PL B1. POLITECHNIKA WROCŁAWSKA, Wrocław, PL BUP 01/14

PL 223641 B1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 223641 (13) B1 (21) Numer zgłoszenia: 404428 (51) Int.Cl. G01N 33/577 (2006.01) G01N 33/574 (2006.01) Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (22) Data zgłoszenia: 24.06.2013 (54) Ultraczuły test diagnostyczny do detekcji antygenu PSA (73) Uprawniony z patentu: POLITECHNIKA WROCŁAWSKA, Wrocław, PL (43) Zgłoszenie ogłoszono: 07.01.2014 BUP 01/14 (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: 31.10.2016 WUP 10/16 (72) Twórca(y) wynalazku: MARCIN SIEŃCZYK, Wrocław, PL AGNIESZKA ŁUPICKA, Milicz, PL RENATA GRZYWA, Wrocław, PL MACIEJ WALCZAK, Wrocław, PL KAMILA BOBREK, Łaziska Górne, PL (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Katarzyna Paprzycka

2 PL 223 641 B1 Opis wynalazku Przedmiotem wynalazku jest ultraczuły test diagnostyczny do detekcji antygenu PSA fazy stałej typu podwójnego wiązania znajdujący zastosowanie w diagnostyce ludzkiego nowotworu gruczołu krokowego. Nowotwór gruczołu krokowego jest jedną z najczęściej diagnozowanych chorób nowotworowych u mężczyzn, jest także drugą przyczyną zgonów z powodu nowotworów złośliwych w Polsce i na świecie (Siegel R, Ward E, Brawley O, Jemal A. Cancer statistics, 2011: the impact of eliminating socioeconomic and racial disparities on premature cancer deaths, CA Cancer J Clin., 2011 61(4): 212 236; Stasiewicz D, Starosławska E, Brzozowska A, Mocarska A, Łosicki M, Szumiło J, Burdan F. Epidemiologia oraz czynniki ryzyka rozwoju raka gruczołu krokowego, Pol. Merk. Lek., 2012, XXXIII, 195, 163). Poziom specyficznych białek markerowych w organizmie, mierzony w płynach ustrojowych pacjentów, może dostarczać informacji zarówno na temat obecności zmian nowotworowych we wczesnych stadiach rozwoju choroby, jak i informacji dotyczących progresji i ewentualnego nawrotu choroby. Białko PSA (ang. prostate specific antigen. KLK3, hk3) jest białkiem markerowym wykorzystywanym do detekcji nowotworu prostaty oraz w celu monitorowania stanu zdrowia pacjentów, u których podjęto terapię przeciwnowotworową (Madu CO, Lu Y. Novel diagnostic biomarkers for prostate cancer, J Cancer, 2010 6(1):150 177). Antygen PSA jest wydzielany zarówno przez zdrowe, jak i nowotworowe komórki nabłonka kanalików gruczołu prostaty, skąd trafia do światła kanalików i wraz z wydzieliną gruczołową do płynu nasiennego. Po uwolnieniu w kanalikach, nieaktywna forma propsa zostaje aktywowana przez kalikreinę 2 (hk2). W zdrowej tkance tylko niewielka ilość PSA przedostaje się do osocza krwi, ponieważ komórki nabłonkowe spełniają funkcję bariery ochronnej i zapobiegają wyciekowi PSA do krwiobiegu. W wyniku procesu nowotworzenia komórek dystrybucja PSA w wydzielinie gruczołu krokowego zmienia się i większa ilość białka propsa przedostaje się do krwioobiegu. (Balk SP, Ko YJ, Bubley GJ. Biology of Prostate-Specific Antigen, J Clin Oncol. 