biochemii i Biologii Molekularnej Uniwersytetu Wrocławskiego, ul. Przybyszewskiego 63/77, 51-148 Wrocław; * e-mail:szopa@ibmb. uni. wroc.pl Streszczenie. Aktualnie tworzone organizmy transgeniczne charakteryzują się między innymi wysokim stopniem specjalizacji. Wprowadza się pojedyncze lub wielogenowe konstrukty w celu precyzyjnej regulacji krytycznej reakcji lub całego szlaku metabolicznego. Stopień specjalizacji konstruktu, a tym samym i organizmu transgenicznego, zwiększa się przez zastosowanie coraz lepiej poznawanych cis-regulatorowych sekwencji genów. Zatem regulacja poszczególnego zmienianego szlaku jest precyzyjna nie tylko co do określonej reakcji, ale również kontrolowana odnośnie do czasu i miejsca jej zajścia. Tekst zamieszczony w rozdziale opisuje wieloaspektowy charakter izolacji oraz badania, jak również zastosowania promotora jako sekwencji regulatorowej genu. Obok odsyłaczy do wielu baz danych, w których można uzyskać informacje o charakterystyce dowolnej sekwencji, w rozdziale zamieszczono dane pochodzące z badań własnych, które weryfikują eksperymentalnie wyniki poszukiwań in silico. Słowa kluczowe: geny reporterowe, organizmy transgeniczne, promotor genu Wstęp Regulacja ekspresji genów jest bardzo skomplikowaną siecią oddziaływań. Otrzymanie kodowanego przez gen aktywnego białka mogącego oddziaływać na procesy metaboliczne jest procesem wieloetapowym, obejmującym: przez czynniki transkrypcyjne (TF) promotora i regulacją transkrypcji genu, RNA (wycinanie intronów, tworzenie czapeczki, poliadenylacjo), mrna z jądra do cytoplazmy, translacji, translację i degradację mrna, i transport białka do odpowiednich kompartmentów, i dezaktywację białka, degradację białka. Wszystkie te etapy podlegają precyzyjnej regulacji. Ponieważ każdy kolejny etap zależy od poprzedniego, kluczowym elementem jest rozpoczęcie procesu w ogóle, czyli transkrypcja. Kolejne etapy wpływają na precyzję regulacji, mogą 69
- CAAT Analiza promotorów genów su. Badania eksperymentalne sugerują, że najważniejsze elementy rozpoznawane przez czynniki transkrypcyjne, wpływające na ekspresję danego genu, znajdują się najczęściej w regionie od 500 do 2000 par zasad poprzedzających miejsce inicjacji transkrypcji. W jaki sposób czynniki transkrypcyjne rozpoznają promotor, a polimeraza początek i kierunek transkrypcji? Przy końcu 3' promotora odpowiedzialnego za transkrypcję (blisko początku transkrypcji) znajdują się sekwencje rozpoznawane przez kompleks polimerazy RNA II. Analiza sekwencji i zgromadzone dane eksperymentalne pozwoliły na opracowanie tablic częstości występowania jednego z czterech nukleotydów w obrębie konserwowanych sekwencji, na przykład w TATA box (tabela 1). Do takich konserwowanych sekwencji zaliczamy (tabela 2): box. Sekwencja znajdująca się około -80 nt od początku transkryptu (+1). Odpowiedzialna za wydajność transkrypcji i jej orientację, u roślin występuje jako AGGA box, Tabela 1. TATA-box HMM na podstawie 134 sekwencji niepowiązanych promotorów roślinnych http://www.epd.isb-sib.ch/promoter elements/: Pozycja 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 % A 31,6 16,3 0 90,8 0 0 94,9 57,1 100,0 27,6 69,4 11,2 24,5 2,, %C 24,5 60,2 3, 0 2, 1 0, 0 0, 0 0, 0 0, 0 0, 0 3, 1 39,8 52,0 % G 15,3 10,2 0, 0 2, 0 1, 0 0, 0 0,0 0,0 2, 0 13,3 37,8 21,4 % T 28,6 13,3 94,9 5, 1 99,0 5, 1 42,9 0, 0 70,4 14,3 11,2 2, 1 Konsensus T A T A W A W A Tabela 2. Konserwowane elementy w obrębie promotora Motyw CAAT box TATA box GC box CAP (czapeczka) Sekwencja (konsensus) GGCCAATCT TATAA GGGCGG TAC 71
