Streszczenie Efekt terapeutyczny cisplatyny jest wynikiem wytworzenia inter- i intramolekularnych wiązań z DNA i najczęściej prowadzi do śmierci komórki nowotworowej w drodze apoptozy. Jednocześnie koordynacja cisplatyny do DNA uaktywnia szereg mechanizmów prowadzących do powstawania oporności takich jak: zmniejszenie transportu leku do komórki, usuwanie z komórki, sekwestracja z udziałem glutationu i metalotionein, naprawa DNA, hamowanie apoptozy. Stosując technikę mikromacierzy oligonukleotydowych (Affymetrix) porównano ekspresję genów związanych z procesami odpowiedzialnymi za powstawanie oporności na lek w komórkach białaczki promielocytarnej HL-60 eksponowanych na cisplatynę oraz w komórkach kontrolnych. Analizując sygnały fluorescencji 770 sond, wyselekcjonowanych z bazy NetAffx Analysis Center, reprezentujących ekspresję 412 genów, wykazano najsilniejszy wzrost ekspresji genów TOP2A, TOP1, KRAS, BIK, BAX, TFAM, GTSE1, CASP6 oraz zmniejszenie ekspresji genów SLC7A11, CD70, MTF1, ABCC3. Poznanie efektów zmienionej ekspresji tych genów jest istotne zwłaszcza dla projektowania nowych pochodnych platyny charakteryzujących się zwiększoną skutecznością, które ponadto nie będą wywoływały narastania oporności na lek. Abstract Therapeutic effect of cisplatin results from formation of inter- and intrastrand DNA crosslinks and usually leads to death of tumour cells through apoptosis. At the same time its incorporation and binding to DNA activate mechanisms which cause resistance to the drug, such as decreased uptake, removal from the cell, sequestration by glutathione and metallothionein, DNA repair, and inhibition of apoptosis. Using oligonucleotide microarray technique (Affymetrix) the expression of genes involved in development of drug resistance in promyelocytic leukemia HL-60 cells exposed to cisplatin and control cells was compared. Analysis of the fluorescence signals of 770 probes, which represented 412 genes selected from the NetAffx Analysis Center database showed highest expression increase of TOP2A, TOP1, KRAS, BIK, BAX, TFAM, GTSE1, CASP6, and inhibition of SLC7A11, CD70, MTF1, ABCC3. Elucidation of these genes altered expression effects seems to be important, particularly in synthesis of new cisplatin analogs, which besides increased efficiency, overcome drug resistance. Key words: cisplatin, gene expression, drug resistance, promyelocytic leukemia cells, HL-60 Słowa kluczowe: cisplatyna, ekspresja genów, oporność na lek, komórki białaczki promielocytarnej, HL-60 Wstęp Efekt terapeutyczny cisplatyny, powszechnie stosowanego leku przeciwnowotworowego, jest wynikiem wytworzenia inter- i intramolekularnych wiązań z DNA. Mechanizm działania cisplatyny polega przede wszystkim na jej aktywacji wewnątrz komórki poprzez zastąpienie dwóch atomów chloru grupami hydroksylowymi, co w konsekwencji umożliwia wiązanie do DNA i tworzenie adduktów [1], które powodują lokalne zaburzenie struktury podwójnej helisy i blokowanie procesów replikacji i transkrypcji, co w konsekwencji prowadzi do zaburzeń w szlakach sygnałowych kontrolujących wzrost, różnicowanie czy odpowiedź na stres oksydacyjny wywoływany przez ten lek [2]. Addukty cisplatyny z DNA są rozpoznawane przez szereg białek komórkowych związanych, np. z szlakami na-