2003 21:383 391) Jako graniczną wartość, która może świadczyć o rozwoju nowotworu prostaty, przyjmuje się 4 ng/ml PSA we krwi. Stosowane obecnie serologiczne testy diagnostyczne pozwalają wykryć 100 pg PSA w miiilitrze krwi ludzkiej. Opracowane dotychczas metody o dużo wyższej czułości nie znalazły jednak praktycznego zastosowania ze względu na wysoki koszt wykonania samej analizy, jak i konieczność dysponowania skomplikowaną aparaturą pomiarową. Białko PSA należy do rodziny kallikrein. Posiada chymotrypsynopodobną specyficzność substratową, a centrum aktywne enzymu tworzą reszty His 41, Asp 96 i Ser 189. (Laurell CB, Lilja H. Enzymatic activity of prostate-specific antigen and its reactions with extracellular serine protease inhibitors, Eur J Biochem., 1990 194:755 763). Masa aktywnej enzymatycznie cząsteczki wynosi 33kDa. Zawiera ona w swojej strukturze łańcuchy cukrowe przyłączone do reszt Asn 45 oraz Ser 69, Ser 71 i Thr 70 (Lilja H. A kallikrein-like serine protease in prostatic fluid claves the predominant seminal vesicle protein. J Clin Invest. 1985 76(5):1899 1903). Ptasie przeciwciała klasy IgY stanowią alternatywę dla wykorzystywanych obecnie ssaczych przeciwciał. Nieinwazyjna metoda izolacji znacznych ilości przeciwciał z żółtek kurzych jaj, ok. 100 mg/żółtko, bez konieczności skrwawiania zwierząt czyni z przeciwciał IgY użyteczne narzędzie diagnostyczne. Immunoglobuliny Y są głównymi przeciwciałami wytwarzanymi u zwierząt jąjorodnych. Ponadto duża odległość filogenetyczna między ssakami a ptakami umożliwia otrzymanie specyficznych przeciwciał skierowanych wobec wysoce konserwatywnych ssaczych antygenów. Przeciwciała klasy IgY nie wykazują reaktywności z ludzkim czynnikiem reumatoidalnym oraz nie aktywują ludzkiego systemu dopełniacza, dzięki czemu możliwość uzyskania fałszywie pozytywnych wyników w serologicznych testach immunoenzymatycznych ulega istotnej redukcji (Carlander D, Stálberg J, Larsson A. Chicken antibodies: a clinical chemistry perspective Ups J Med Sci. 1999 104(3):179 189). Istotą wynalazku jest ultraczuły test diagnostyczny do detekcji antygenu PSA, który zawiera układ mysich monoklonalnych przeciwciał IgG w postaci testu typu ELISA wychwytujących antygen oraz kurzych poliklonalnych przeciwciał IgY specyficznych wobec docelowego antygenu PSA. Korzystnie test jest w postaci testu typu ELISA do detekcji antygenu PSA w surowicy ludzkiej i moczu. Korzystnie test jest w postaci testu typu western blotting do detekcji antygenu PSA w moczu.

PL 223 641 B1 3 Ultraczuły test diagnostyczny do detekcji antygenu PSA według wynalazku pozwala na detekcję antygenu PSA już w stężeniu 50 pg/ml krwi, podczas gdy znane z literatury testy posiadają limit detekcji na poziomie 100 pg/ml. Przeciwciała IgY otrzymuje się na drodze immunizacji drobiu ludzkim białkiem PSA w trzech osobnych dawkach, a jako adiuwantu używa się pełnego adiuwantu Freund a, po czym znaną metodą izoluje się przeciwciała z wydajnością 100 160 mg/jajko i czystością 85 95%. Przedmiot wynalazku przedstawiony jest bliżej w przykładach jego wykonania oraz na rysunku, na którym: Fig. 1 przedstawia analizę elektroforetyczną (SDS-PAGE, 4 12%) w warunkach nieredukujących otrzymanych przeciwciał IgY specyficznych wobec białka PSA. Barwienie wykonano przy użyciu barwnika Coomassie R 250. Fig. 2 przedstawia wykres przedstawiający odpowiedź w postaci produkcji specyficznych wobec białka PSA przeciwciał IgY. Strzałkami oznaczono czas immunizacji. Fig. 3 przedstawia wykres przedstawiający zdolność przeciwciał IgY do wykrywania białka PSA. Fig. 4 przedstawia wykres mianowania przeciwciał IgY do detekcji białka PSA (100 ng). Fig. 5 przedstawia zdolność detekcji białka PSA przez otrzymane specyficzne przeciwciała IgY. Fig. 6 przedstawia miano przeciwciał IgY specyficznych wobec białka PSA (100 ng białka). Fig. 7 przedstawia barwienie srebrem żelu poliakrylamidowego po elektroforezie