- ; Analiza promotorów genów Otrzymane cdna można wyznakować, np. radioaktywnie, a następnie metodą hybrydyzacji z biblioteki genomowej wyłowić klon zawierający sekwencję promotora. Celem potwierdzenia, że fragment genomowy rzeczywiście odpowiada sekwencji cdna, poddaje się go reakcji sekwencjonowania, po czym można klonować promotor i zająć się jego analizą. Najprostszy sposób izolacji promotora genu, gdy znana jest sekwencja cdna, polega na wykorzystaniu techniki nazywanej RACE (Rapid Amplification of cdna Ends) do powielenia szukanego fragmentu przy użyciu PCR z jednym swoistym primerem i drugim homopolimerowym. Sekwencję genomową, używaną dalej jako matrycę, przygotowuje się przez wytrawienie DNA restryktazą Sau3AI do wielkości około 20 kpz, a następnie wyposażeniu końców fragmentów w homopolimer (oligo dc lub dt) w standardowej reakcji z terminalną transferazą. Tak przygotowany DNA genomowy używa się jako matrycę do namnożenia interesującego fragmentu, stosując swoisty primer, będący sekwencją komplementarną do końca 5 ' cdna i drugi primer, którym jest homopolimer komplementarny do końca cząsteczki DNA genomowego (oligo dg lub da). Alternatywą do takiego przygotowania matrycy z adaptorem homopolimerowym jest DNA wytrawiony dowolnym enzymem restrykcyjnym, dającym odcinki o długości 20-30 kpz, lub fragmentowany do podobnej wielkości mechanicznie i użycie do PCR primera nieswoistego (komercyjny 6-10 nukleotydów) o przypadkowej sekwencji. Drugim primerem jest sekwencja swoista dla cdna. Sau3AI Sau3AI Sau3AI Sau3AI ÿ ÿ ORF ÿ ÿ Fragmetacja genomowego DNA enzymami Ligacja homopolimerów Nested PCR Weryfikacja produktów na żelu i poprzez hybrydyzację Rys. 2. Klonowanie promotora techniką RACE RACE (Rapid Amplification of cdna Ends) to metoda pozwalająca powielić na matrycy fragmentów genowego DNA sekwencje poza końcami znanej ORF (ang. open reading frame, otwartej ramki odczytu), wcześniej klonowanej np. w cdna. Po fragmentacji genomowego DNA restryktazą np. Sau3 Al przy użyciu ligazy przyłączane są do końców homopolimery (oligo dc lub dt). Tak przygotowane fragmenty służą jako matryca do PCR, w którym używa się jednego primera komplementarnego dla homopolimeru, a drugiego komplementa rnego do ORF badanego genu. 73
M. Łukaszewicz, J. Szopa Namnożony fragment przed przystąpieniem do sekwencjonowania należy zweryfikować przez hybrydyzację ze znakowanym cdna. Wielkość uzyskiwanych fragmentów promotorów waha się od 600 do 1000 nukleotydów dla matrycy z adaptorem homopolimerowym i od 400 do 600 nukleotydów, gdy jest nim przypadkowa sekwencja 6-10-nukleotydowa. Jeżeli sekwencja promotora jest już znana (np. zsekwencjonowano cały genom badanego organizmu), można go sklonować metodą PCR na matrycy wyizolowanego DNA genomowego. Ze względu na różną jakość izolowanego DNA genomowego modyfikacje typu metylacja lub nadmierna obecność metabolitów takich jak skrobia, kwasy fenolowe i inne, czasami bardzo trudno jest powielić poszukiwany promotor. Warto więc wziąć pod uwagę przeszukanie dostępnych i licznych banków klonów. Jeszcze inną metodą jest zamówienie syntezy sekwencji, którą zamierzamy badać. W najbliższym czasie najprawdopodobniej będzie to najczęstsza metoda, ze