prawy DNA, co najczęściej prowadzi do śmierci komórki w drodze apoptozy [3]. Z drugiej strony wiązanie cisplatyny do DNA uaktywnia cały szereg mechanizmów prowadzących do powstawania oporności i braku wrażliwości na ten lek. Za oporność na cisplatynę odpowiedzialny jest przede wszystkim niewystarczający transport do komórki [4]. Istnieją doniesienia o udziale w usuwaniu cisplatyny z komórki zależnych od ATP białek MDR1, MRP1, MRP2, MRP3, jednakże późniejsze prace przypisują funkcję usuwania tego leku przede wszystkim białkom związanym z transportem miedzi, ATP-azom ATP7A oraz ATP7B [5]. Również nadekspresja glutationu oraz niektórych białek zawierających grupy tiolowe, jak metalotioneina, powoduje oporność na cisplatynę [6]. Wiązanie glutationu i cisplatyny jest katalizowane przez transferazy S-glutationowe, które zwiększając właściwości anionowe związku, zwiększają jego usuwanie z komórki poprzez zależną od ATP pompę S-koniugatów glutationu [7]. Oprócz niewystarczającej akumulacji cisplatyny wewnątrz komórek, główną przyczyną braku wrażliwości nowotworu na ten lek są procesy związane z możliwością naprawy DNA oraz usuwaniem adduktów cisplatyna-dna [8]. W odróżnieniu od niewrażliwych komórek wielu guzów wykazujących wzrost zdolności naprawczych polekowych uszkodzeń DNA, znaczna wrażliwość komórek, np. raka jądra, wynika z upośledzenia ich zdolności do naprawy DNA. Podstawowymi mechanizmami usuwającymi spowodowane przez cisplatynę uszkodzenia DNA są: naprawa przez wycinanie nukleotydów (NER), naprawa przez wycinanie zasad (BER), naprawa źle sparowanych zasad (MMR) i naprawa pęknięć DNA. Zwiększona tolerancja na wywołane przez cisplatynę uszkodzenia DNA może także wystąpić na skutek utraty funkcji szlaku MMR. Pochodna cisplatyny, Eloxatin nie wywołuje powstawania oporności, gdyż mechanizm jej akumulacji nie zależy w tak znacznym stopniu od transportera miedzi CTR1 [9]. Ponadto połączenia tego leku z DNA nie są rozpoznawane przez białka MMR, podczas gdy addukty cisplatyna - DNA są rozpoznawane przez białka MSH2, MSH3 i MSH6. Gdy komórki podlegają kolejnym bezskutecznym cyklom naprawy DNA, poziom uszkodzeń pozostaje wystarczający do uruchomienia mechanizmów apoptozy. Kolejny z mechanizmów oporności związany jest z omijaniem podczas replikacji przez polimerazy DNA i η miejsc w DNA, do których przyłączona jest cisplatyna [10]. Tolerancja na cisplatynę może również być wynikiem zmniejszonej ekspresji, albo utraty szlaków apoptozy, zarówno wewnętrznego jak i zewnętrznego, na skutek zmienionej aktywności białek takich jak P53, anty- i proapoptotycznych białek rodziny BCL2 oraz JNK [11]. W przedstawianej pracy, w celu pełniejszego wyjaśnienia mechanizmów molekularnych decydujących o wrażliwości komórek nowotworowych na cisplatynę, poddaliśmy ocenie zmiany profilu ekspresji genów kodujących białka uczestniczące w transporcie wielolekowym, syntezie glutationu i metalotionein, naprawie DNA oraz zmniejszaniu aktywacji i hamowaniu indukcji szlaków apoptozy pod wpływem tego leku. Do badań wykorzystaliśmy hodowane w warunkach laboratoryjnych komórki ludzkiej linii nowotworowej białaczki promielocytarnej HL-60. Do analizy ekspresji genów zastosowano technikę mikromacierzy oligonukleotydowych HG-U133A (Affymetrix). Materiał i metody Hodowle komórkowe Materiał do badań stanowiły hodowane komórki ludzkiej linii nowotworowej białaczki promielocytarnej HL-60. Komórki hodowano, zgodnie z zaleceniami ATCC, w standardowych warunkach (w temperaturze 37 C, w atmosferze 5% CO 2 ), w pożywce hodowlanej RPMI-1640 (Gibco) z dodatkiem 10% bydlęcej surowicy płodowej (FBS; Sigma), 100 g /ml streptomycyny, 100 U/ml penicyliny (Sigma), 2 mm glutaminy (Sigma), 1 mm pirogronianu sodu (Sigma) i 4,5 g/l glukozy. Po 48 godzinach inkubacji do hodowli dodawano roztwór cisplatyny (Sigma) rozpuszczonej w DMSO (Sigma) tak, aby uzyskać stężenie 0,22 g/ml, odpowiadające wartości ID30 (Inhibitory Dose 