przeciwciał IgY pochodzących z różnych frakcji zebranych w trakcie wykonywania chromatografii powinowactwa. FT przesącz po inkubacji przeciwciał ze złożem. W1-W5 frakcje po przemywaniu kolumny roztworem 0.1% PBST, ph 7.4, K1-K2 frakcje po przemyciu kolumny buforem cytrynianowym, ph 2.5. Fig. 8 przedstawia detekcję białka PSA przez przeciwciała IgY obecne we frakcjach uzyskanych w chromatografii powinowactwa (western blotting). Fig. 9 przedstawia limit detekcji białka PSA przez specyficzne przeciwciała IgY w ultraczułym teście ELISA podwójnego wiązania. Fig. 10 przedstawia liniowość zmian stężenia białka PSA w ultraczułym teście ELISA podwójnego wiązania. Fig. 11 przedstawia detekcję białka PSA w moczu przez specyficzne przeciwciała IgY. Fig. 12 przedstawia detekcję białka PSA w surowicy przez specyficzne przeciwciała IgY. Fig. 13 przedstawia detekcję białka PSA w moczu przez specyficzne przeciwciała IgY. P r z y k ł a d 1. Przygotowanie antygenu, immunizacja, izolacja przeciwciał oraz ich analiza biochemiczna Ludzkie białko PSA rozcieńcza się tuż przed wykonaniem iniekcji w mieszaninie pełnego adiuwantu Freund a oraz soli fizjologicznej w stosunku 1:1 ( / ). Następnie kury hodowlane rasy White Leghorn immunizuje się, poprzez podanie domięśniowe antygenu w ilości 100 g/zwierzę (300 l). Immunizację powtarza się po 4 i 8 tygodniach. Dla dawek przypominających stosuje się antygen w ilości 50 g/zwierzę. Grupę kontrolną stanowią kurczęta otrzymujące iniekcję roztworu pełnego adjuwantu Freund'a w soli fizjologicznej w stosunku 1:1 ( / ). Jaja kolekcjonuje się codziennie od następnego dnia po immunizacji przez 21 tygodni, W celu izolacji przeciwciał jaja przemywa się 50% roztworem izopropanolu w wodzie. Oddziela się żółtko od białka, a następnie usuwa się błonę białkową otaczającą worek żółtkowy. Płynną zawartość żółtka rozcieńcza się pięciokrotnie buforem fosforanowym (ph 7,4). Do mieszaniny dodaje się glikol polietylenowy 6000 (PEG 6000) tak, aby końcowe stężenie wynosiło 3,5%. Po dokładnym wymieszaniu, całość wiruje się przez 15 min przy 11 000 rmp w 4 C. Otrzymany supernatant filtruje się przez sączek bibułowy, a następnie do przesączu dodaje się PEG 6000 do końcowego stężenia wynoszącego 12%. Po dokładnym wymieszaniu wytrącony osad odwirowuje się przy 11 000 rmp przez 15 min w 4 C. Supernatant odrzuca się, pozostały osad rozpuszcza się w 10 ml buforu fosforanowego (ph 7,4). Do mieszaniny dodaje się glikol polietylenowy do końcowego stężenia 12%. Po dokładnym wymieszaniu, całość wiruje się przy 11 000 rmp przez 15 min w 4 C. Supernatant odrzuca się, a osad zawierający przeciwciała klasy IgY rozpuszcza się w 5 ml buforu fosforanowego. Po wykonaniu analiz biochemicznych przeciwciała przechowuje się w temperaturze -20 C. Stężenie otrzymanych przeciwciał oznacza się spektrofotometrycznie (A 280 ). Czystość otrzymanych przeciwciał sprawdza się poprzez wykonanie analizy elektroforetycznej SDS-PAGE (4 12%) w warunkach nieredukujących (fig. 1). Czystość otrzymanych przeciwciał zawiera się w zakresie 86 95%. P r z y k ł a d 2. Analiza odpowiedzi immunologicznej na podany antygen oraz awidności przeciwciał w teście ELISA w czasie procesu immunizacji