względu na szybki spadek cen związany z postępem technologicznym w zakresie syntezy polinukleotydów o dowolnej długości (obecnie około l$/nt). Przed rozpoczęciem badań danego promotora warto przeanalizować dokładniej jego sekwencję. Warunki, w jakich promotor ulega ekspresji, zależą bowiem od czynników transkrypcyjnych, rozpoznających specyficzne sekwencje, które zostały wcześniej scharakteryzowane. Jak znaleźć sekwencje rozpoznawane przez czynnik transkrypcyjny? W jądrze komórkowym DNA jest dość gęsto upakowane, tworząc struktury wyższego rzędu, które utrudniają dostęp do sekwencji rozpoznawanych przez czynnik transkrypcyjny (TF). Do dzisiaj nie wiadomo, w jaki sposób czynniki transkrypcyjne tak szybko znajdują w całym genomie sekwencję docelową. Przypuszcza się, że transkrybowane geny znajdują się w pobliżu porów jądrowych, czyli miejsca wnikania TF z cytozolu do jądra komórkowego. Wiadomo, że w zależności od lokalizacji genu w obrębie chromosomu poziom transkrypcji może się znacznie różnić. Różnice w poziomie ekspresji genu w zależności od jego lokalizacji można zaobserwować, analizując niezależnie transformowane tym samym konstruktem linie roślin transgenicznych. W wyniku transformacji roślin powszechnie stosowanymi metodami (transformacja przy użyciu Agrobacterium, transformacja biolistyczna, elektroporacja) wprowadzana sekwencja integruje się z genomem w sposób najprawdopodobniej przypadkowy. Otrzymane transformanty, które zawierają jedną kopię tego samego transgenu, zwykle znacznie różnią się poziomem ekspresji badanego białka. W związku z tym, badając promotory 74
Analiza promotorów genów w transformowanych roślinach, należy użyć do ich analizy kilku niezależnych linii transformantów. Czynniki transkrypcyjne regulujące aktywność promotora rozpoznają swoiście określone sekwencje. Istnieje kilka metod poszukiwania miejsc wiązania czynników trankrypcyjnych. Miejsce wiązania nawet nieznanych czynników transkrypcyjnych w obrębie badanego genu można ustalić przy pomocy metody określanej jako footprinting. Metoda ta polega na radioaktywnym wyznakowaniu badanego DNA, związaniu czynnika transkrypcyjnego, częściowym trawieniu nieswoistą DNazą I lub fragmentacji DNA w reakcji wolnorodnikowej i rozdziale na denaturującym żelu poliakrylamidowym powstałych fragmentów kwasu nukleinowego. W wyniku trawienia badana cząsteczka DNA jest przecięta w każdym możliwym miejscu oprócz tych chronionych przez oddziałujące białko, co prowadzi do powstania fragmentów o różnej długości, widocznych na żelu rozdzielającym w postaci prążków. Porównanie wzoru prążków próby kontrolnej (bez związanych czynników transkrypcyjnych) do wzoru prążków próby badanej pozwala dokładnie określić miejsce związania czynnika transkrypcyjnego, który chroni cząsteczkę DNA przed DNazą. Na żelu uwidocznione jest to jako miejsce, w którym nie ma prążków. Inną metodą jest gel shift. Wykorzystuje ona różnice w prędkości migracji w żelu niedenaturującym wolnej cząsteczki DNA i cząsteczki DNA w połączeniu z białkiem. Metoda ta nie pozwala na zlokalizowanie miejsca wiązania, można jednak za jej pomocą przetestować wiele różnych krótkich sekwencji, co pozwala precyzyjnie zidentyfikować miejsca wiązania TF do DNA. Dysponując oczyszczonym czynnikiem transkrypcyjnym można w dość prosty sposób poznać całą gamę rozpoznawanych przez niego sekwencji, stosując metodę SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment). W pierwszym etapie syntetyzuje się całą kolekcję różnych sekwencji. Możliwa jest synteza puli zawierającej 1015 sekwencji. Czynnik transkrypcyjny immobilizuje się na złożu w kolumnie, którą przemywa się zsyntetyzowaną pulą fragmentów DNA. Po wymyciu związanych z kolumną fragmentów powiela się je w reakcji PCR, a następnie znowu nanosi na kolumnę. Cykl ten powtarza się aż do uzyskania czystej puli sekwencji specyficznie wiązanej przez immobilizowany na kolumnie czynnik transkrypcyjny. Poznanie sekwencji rozpoznawanych przez czynniki transkrypcyjne oraz bodźców stymulujących syntezę określonych czynników teoretycznie powinno umożliwić na podstawie analizy sekwencji promotora identyfikację warunków, w jakich dany gen będzie ulegał ekspresji. 75
Analiza promotorów genów sekwencji jest bardzo duże. Poza analizowaną sekwencją, definiowanym parametrem jest wartość progowa (w przedziale od 0 do 1) podobieństwa znalezionych motywów do tablic w bazach danych. Od wysokości zadanej wartości progowej zależy liczba znalezionych miejsc potencjalnie rozpoznawanych przez ujęte w bazie danych czynniki transkrypcyjne. Niestety dotychczas nie ma skutecznych metod wyodrębnienia trafień fałszywie pozytywnych. W rezultacie dysponujemy obszerną listą potencjalnych czynników, których efekt należy wery fikować eksperymentalnie. Dodatkowo lista czynników wzrośnie, jeżeli sekwencję poddamy analizie przez różne bazy danych i programy. Matlnspector, aby zmniejszyć liczbę pokazywanych czynników transkrypcyjnych, pogrupował bazę czynników w rodziny o podobnych właściwościach (Cartharius i in. 2005). Większość programów umożliwia wybór bazy danych czynników transkrypcyjnych. Należy sobie postawić pytanie, czy analizując promotor roślinny, korzystać wyłącznie z baz danych zawierających roślinne czynniki transkrypcyjne? Nasze doświadczenie wskazuje, że mimo konieczności żmudnej selekcji przez eksperymentatora ze znacznie obszerniejszej listy, warto przeprowadzić taką analizę także przy użyciu innych baz. Istnieje wiele przykładów pokazujących, że np. niektóre białka drożdży można funkcjonalnie zastąpić ich odpowiednikami z ludzkiego genomu. Podobnie może być z czynnikami transkrypcyjnymi. Dobrym przykładem jest znalezienie w obrębie promotora izoformy 20R białka 14-3-3 z ziemniaka funkcjonalnej domeny MRE (ang. Metal Responsive Element) z genomu mysiego odpowiedzialnej za regulację odpowiedzi na jony metali pozytywnie zwery fikowanej eksperymentalnie (Aksamit i in. 2005). Inną strategią do identy fikacji potencjalnych motywów mających istotny wpływ na regulację ekspresji promotora jest porównanie sekwencji grupy promotorów o domniemanej podobnej regulacji. Wykorzystuje się obecnie dwie metody do identy fikacji grupy koregulowanych promotorów. Jedna z nich opiera się na założeniu, że zmiany ilości transkryptów obserwowane na mikrochipach odzwierciedlają zmiany w aktywności promotorów (koekspresja = koregulacja). Geny łączy się więc w grupy (ang. clusters), jeżeli obserwuje się wysoką korelację dodatnią między poziomem ich transkryptów. Założenie to nie jest do końca prawdziwe z wielu względów, np. indukcja dla różnych genów może być przesunięta w czasie, mrna może mieć różną stabilność, w wyniku indukcji jednym czynnikiem może dochodzić do kaskady zdarzeń, w której efekcie indukowane sąpromotory nie posiadające homologicznych miejsc wiązania czynników transkrypcyjnych. Druga metoda grupowania genów oparta jest na wyszukiwaniu homologów u innych gatunków na podstawie sekwencji kodujących. Niezależnie od metody grupowania, na podstawie pogrupowanych sekwencji kodujących należy wyszukać w bazie danych odpowiednie promotory. Następnie porównuje się sekwencje promotorów celem znalezienia konserwowanych sekwencji. W ten sposób, używając do wyszukiwania sekwencji kodujących 77