30%). Hodowle kontrolne prowadzono w identyczny sposób, dodając po 48 godzinach czysty DMSO, stosowany ze względu na ograniczoną rozpuszczalność cisplatyny. Po sześcio godzinnej inkubacji komórki zbierano i przygotowywano do ekstrakcji RNA. Ekstrakcja całkowitego RNA RNA ekstrahowano z użyciem odczynnika TRIZOL (Invitrogen Life Technologies), zgodnie z protokołem producenta. Ekstrakty całkowitego RNA oczyszczono z wykorzystaniem zestawu RNeasy Mini Kit (Qiagen). Ekstrakty RNA oceniano jakościowo techniką elektroforezy w 1% żelu agarozowym barwionym bromkiem etydyny oraz ilościowo przy użyciu spektrofotometru GeneQuant II (Pharmacia Biotech). Analiza aktywności transkrypcyjnej genów techniką mikromacierzy oligonukleotydowych Całkowite RNA (8 g) zostało wykorzystane do syntezy dwuniciowego cdna (Gibco BRL SuperScript Choice system), które stanowiło matrycę do syntezy biotynylowanego crna (reakcja transkrypcji in vitro, Enzo kit). Po fragmentacji biotynylowanego crna przeprowadzono hybrydyzację z mikromacierzą Test3, a następnie po pozytywnej weryfikacji z mikromacierzą HG-U133A (Affymetrix). Znakowanie produktów hybrydyzacji przeprowadzono kilkustopniowo kompleksem streptawidyna fikoerytryna, znakowanymi przeciwciałami przeciw biotynie oraz przeciwciałami przeciw kompleksowi streptawidyna fikoerytryna zgodnie z protokołem EukGEWS2v4 zalecanym dla mikromacierzy oligonukleotydowej HG U133A w przewodniku Gene Expression Analysis Technical Manual (Affymetrix). Następnie płytki mikromacierzy odczytywano używając skanera Agilent GeneArray Scanner G2500A (Agilent Technologies). Otrzymane wyniki intensywności fluorescencji zapisano i zarchiwizowano w programie Microarray Suite oraz specjalnie do tego celu przygotowanej bazie danych. Analizę porównawczą transkryptomów przeprowadzono po normalizacji wyników w programie RMA Express polegającej na przekształceniu logarytmicznym wartości sygnału fluorescencji dla każdego transkryptu (log 2 ) wykorzystując programy komputerowe: Statistica v.7,0, Gnumeric, oraz Microsoft Excel. Wyodrębnienia grup genów związanych
z powstawaniem oporności na lek dokonano korzystając z bazy danych Affymetrix NetAffx Analysis Center (http://www.affymetrix.com/ analysis/index.affx) po wpisaniu kwerend: drug resistance, cisplatin resistance, drug transport, glutathione, metallothionein, SLC, MDR, DNA repair oraz anti-apoptosis. Sumaryczny zbiór 770 sond stanowił podstawę do poszukiwania genów różnicujących. Z grupy 22283 sond mrna, obecnych na mikromacierzy HG-U133A, wyfiltrowano za pomocą arkusza programu Gnumeric sygnały fluorescencji charakteryzujące ekspresję wybranych transkryptów związanych z powstawaniem oporności na cisplatynę. Porównując sygnały fluorescencji sond zarejestrowane dla komórek kontrolnych oraz komórek eksponowanych na cisplatynę, wyznaczono zbiory, tzw. genów różnicujących o ekspresji różniącej się, co najmniej, ± 2SLR. Wyniki Analizę profilu ekspresji genów, kodujących białka związane powstawaniem w komórkach HL-60 oporności na cisplatynę, poprzedzono porównaniem raportów wygenerowanych w programie Microarray Suite Affymetrix bezpośrednio po odczycie sygnałów fluorescencji na mikromacierzy. Prawidłowy rozkład znormalizowanych sygnałów fluorescencji (RMA Express) był podstawą do zakwalifikowania mikromacierzy do dalszych analiz. Za pomocą programu Gnumeric, z grupy 22283 mrna obecnych na mikromacierzy HGU133A, wyselekcjonowano sygnały fluorescencji 770 transkryptów związanych z powstawaniem oporności. Wyznaczono parametr SLR (signal log ratio) wskazujący wielokrotność różnicy sygnału fluorescencji, wyodrębniono