4 PL 223 641 B1 W celu analizy odpowiedzi immunologicznej immunizowanych zwierząt na podany antygen zastosowano bezpośredni test immunoenzymatyczny fazy stałej ELISA. W tym celu 96-cio dołkowe płytki mikrotitracyjne pokryto antygenem (50 ng/100 l) rozpuszczonym w buforze węglanowym (50 mm, ph 9,6) i inkubowano przez 12 godzin w temperaturze 4 C. Wolne miejsca zablokowano przy użyciu 5% roztworu mleka odtłuszczonego w buforze fosforanowym (ph 7,4) zawierającym 0,05% Tween-20 ( / ) w temperaturze 37 C przez 60 min. Po odmyciu czynnika blokującego na płytkę mikrotitracyjną naniesiono przeciwciała specyficzne oraz kontrolne w stukrotnym rozcieńczeniu w 0,5% roztworze odtłuszczonego mleka w buforze fosforanowym (ph 7,4) z dodatkiem 0,05% Tween-20 i inkubowano przez 60 min w temperaturze 37 C. Po odmyciu przeciwciał na studzienki płytki mikrotitracyjnej nałożono 6M roztwór mocznika i inkubowano 10 min. w temperaturze pokojowej. Detekcję kompleksów białka PSA ze specyficznymi przeciwciałami IgY prowadzono z wykorzystaniem króliczych przeciwciał detekcyjnych anty-igy sprzężonych z peroksydazą chrzanową. Jako chromogenicznego substratu użyto O-fenylenodiaminy. Pomiaru absorbancji dokonano przy długości fali 490 nm za pomocą czytnika mikropłytek (fig. 2). P r z y k ł a d 3. Limit detekcji białka PSA w teście ELISA W celu określenia limitu detekcji białka PSA przez otrzymane specyficzne przeciwciała IgY wykonano enzymatyczny test immunosorpcyjny fazy stałej (ELISA) w sposób opisany powyżej. W tym celu 96-cio dołkową płytkę mikrotitracyjną opłaszczono białkiem PSA w różnych stężeniach w przedziale od 500 ng/ml do 0.1 ng/ml (100 l/studzienkę). Następnie inkubowano z roztworem specyficznego wobec białka PSA przeciwciała w stężeniu 25 ug/ml w roztworze 0,5% mleka odtłuszczonego w buforze fosforanowym zawierającym 0,05% ( / ) Tween-20. Detekcję kompleksów białka PSA specyficzne IgY przeprowadzono przy użyciu przeciwciała króliczego anty-igy skoniugowanego z peroksydazą chrzanową przy zastosowaniu O-fenylodiaminy jako chromogenicznego substratu. Pomiaru absorbancji dokonano przy długości fali 490 nm za pomocą czytnika mikropłytek. Jako kontroli użyto przeciwciała z grupy kontrolnej w analogicznych rozcieńczeniach. Wszystkie pomiary wykonano w dwóch powtórzeniach, a wyniki przedstawiono w postaci Indeksu ELISA (El) odpowiadającemu stosunkowi absorbancji próbki specyficznej do próbki kontrolnej. Jeżeli wartość El przyjmuje wartość większą lub równą 1.2 sygnał jest uznawany za specyficzny (fig. 3). P r z y k ł a d 4. Miano przeciwciał test ELISA Miano przeciwciał IgY specyficznych wobec białka PSA określono przy użyciu testu ELISA. Płytkę mikrotitracyjną opłaszczono białkiem PSA w ilości 100 ng na studzienkę. Następnie inkubowano z 5% roztworem mleka odtłuszczonego w buforze fosforanowym zawierającym 0,05% ( / ) Tween-20. Po odmyciu buforu blokującego, inkubowano z roztworem specyficznego wobec białka PSA przeciwciała w stężeniu od 25 do 0,1 ug/ml w roztworze 0,5% mleka odtłuszczonego w buforze fosforanowym zawierającym 0,05% ( / ) Tween-20. Detekcję kompleksów białka z przeciwciałami IgY przeprowadzono przy użyciu przeciwciała króliczego anty-igy skoniugowanego z peroksydazą chrzanową przy zastosowaniu O-fenylodiaminy jako chromogenicznego substratu. Pomiaru absorbancji dokonano przy długości fali 490 nm za pomocą czytnika mikropłytek. Jako kontroli użyto przeciwciała z grupy kontrolnej w analogicznych rozcieńczeniach. Wszystkie pomiary wykonano w dwóch powtórzeniach (fig. 4). P r z y k ł a d 5. Określenie limitu detekcji białka PSA techniką western blott przez przeciwciała IgY W celu określenia limitu