Analiza promotorów genów Jak transformować rośliny? Wyróżnia się dwa typy transformacji: czasową i stałą. W transformacji czasowej wprowadzony do komórek DNA ulega ekspresji, którą bada się w ciągu 24-48 h. Zaletą jest szybki wynik oraz brak konieczności selekcji i regeneracji transformowanych roślin. Najczęściej wykorzystywanymi metodami do transformacji czasowej roślin jest transformacja przy użyciu strzelby genetycznej i elektroporacji. Przy transformacji stałej dochodzi do integracji z genomem (chromosomem) wprowadzanego konstruktu. Najchętniej stosowana jest metoda przy użyciu Agrobacterium. Metoda ta jest stosunkowo prosta i wydajna. Zwykle dość czasochłonne jest uzyskanie konstruktu, który przygotowuje się w specjalnym plazmidzie binarnym, wprowadzanym do Agrobacterium. Niestety nie wszystkie gatunki roślin można transformować Agrobacterium, dla pozostałych trzeba stosować strzelbę genetyczną lub elektroporację. Najtrudniejszym etapem otrzymywania roślin transgenicznych jest ich regeneracja z pojedynczych komórek zawierających badany konstrukt. Powstające wśród regenerowanych roślin wariacje somaklonalne utrudniają otrzymanie wyrównanej odmiany o wyjściowym fenotypie. Dotychczas najczęściej wykorzystywane metody prowadzone są przez hodowlę tkanki kallusowej na podłożu selekcyjnym (zawierającym najczęściej antybiotyk - kanamycynę lub neomycynę). Pasażowanie komórek w postaci tkanki kallusowej prowadzi jednak do mutacji somaklonalnych, co utrudnia otrzymywanie wyrównanej odmiany o wyjściowym fenotypie. Dlatego też poszukiwane są metody, w których nie dopuszcza się do powstania kallusa. U Arabidopsis można transformować pączki kwiatowe i selekcjonować siewki, wysiewając nasiona na podłoże zawierające czynnik selekcyjny (najczęściej antybiotyk - kanamycynę). Jakie geny reporterowe zastosować? Białka reporterowe mają łatwą do oznaczenia aktywność enzymatyczną w teście o wysokim stopniu amplifikacji, a zatem także o wysokiej czułości. W badaniach promotorów roślinnych najpowszechniej wykorzystywanym białkiem wciąż jeszcze jest gen kodujący P-glukuronidazę (GUS). W zależności od zastosowanego substratu możliwe jest albo wybarwienie na ciemnoniebiesko tkanki, w której białko uległo ekspresji (analiza jakościowa, histochemiczna lokalizacja ekspresji), bądź badanie aktywności enzymatycznej ekstraktów bardzo czułą metodą fluorescencyjną (analiza ilościowa). W metodzie z GUS ważne jest utrzymanie właściwego, obojętnego odczynu reakcji (ph 7,0), gdyż w środowisku kwaśnym substrat ulega rozpadowi pod wpływem endogennych glukozydaz i daje fałszywie pozytywny.wynik reakcji. 79