zbiór genów różnicujących transkryptomy komórek HL-60 kontrolnych oraz eksponowanych na cisplatynę. Wykonane analizy pozwoliły na stwierdzenie, że w komórkach HL-60 eksponowanych na cisplatynę w porównaniu do komórek kontrolnych w największym stopniu stymulowana jest ekspresja genów TOP2A, TOP1, KRAS, BIK, BAX, TFAM, GTSE1, CASP6, AP1S1 i BNIP3L. Genami, których ekspresja została najbardziej zahamowana, okazały się SLC7A11, CD70, MTF1, ABCC3, FAS oraz SLC2A3. Szczegółowe dane uwzględniające nazwy sond, symbole genów, nazwy kodowanych białek, oraz wartości SLR dla transkryptów różnicujących zestawiono w tabeli I. Geny te pełnią bardzo istotne funkcje w procesach powstawania oporności na lek. Dyskusja Zjawisko wytwarzania przez komórki nowotworowe różnych mechanizmów obronnych stanowi jeden z głównych problemów we współczesnej terapii przeciwnowotworowej. Oporność nowotworów niewrażliwych na cisplatynę wynika najczęściej z niewystarczającej akumulacji tego leku w komórce [12, 13]. Cisplatyna jest związkiem o znacznej polarności, co powoduje, że przenika do komórek znacznie wolniej niż większość niskocząsteczkowych leków przeciwnowotworowych. Wchłanianie cisplatyny zależy od stężenia jonów sodu i potasu, ph oraz obecności czynników redukujących. Oprócz dyfuzji biernej, transport cisplatyny do wnętrza komórki zachodzi z udziałem białek transportujących, kanałów jonowych oraz przezbłonowego transportera miedzi CTR1. Zarówno miedź jak i cisplatyna, w zakresie stężeń występujących fizjologicznie w organizmie oraz podczas terapii, powodują obniżenie poziomu CTR1 poprzez makropinocytozę i degradację z udziałem proteasomów [5]. Kolejną przyczyną powstawania oporności komórek nowotworowych jest zmieniony transport leków przeciwnowotworowych przez MDR-1, nadrodzinę białek transportujących zależnych od ATP, oraz inne białka oporności wielolekowej [12]. W przedstawianej pracy zaobserwowano obniżony poziom ekspresji ABCC3. Gen ten koduje białko ABCC3 - kanalikularne białko 2 związane z opornością wielolekową (canalicular multispecific organic anion transporter 2; MRP3) należące do nadrodziny błonowych białek transportowych zależnych od ATP. Białka te charakteryzują się znacznym polimorfizmem i powszechnie występują w komórkach nowotworowych [14]. Innym genem, którego ekspresja w komórkach HL-60 pod wpływem cisplatyny uległa obniżeniu, jest SLC2A3 kodujący błonowe białka rodziny SLC2A, które są odpowiedzialne za transport związków polarnych [15]. Chociaż udział tego przenośnika w transporcie cisplatyny do komórek nie został dotychczas opisany, nie można wykluczyć, że zaobserwowana w naszych eksperymentach zmniejszona ekspresja tego genu jest wynikiem odpowiedzi komórki mającej na celu obniżenie stężenia cisplatyny w cytoplazmie. Przyczyną oporności na cisplatynę jest również podwyższone stężenie w cytoplazmie związków zawierających grupę tiolową, takich jak glutation czy metalotioneiny, które unieczynniają cisplatynę na skutek wiązania platyny i siarki [6, 13]. Zwiększone stężenie metalotionein w komórkach mysich powoduje 4-krotne, a w ludzkich komórkach raka jajnika 7-krotne zwiększenie oporności na cisplatynę. Komórki raka jajnika wykazują ujemną korelację poziomu glutationu oraz wrażliwości na cisplatynę. Badania dwóch linii komórek raka jajnika, wywodzących się od tego samego pacjenta, wyizolowanych przed terapią i po zastosowaniu cisplatyny wykazały 2,9 krotny wzrost aktywności transferaz glutationowych, które katalizują sprzęganie glutationu z cisplatyną [16]. Ponadto, udowodniono, że wytworzone addukty cisplatyna-glutation są usuwane