detekcji białka PSA w technice western blotting w pierwszym etapie wykonano rozdział elektroforetyczny (SDS PAGE, 4% 12%) białka PSA w warunkach redukujących w zakresie od 100 ng do 0,5 ng/studzienkę. Następnie wykonano transfer białek na membranę nitrocelulozową. Po zablokowaniu wolnych miejsc wiążących przy użyciu 5% roztworu mleka odtłuszczonego w buforze PBST membranę inkubowano z roztworem otrzymanego specyficznego wobec białka PSA przeciwciała IgY o stężeniu 10 ug/ml (0,5% mleko/pbst). Detekcję kompleksów białka PSA z przeciwciałami IgY przeprowadzono przy użyciu przeciwciała króliczego anty-igy skoniugowanego z peroksydazą chrzanową przy zastosowaniu chemiluminescencyjnego substratu. Analizę obrazów wykonano przy zastosowaniu systemu obrazowania molekularnego zaopatrzonego w kamerę CCD (fig. 5). P r z y k ł a d 6. Miano przeciwciał IgY specyficznych wobec białka PSA W celu określenia zakresu stężeń otrzymanych przeciwciał klasy IgY w technice western blotting niezbędnego do detekcji białka PSA wykonano analizę techniką western blotting (100 ng białka PSA). Po transferze białek na membranę nitrocelulozową i blokowaniu wolnych miejsc paski membrany inkubowano z roztworami specyficznego wobec białka PSA przeciwciała IgY w stężeniach w zakresie od 10 do 0,05 g/ml. Po wypłukaniu pasków membrany buforem PBST detekcję związanych

PL 223 641 B1 5 z antygenem specyficznych przeciwciał przeprowadzono przy użyciu przeciwciała króliczego anty-igy skoniugowanego z peroksydazą chrzanową przy zastosowaniu chemiluminescencyjnego substratu. Analizę obrazów wykonano przy zastosowaniu systemu obrazowania molekularnego zaopatrzonego w kamerę CCD (fig. 6). P r z y k ł a d 7. Izolacja monospecyficznych poliklonalnych przeciwciał IgY Jako stałego nośnika białka w metodzie chromatografii powinowactwa użyto -aminobutylo agarozy (5,2 mol/ml). W pierwszym etapie grupy aminowe nośnika podstawiono grupami S-acetylotiooctowymi przy użyciu N-bursztynimido-S-acetylotiooctanu, a następnie usunięto grupę 5-acetylową przy zastosowaniu 0,5M roztworu hydroksyloaminy w buforze PBS zawierającego 25 mm EDTA. Wolne grupy tiolowe nośnika zmodyfikowano heterodwufunkcyjnyrn łącznikiem GMBS (10-krotny nadmiar molowy) i po wypłukaniu nadmiaru łącznika zawiesinę nośnika w buforze PBS inkubowano z białkiem PSA, Reakcję prowadzi się w czasie 2 6h w temperaturze pokojowej delikatnie mieszając. Reakcję przerywa się następnie 1M roztworem glicyny i całość przemywa się buforem PBS. Na tak przygotowane złoże (75 l) nanosi się mieszaninę poliklonalnych przeciwciał IgY specyficznych wobec białka PSA (200 l) i przemywa buforem PBS. Po wypłukaniu niezwiązanych przeciwciał na szczyt kolumny nanosi się bufor cytrynianowy (20 mm, ph 2,5) w ilości 500 l i neutralizuje każdą frakcję przy użyciu 1M buforu Tris-base (ph 8,5). Obecność przeciwciał w zebranych frakcjach potwierdza się przy zastosowaniu elektroforezy (SDS PAGE, warunki nieredukujące) oraz barwienia srebrem (fig. 7). W celu określenia immunoreaktywności otrzymanych przeciwciał wobec białka PSA wykonuje się test western blotting w sposób opisany powyżej. Na studzienki żelu poliakrylamidowego nanosi się białko PSA w ilości 100 ng/studzienkę. Po przeprowadzonym rozdziale elektroforetycznym przeprowadza się półsuchy transfer białek na membranę nitrocelulozową i wolne miejsca wiążące blokuje się 5% roztworem mleka odtłuszczonego w buforze PBST (4 C, 12h). Po