Analiza promotorów genów Aktywność wielu czynników, ze względu na ich specyfikę działania, trudno potwierdzić eksperymentalnie. Weryfikacja eksperymentalna pokazuje, że mniej niż połowa testowanych czynników modyfikuje ekspresję reportera (tabela 3). Najtrudniejszym etapem może się okazać analiza znaczenia fizjologicznego otrzymanych wyników. Dzięki badaniom promotorów różnymi metodami, pozyskujemy informacje dotyczące lokalizacji ekspresji genu oraz warunków, w jakich może dojść do indukcji lub represji promotora. W wielu przypadkach ekspresja jednego genu jest powiązana w różny sposób z szeregiem szlaków metabolicznych. W dodatku często zdarza się, że istnieje wiele izoform kodujących białka o takiej samej aktywności enzymatycznej, których obecność może mieć głównie sens z precyzyjną regulacją. Powiązanie wszystkich wyników w spójną sieć oddziaływań jest zadaniem trudnym ze względu na bardzo dużą ilość tych powiązań. Nikt nie jest w stanie śledzić na bieżąco gromadzonej informacji. Aby skorzystać z bazy danych, trzeba wiedzieć ojej istnieniu, a-jak oszacowano - w 2004 roku nowa baza danych powstawała co drugi dzień. Dlatego też kluczowym elementem dla dalszego postępu będzie linkowanie " nowych informacji. Innymi słowy, nowa informacja bez wskazania jak największej ilości powiązań z istniejącymi danymi będzie mało przydatna. Tak jak baza danych czynników transkrypcyjnych jest ściśle powiązana z bazą danych rozpoznawanych przez nie sekwencji, kolejnym krokiem będzie połączenie tych baz z regulowanymi przez czynniki transkrypcyjne enzymami i szlakami metabolicznymi. Programy takie są powoli tworzone, np. www.genomatix.de. Niestety jest to baza komercyjna i nowe programy są udostępniane odpłatnie. Z tabeli 3 wynika, że pośród 10 sekwencji zidentyfikowanych in silico w promotorze 16R genu rodziny 14-3-3 tylko 5 ma najprawdopodobniej znaczenie fizjologiczne. Doświadczalna weryfikacja potencjalnych miejsc wiązania czynników transkrypcyjnych dla promotora 20R potwierdziła tylko 4 miejsca aktywacji na 12 sekwencji znalezionych in silico. Zatem wiarygodność bazy danych czynników transkrypcyjnych kształtuje się na poziomie 30-50%. 81
Analiza promotorów genów Literatura Aksamit A., Korobczak A., Skała J., Łukaszewicz M., Szopa J. 2005. The 14-3-3 gene expression specificity in response to stress is promoter dependent. Plant Cell Physiol. (in press) Alvarado M.C., Zsigmond L.M., Kovacs I., Cseplo A., Kończ C., Szabados L.M. 2004. Gene Trapping with firefly luciferase in Arabidopsis. Tagging of Stress-Responsive Genes. Plant Physiol. 134: 18-27. Cartharius K., Freeh K., Grote K., Klocke B., Haltmeier M., Klingenhoff A., Frisch M., Bayerlein M., Werner T. 2005. Matlnspector and beyond: promoter analysis based on transcription factor binding sites. Bioinformatics. (in press) Galperin, M.Y. 2005. The Molecular Biology Database Collection: 2005 update. Nucl. Acids Res. 33, Database issue D5-D24. Grandjean O., Vernoux T., Laufs P., Belcram K., Mizukami Y., Traas J. 2004. In vivo analysis of cell division, cell growth, and differentiation at the shoot apical meristem in Arabidopsis. Plant Cell 16: 74-74. Prestridge D.S. 2000. Computer software for eukaryotic promoter analysis. Methods Mol. Biol. 130: 265-95. Szabados L., Kovacs I., Abraham E., Oberschall A., Nagy R., Zsigmond L., Krasovskaja I., Kerekes I., Ben-Haim A., Kończ C. 2000. Arabidopsis genome project in Hungary: generating T-DNA tagged Arabidopsis genes. Plant Physiol. Biochem. 38: S98. Wagner A. 1999. Genes regulated cooperatively by one or more transcription factors and their identification in whole eukaryotic genomes. Bioinformatics 15: 776-784.