z komórki poprzez zależną od ATP pompę S-koniugatów glutationu. Już w 1994 roku Ishikawa i wsp. wykazali, że oporności białaczki promielocytarnej HL-60 towarzyszy zwiększona ekspresja zależnej od ATP pompy S-koniugatów glutationu (MRP1 lub MRP2) [7]. W cytoplazmie, glutation przyłącza się do cisplatyny, a w jądrze do adduktów cisplatyny z DNA, uniemożliwiając w ten sposób utworzenie potencjalnie cytotoksycznych wiązań krzyżowych w DNA [17]. Rezultaty naszych eksperymentów pokazują, że w komórkach HL-60 eksponowanych na cisplatynę ulega obniżeniu ekspresja genu SLC7A11, kodującego specyficzne białko transportowe cystyna/glutaminian uczestniczące w transporcie anionowej formy cystyny do komórek. Ponieważ bardzo niska ekspresja tego białka na powierzchni niektórych komórek (m.in. limfocytów) przy obniżonej dostępności cysteiny skutkuje spowolnieniem syntezy glutationu, można się spodziewać, że obniżenie ekspresji SLC7A11, świadczy o braku pierwotnej oporności związanej z nadmierną syntezą glutationu w badanych komórkach [18]. Udział metalotionein w de-
Nazwa sondy Symbol genu Nazwa kodowanego białka toksykacji cisplatyny udokumentowany został już w latach 90-tych poprzedniego stulecia. Komórki narażone na działanie metali ciężkich natychmiast po ekspozycji rozpoczynają syntetyzować metalotioneiny. Wzrost ekspresji MTF1 poprzedza syntezę metalotionein. MTF1 (metal regulatory transcription factor 1) koduje czynnik transkrypcyjny, który indukuje ekspresję genów metalotionein oraz innych genów uczestniczących w homeostazie metali takich jak kadm, cynk, miedź i srebro. MTF1 jest transportującym białkiem jądrowo-cytoplazmatycznym, które gromadzi się w jądrze na skutek ekspozycji na metale ciężkie i wiąże się do promotorów zawierających element odpowiedzi na metale (MRE) [12,13]. W przedstawianej pracy zaobserwowano obniżony poziom ekspresji MTF1 w komórkach HL-60 po ekspozycji na cisplatynę. Obniżonemu poziomowi ekspresji MTF1 towarzyszył wzrost ekspresji szeregu genów odpowiedzialnych za syntezę metalotionein, jednak niewystarczający, aby zaklasyfikować te geny jako różnicujące. Ekspozycja komórek HL-60 na cisplatynę spowodowała wzrost ekspresji genu AP1S1 kodującego białko - podjednostkę kompleksu sigma 1A, stanowiące część kompleksu płaszcza klatryny okrywającego pęcherzyki transportujące, np. w procesie Tab. I. Ekspresja genów różnicujących związanych z regulacją i powstawaniem oporności na lek w komórkach białaczki promielocytarnej HL-60 eksponowanych na cisplatynę względem prób odniesienia (komórki eksponowane na DMSO), (SLR ang. signal log ratio stosunek zlogarytmowanych uśrednionych wartości fluorescencji transkryptu w porównywanych próbach, strzałka - nadekspresja, strzałka - spadek ekspresji genu w komórkach HL-60 eksponowanych na cisplatynę) Wartość SLR 201291_s_at TOP2A topoizomeraza (DNA) II alfa (topoisomerase (DNA) II alpha) 2,05 208900_s_at TOP1 topoizomeraza (DNA) I (topoisomerase (DNA) I) 1,9 214352_s_at KRAS (v-ki-ras2 Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog) 1,89 205780_at BIK BIK (BCL2-interacting killer) 1,72 211833_s_at BAX białko związane z BCL2 (BCL2-associated X protein) 1,66 203176_s_at TFAM mitochondrialny czynnik transkrypcyjny A (transcription factor A, mitochondrial) 1,62 204315_s_at GTSE1 białko 1 ulegające ekspresji w fazach G2 i S (G2 and S-phase expressed 1 protein) 1,39 209790_s_at CASP6 kaspaza 6 (caspase 6, apoptosis-related cysteine peptidase) 1,34 208478_s_at BAX białko związane z BCL2 (BCL2-associated X protein) 1,31 205195_at AP1S1 adaptor-related protein complex 1, sigma 1 subunit 