wypłukaniu membrany buforem PBST detekcję białka PSA przeprowadza się przy użyciu otrzymanych przeciwciał IgY o specyficzności anty- -PSA z frakcji zebranych podczas wykonywania chromatografii powinowactwa. W tym celu przeciwciała z wybranych frakcji (w których zostało oznaczone stężenie przeciwciał) rozcieńcza się do stężenia 1 g/ml w 0,5% roztworze mleka odtłuszczonego w buforze PBST i inkubuje z paskami membrany nitrocelulozowej zawierającej przeniesione z żelu poliakrylamidowego białko PSA (37 C, 1h). Po wypłukaniu membrany buforem PBST detekcję związanych z białkami specyficznych przeciwciał przeprowadzono przy użyciu przeciwciała króliczego anty-igy skoniugowanego z peroksydazą chrzanową przy zastosowaniu chemiluminescencyjnego substratu. Analizę obrazów wykonano przy zastosowaniu systemu obrazowania molekularnego zaopatrzonego w kamerę CCD (fig. 8). P r z y k ł a d 8. Ultraczuły test immunoenzymatyczny fazy stałej do detekcji białka PSA. W celu określenia obecności białka PSA przygotowano test ELISA podwójnego wiązania (typu sandwich"). W tym celu płytkę mikrotitracyjną opłaszczono roztworem handlowo dostępnych mysich monoklonalnych przeciwciał anty-psa (różne klony, oznaczone jako klon A i B) w stężeniu 2 ug/ml w buforze węglanowym o ph 9,6. Następnie inkubowano z 5% roztworem mleka odtłuszczonego w buforze fosforanowym zawierającym 0,05% ( / ) Tween-20. Po odmyciu czynnika blokującego na studzienki płytki mikrotitracyjnej nałożono białko PSA w rozcieńczeniach od 10 ng/ml do 10 pg/ml w buforze PBST, ph 7,4 i inkubowano przez godzinę w 37 C. Następnie inkubowano z roztworem przeciwciał IgY specyficznych wobec białka PSA oczyszczonych metodą chromatografii powinowactwa w sposób opisany powyżej lub roztworem przeciwciał kontrolnych, w stężeniu 2 g/ml przygotowanych w roztworze 0,5% mleka odtłuszczonego w buforze PBST. Detekcję kompleksów białka PSA z przeciwciałami IgY przeprowadzono przy użyciu przeciwciała króliczego anty-igy skoniugowanego z peroksydazą chrzanową przy zastosowaniu O-fenylenodiaminy jako chromogenicznego substratu. Pomiaru absorbancji dokonano przy długości fali 490 nm za pomocą czytnika mikropłytek. Dla porównania użyto poliklonalnych przeciwciał lgg króliczych specyficznych wobec białka PSA. Wszystkie pomiary wykonano w dwóch powtórzeniach (fig. 9). P r z y k ł a d 9. Zakres liniowości ultraczułego testu immunoenzymatycznego fazy stałej do detekcji białka PSA W celu określenia zakresu liniowości ultraczułego testu immunoenzymatycznego fazy stałej, płytkę mikrotitracyjną opłaszczono roztworem mysich monoklonalnych przeciwciał anty-psa pochodzących z dwóch różnych klonów A i B w stężeniu 2 g/ml w buforze węglanowym o ph 9,6. Następnie inkubowano z 5% roztworem mleka odtłuszczonego w buforze fosforanowym zawierającym 0,05% ( / ) Tween-20. Po odmyciu czynnika blokującego na studzienki płytki mikrotitracyjnej nałożono białko PSA w rozcieńczeniach od 500 pg/ml do 10 pg/ml w buforze PBST, ph 7,4 i inkubowano przez