1,19 208541_x_at TFAM mitochondrialny czynnik transkrypcyjny A (transcription factor A, mitochondrial) 1,17 221479_s_at BNIP3L BCL2/adenovirus E1B 19 kda protein-interacting protein 3-like 1,05 202499_s_at SLC2A3 transporter wielolekowy SLC2 (solute carrier family 2) -1,01 204780_s_at FAS Fas (TNF receptor superfamily, member 6) -1,05 208161_s_at ABCC3 ATP-binding cassette, sub-family C (CFTR/MRP), member 3-1,08 205323_s_at MTF1 metal-regulatory transcription factor 1-1,22 217678_at SLC7A11 transporter wielolekowy SLC7 (solute carrier family 7) -1,48 206508_at CD70 (CD70 molecule) -1,54 209921_at SLC7A11 transporter wielolekowy SLC7 (solute carrier family 7) -2,28 endocytozy oraz w aparacie Golgiego. Zwiększona ekspresja tego genu jest zapewne związana z dążeniem komórki do sekwestracji cisplatyny, do struktur pęcherzykowych, nie mających bezpośredniego kontaktu z DNA, a następnie jej wydalenia. Białko to pełni także funkcję czynnika transkrypcyjnego [19]. Powszechnie znanym jest fakt, że indukcja apoptozy jest wynikiem przekroczenia w komórce pewnego poziomu uszkodzeń. Gdy dochodzi do modyfikacji DNA, które nie mogą być usunięte przez system naprawy DNA, następuje indukcja apoptozy, która jest wynikiem obniżenia ekspresji genu BCL-2 kodującego białko antyapoptotyczne oraz stymulacji ekspresji genu BAX oraz białek BAK, BIK, P53, przy czym w tym samym czasie uaktywnione zostają mechanizmy antyapoptotyczne. Zaburzenia mechanizmów prowadzące do hamowania procesu apoptozy są jedną z głównych przyczyn powstawania oporności [9]. Wyniki wykonanych przez nas pomiarów pokazują wzrost ekspresji BAX, oraz innych genów kodujących białka z rodziny BCL-2 takich jak BIK i BNIP3L w badanych komórkach HL-60 eksponowanych na ciplatynę. W badaniach wykonanych przez Floros i wsp. [20] dotyczących apoptozy indukowanej przez cisplatynę w komórkach HL-60, stwierdzono wzrost ilości komórek ulegających apoptozie korelujący z czasem ekspozycji na ten lek. W pierwszych godzinach ekspozycji (3 i 6 godzin) następował wzrost ekspresji BCL-2L12, a po 12 godzinach ciągłego traktowania komórek tym lekiem zaobserwowano zmniejszenie ekspresji tego genu. Obserwacje te wskazują na obronną, antyapoptotyczną reakcję komórek w pierwszych godzinach ekspozycji i potwierdzają mechanizm śmierci komórek HL-60 eksponowanych na cisplatynę w drodze apoptozy [20]. Alternatywną drogą indukowania apoptozy przez białka z rodziny BCL-2 jest ich interakcja z czynnikiem Apaf 1 (apoptic protease activating factor 1) oraz z cytochromem C i kaspazą 9, co prowadzi do aktywacji innych kaspaz. Również interakcja białek BID i BIK z białkami BCL-2 i BCL-XL prowadzi do kaskadowej aktywacji kaspaz i apoptozy [21]. Wzrost aktywności genu
kaspazy 6 (CASP6) zaobserwowano w komórkach HL-60 eksponowanych na cisplatynę. Ponadto, wykazano wzrost ekspresji genu GTSE1, który uczestniczy w syntezie G2 i S enzymatycznego białka 1, ulegającego ekspresji w fazach S oraz G2 cyklu komórkowego. Białko to, w odpowiedzi na uszkodzenie DNA gromadzi się w jądrze i wiąże białko P53, powodując jego przemieszczenie z jądra i hamując jego zdolność do indukowania apoptozy. Nagromadzenie się białka GTSE1, głównie w pobliżu mikrotubuli, powoduje opóźnienie przejścia komórki z fazy G2 do M [22]. Przyczyną wytwarzania oporności komórek nowotworowych na lek są mechanizmy związane z naprawą polekowych uszkodzeń DNA. Naprawa DNA prowadzi do usunięcia adduktów z cisplatyną. Spośród wielu mechanizmów naprawy DNA tylko naprawa przez wycinanie nukleotydów (NER) odgrywa znaczącą rolę w powstawaniu oporności na cisplatynę. Chociaż w procesie tym bierze udział ponad 30 rodzajów cząsteczek, jest on limitowany przez białka ERCC1 oraz XP [9]. Rezultaty przeprowadzonych eksperymentów pokazują wzrost ekspresji genów TOP2A (DNA topoizomeraza II alfa) i TOP1 (DNA topoizomeraza I) w komórkach HL-60 na skutek działania cisplatyny. TOP2A koduje zlokalizowany w jądrze enzym topoizomerazę DNA, który dodając superskręty do cząsteczki DNA, kontroluje i zmienia stany topologiczne DNA podczas transkrypcji. Zmiany aktywności tego genu pod wpływem różnych związków przeciwnowotworowych obserwowane są w komórkach wielu nowotworów, w tym również białaczki promielocytarnej HL-60, a jego amplifikacja bądź delecja może być czynnikiem predykcyjnym w terapii przeciwnowotworowej. TOP1 koduje białko uczestniczące w procesie transkrypcji odpowiadające za usuwanie (relaksację) superskrętów z cząsteczki DNA [23]. W opisywanym eksperymencie zaobserwowano wzrost ekspresji genu TFAM (mitochondrialny czynnik transkrypcyjny A), który pełni, podobnie tak jak histony w jądrowym DNA, rolę ochronną względem mtdna. Replikacja w mitochondriach przebiega niezależnie i częściej od podziałów komórkowych, co sprawia, że mtdna jest dużo bardziej narażony na czynniki uszkadzające i mutagenne, np. reaktywne formy tlenu (RFT), niż DNA jądrowy [24]. Dotychczasowe badania na komórkach różnych linii nowotworowych w znacznym stopniu wyjaśniają molekularne mechanizmy powstawania oporności na chemioterapię i mogą przyczynić się do opracowywania skutecznego postępowania klinicznego. Ponadto, rezultaty tych badań mogą być wykorzystywane przez laboratoria badawcze podczas tworzenia nowych pochodnych platyny o zwiększonej skuteczności i obniżonej toksyczności, które ponadto nie będą wywoływały narastania oporności. W przedstawionej pracy opisano wyniki badań wczesnych zmian w ekspresji genów spowodowanych przez cisplatynę dodaną do hodowli komórek HL-60 w fazie eksponencjalnego wzrostu. Oczywistym jest fakt, że efekt działania substancji wykazującej cytotoksyczność zależy zarówno od stężenia jak i czasu ekspozycji. Gdy komórki białaczki promielocytarnej HL-60 hodowane są w kolejnych pasażach w obecności cisplatyny w odpowiednio dobranych, często wzrastających stężeniach, dochodzi w nich do powstania utrwalonej oporności na ten lek. Sytuacja ta w pewnym stopniu nawiązuje do powstawania oporności u pacjentów poddawanych chemioterapii w kolejnych jej cyklach. Przedstawione przez nas wyniki sugerują, że zmienione sygnały ekspresji analizowanych genów, już po pierwszej ekspozycji komórek nowotworowych na lek, mogą być brane pod uwagę w przewidywaniu powstawania oporności. Wnioski 1. Cisplatyna powoduje w komórkach białaczki promielocytarnej HL-60 zmiany w ekspresji genów związanych z opornością na lek. 2. Powstawanie oporności na cisplatynę w komórkach białaczki promielocytarnej HL-60 zależy od poziomu ekspresji genów związanych z transportem i usuwaniem leku oraz naprawą DNA. 3. Poznanie mechanizmów molekularmych powstawania oporności komórek nowotworowych na cisplatynę może być podstawą opracowywania skutecznego postępowania klinicznego. Piśmiennictwo 1. Siddik ZH. Cisplatin: mode of cytotoxic action and molecular basis of resistance. Oncogene 2003; 22: 7265 79. 2. Mandic A i wsp. Cisplatin induces endoplasmic reticulum stress and nucleus-independent apoptotic signaling. J Biol Chem 2003; 278: 9100-6. 3. Chaney SG i wsp. Protein interactions with platinum DNA adducts: from structure to function. J Inorg Biochem 2004; 98: 1551 9. 4. Perez RP. Cellular and molecular determinants of cisplatin resistance. Eur J Cancer 1998; 34: 1535-44. 