6 PL 223 641 B1 godzinę w 37 C. Następnie inkubowano z roztworem przeciwciał specyficznych wobec białka PSA oczyszczonych na kolumnie chromatograficznej oraz przeciwciał kontrolnych w stężeniu 2 g/ml w roztworze 0,5% mleka odtłuszczonego w buforze PBST. Detekcję kompleksów białka PSA z przeciwciałami IgY przeprowadzono przy użyciu przeciwciała króliczego anty-igy skoniugowanego z peroksydazą chrzanową przy zastosowaniu O-fenylodiaminy jako chromogenicznego substratu. Pomiaru absorbancji dokonano przy długości fali 490 nm za pomocą czytnika mikropłytek. Jako kontroli użyto przeciwciała z grupy kontrolnej w analogicznym rozcieńczeniu. Wszystkie pomiary wykonano w dwóch powtórzeniach (fig. 10). P r z y k ł a d 10. Zastosowanie przeciwciał IgY w detekcji białka PSA w moczu W celu detekcji białka PSA w moczu pacjenta z podejrzeniem nowotworu gruczołu krokowego, mocz doprowadza się do ph = 7,0, poddaje się wirowaniu (4500 g, 30 minut, 4 C), a następnie poddaje się rozdziałowi elektroforetycznemu w warunkach redukujących (SDS PAGE, 4 12%), po czym przeprowadza się blotting na membranę nitrocelulozową. Jako kontroli używa się czysty antygen PSA w ilości 100 ng/studzienkę oraz próbkę moczu osoby zdrowej. Po transferze białek na membranę nitrocelulozową i blokowaniu wolnych miejsc paski membrany inkubowano z roztworami specyficznego wobec białka PSA przeciwciała IgY w stężeniu 2 g/ml lub przeciwciałami IgY pochodzącymi z grupy kontrolnej (2 g/ml). Po wypłukaniu pasków membrany buforem PBST detekcję związanych z antygenem specyficznych przeciwciał przeprowadzono przy użyciu przeciwciała króliczego anty-igy skoniugowanego z peroksydazą chrzanową przy zastosowaniu chemiluminescencyjnego substratu. Analizę obrazów wykonano przy zastosowaniu systemu obrazowania molekularnego zaopatrzonego w kamerę CCD (fig. 11). Strzałkami oznaczono nacięte formy białka PSA (tzw. nicked) obecne w analizowanej próbce. P r z y k ł a d 11. Zastosowanie przeciwciał IgY w detekcji białka PSA w surowicy W celu detekcji białka PSA we krwi, pobiera się krew tętniczą i po wykrzepieniu wiruje się (4500 g, 30 min, 4 C) w celu otrzymania surowicy. Następnie na płytkę mikrotitracyjną opłaszczoną mysim przeciwciałem monoklonalnym (klon B) jak opisano powyżej w przykładzie 7 nanosi się standard PSA w zakresie od 10 ng/ml do 0,01 ng/ml oraz surowicę pacjenta (rozcieńczoną 10x) oraz surowicę kontrolną (rozcieńczoną 10x) uzyskaną od osoby zdrowej. Kolejne etapy testu wykonuje się tak, jak opisano w przykładzie 7. Uzyskane wyniki przedstawione są na fig. 12. P r z y k ł a d 12. Przykład zastosowania przeciwciał IgY w detekcji białka PSA w moczu W celu detekcji białka PSA moczu, pobiera się mocz, doprowadza do ph=7 i wiruje (4500 g, 30 min. 4 C) otrzymując supernatant. Następnie na płytkę mikrotitracyjną opłaszczoną mysim przeciwciałem monoklonalnym (klon B) jak opisano powyżej w przykładzie 7 nanosi się standard PSA w zakresie od 10 ng/ml do 0,01 ng/ml oraz mocz pacjenta (rozcieńczony 10x) oraz kontrolnie mocz osoby zdrowej (rozcieńczony 10x). Kolejne etapy testu wykonuje się tak, jak opisano w przykładzie 7. Uzyskane wyniki przedstawione są na fig. 13. Zastrzeżenia patentowe 1. Ultraczuły test diagnostyczny do detekcji antygenu PSA, znamienny tym, że zawiera układ mysich monoklonalnych przeciwciał IgG w postaci testu typu ELISA wychwytujących antygen oraz kurzych poliklonalnych przeciwciał IgY specyficznych wobec docelowego antygenu PSA. 2. Ultraczuły test według zastrz. 1, znamienny tym, że jest w postaci testu typu ELISA do detekcji antygenu PSA w surowicy ludzkiej i moczu. 3. Ultraczuły test według zastrz. 1, znamienny tym, że jest w postaci testu typu western blotting do detekcji antygenu PSA w moczu.

PL 223 641 B1 7 Rysunki

8 PL 223 641 B1

PL 223 641 B1 9

10 PL 223 641 B1 Departament Wydawnictw UPRP Cena 2,46 zł (w tym 23% VAT)