5. Holzer AK, Manorek GH, Howell SB. Contribution of the major copper influx transporter CTR1 to the cellular accumulation of cisplatin, carboplatin and oxaliplatin. Molec Pharmacol 2006; 70: 1390 4. 6. Fokkema E i wsp. JM216-, JM118-, and cisplatininduced cytotoxicity in relation to platinum-dna adduct formation, glutathione levels and p53 status in human tumor cell lines with different sensitivities to cisplatin. Biochem Pharmacol 2002; 63: 1989-96. 7. Ishikawa T, Wright CD, Ishizuka H. GS-X pump is functionally overexpressed in cis-diamminedichloroplatinum (II)-resistant human leukemia HL-60 cells and down-regulated by cell differentiation. J Biol Chem1994; 269: 29085-93. 8. Rosell R i wsp. DNA repair and cisplatin resistance in non-small cell lung cancer. Lung Cancer 2002; 38: 217-27. 9. Torigoe T. i wsp. Cisplatin resistance and transcription factors. Curr Med Chem Anti-Cancer Agents 2005; 5: 15-27. 10. Albertella MR i wsp. A role for polymerase η in the cellular tolerance to cisplatin-induced damage. Cancer Res 2005; 65: 9799 806. 11. Gadducci A i wsp. Molecular mechanisms of apoptosis and chemosensitivity to platinum and paclitaxel in ovarian cancer: biological data and clinical implications. Eur J Gynaecol Oncol 2002; 23: 390 6.
12. Borst P i wsp. A family of drug transporters: the multidrug resistance-associated proteins. J Natl Cancer Inst 2000; 92: 1295-302. 13. Choi CH i wsp. Molecular mechanisms of heptaplatin effective against cisplatin-resistant cancer cell lines: less involvement of metallothionein. Cancer Cell Int 2004 4: 6. 14. Muller PJ i wsp. Polymorphisms in ABCG2, ABCC3 and CNT1 genes and their possible impact on chemotherapy outcome of lung cancer patients. Int J Cancer 2009; 124: 1669 74. 15. Uldry M, Thorens B. The SLC2 family of facilitated hexose and polyol transporters. Pflugers Arch 2004; 447: 480 9. 16. Holford J i wsp. Mechanisms of drug resistance to the platinum complex ZD0473 in ovarian cancer cell lines. Eur J Cancer 2000; 36: 1984 90. 17. Zhang K i wsp. Modulation of cisplatin cytotoxicity and cisplatin-induced DNA cross-links in HepG2 cells by regulation of glutathione related mechanisms. Mol Pharmacol 2001; 59: 837-43. 18. Wang H i wsp. Expression of the activity of cystine/glutamate exchange transporter, system x(c)(-), by xct and rbat. Biochem Biophys Res Commun 2003; 305: 611-8. 19. Guay D i wsp. The strand separation and nuclease activities associated with YB-1 are dispensable for cisplatin resistance but overexpression of YB-1 in MCF7 and MDA-MB-231 breast tumor cells generates several chemoresistance signatures. Int J Biochem Cell Biol 2008; 40: 2492-507. 20. Floros KV i wsp. Cisplatin-induced apoptosis in hl- 60 human promyelocytic leukemia cells differential expression of BCL2 and novel apoptosis-related gene BCL2L12. Ann NY Acad Sci 2003; 1010: 153 8. 21. Zou H. Apaf 1, a human protein homologous to C elegans CED 4 participates in cytochrome C dependent acti vation of caspase 3. Cell 1997; 90: 405 8. 22. Monte M i wsp. The cell cycle-regulated protein human GTSE-1 controls DNA damage-induced apoptosis by affecting p53 function. J Biol Chem 2003; 278: 30356-64. 23. Chen A i wsp. Microarray and biochemical analysis of bufalin-induced apoptosis of HL-60 cells. Biotechnol Lett 2009; 31: 487 94. 24. Larsen NB, Rasmussen M, Rasmussen LJ. Nuclear and mitochondrial DNA repair: similar pathways? Mitochondrion 2005; 5: 89-108. Adres do korespondencji: dr hab. n. farm. Adam Wilczok Katedra i Zakład Biofarmacji SUM ul. Narcyzów 1 41-200 Sosnowiec tel. +48 32 364 10 63 e-mail: awilczok@sum.edu.pl