Transformacja pośrednia składa się z trzech etapów: 1. Otrzymanie pożądanego odcinka DNA z materiału genetycznego dawcy 2. Wprowadzenie obcego DNA do wektora 3. Wprowadzenie wektora, niosącego w sobie DNA dawcy do komórek biorcy, w taki sposób by DNA dawcy połączył się trwale z DNA biorcy
Wektor transformacji - niewielka cząsteczka DNA mająca zdolność przenoszenia obcego DNA oraz zdolność do autonomicznej replikacji.
Cechy dobrego wektora: 1. Dobrze poznany biologicznie i genetycznie 2. Zawiera pojedyncze miejsce restrykcyjne rozpoznawane przez przynajmniej jeden enzym restrykcyjny 3. Posiada geny tzw. markerów selektywnych 4. Miejsce restrykcyjne nie może znajdować się w pobliżu genów markerów selektywnych 5. Posiada co najmniej jedną sekwencję startu replikacji 6. Posiada gen tzw. replikacji luźnej 7. Nie zawiera genów stanowiących zagrożenie dla człowieka lub środowiska
Figure 2.17 Genomes 3 ( Garland Science 2007)
Figure 2.18 Genomes 3 ( Garland Science 2007)
Przygotowanie wektora transformacji DNA wektora rekombinacja in vitro 1. Trawienie tym samym enzymem restrykcyjnym DNA dawcy 2. Ligacja 3. Namnażanie Wektor zrekombinowany z insertem
Figure 2.15 (part 2 of 3) Genomes 3 ( Garland Science 2007)
Figure 2.15 (part 3 of 3) Genomes 3 ( Garland Science 2007)
Metoda transformacji roślin za pomocą Agrobacterium Agrobacterium tumefaciens plazmid Ti (tumor inducing) choroba guzowatość korzeni (crown-gall) Agrobacterium rhizogenes plazmid Ri (root inducing) choroba włosowatość korzeni (hairy-gall)
Guzowate narośla (tumory) wywołane infekcją Agrobacterium tumefaciens
Schemat budowy plazmidu Ti LB i RB T-DNA Rejon vir ori KO tra
Cechy charakterystyczne T-DNA: 1. Ma zdolność trwałej integracji z genomem rośliny 2. Za przeniesienie i integrację T-DNA odpowiedzialne są sekwencje graniczne (LB i RB), które mają identyczną budowę i wyróżniają się zachowawczą lokalizacją we wszystkich typach plazmidów Agrobacterium 3. Usunięcie fragmentu DNA plazmidowego z obszaru między sekwencjami granicznymi i wstawienie w to miejsce DNA dawcy, nie zakłóca procesów przeniesienia i integracji T- DNA z DNA rośliny 4. Stanowi 5-10% DNA plazmidu
Markery Marker genetyczny gen występujący przynajmniej w dwóch łatwo rozróżnialnych postaciach (allelach), dziedziczenie którego można śledzić w czasie krzyżówki genetycznej, co umożliwia ustalenie pozycji genu na mapie
Cechy dobrego markera: 1. Silny polimorfizm (obecność wielu form allelicznych) 2. Dziedziczenie kodominujące 3. Wysoka frekwencja i równomierne rozłożenie w genomie 4. Neutralność selekcyjna (brak sprzężenia z genami obniżającymi płodność) 5. Wysoka powtarzalność 6. Prosta i szybka metoda wykrywalności
Rodzaje markerów 1. Markery cech morfologicznych 2. Markery molekularne Izoenzymy Markery DNA
Izoenzymy rozmaite molekularne formy enzymów o podobnej bądź identycznej specyficzności wobec substratu, występujące w tym samym organiźmie. Wg. Merket`a i Moller`a są to odmienne formy molekularne enzymów otrzymanych podczas separacji różnymi technikami rozdzielczymi.
Typy A i E reprezentują dwie homozygotyczne formy rodzicielskie izozymów o różnej ruchliwości elektroforetycznej. A B D E Typy B i D przedstawiają możliwe formy heterozygotyczne izozymów. Typ B otrzymujemy w przypadku, gdy badany enzym jest monomeryczny. Typ C spotykamy w przypadku, gdy badany enzym jest dimerem. Pośredni prążek powstaje z jednej podjednostki typu A i z jednej typu E oraz wykazuje pośrednią ruchliwość Typ D obrazuje cetramer. Trzy pośrednie prążki powstają przez elektroforetyczną. połączenie w różnych kombinacjach podjednostek typu A i E.
Marker DNA Sekwencja DNA występująca w dwóch lub większej liczbie łatwych do rozróżnienia wersji i której z tego powodu można użyć do zaznaczenia pozycji na mapie
Rodzaje markerów DNA Oparte na procesie hybrydyzacji: RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) Fingerprinting na bazie oligonukleotydów
Rodzaje markerów DNA Oparte na PCR (Polymerase Chain Reaction) RAPD STS CAPS AFLP
RAPD - random amplified polymorphic DNA (losowo amplifikowany polimorficzny DNA) reakcja PCR z jednym tylko starterem (12 nukleotydowy lub krótszy), który przyłącza się w sposób losowy do komplementarnych miejsc w zdenaturowanym DNA rezultat - wiele odcinków DNA, które rozdzielane są elektroforetycznie, a każdemu odcinkowi odpowiada jeden locus
STS ( sequence-tagged site) - miejsce znaczone sekwencyjnie stanowi unikatową w obrębie genomu, krótką sekwencję (ok. 200-300 pz) identyfikującą specyficzny locus amplifikacja STS wymaga zastosowania dwóch starterów długości ok. 20 nukleotydów produkt - jeden prążek na żelu elektroforetycznym (unikatowy region genomu), odpowiadający wielkością wyznaczonemu do amplifikacji fragmentowi
RFLP - polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych Trawienie genomowego DNA enzymem restrykcyjnym o specyficznym miejscu rozpoznania Rozdział elektroforetyczny produktów trawienia
RFLP
RFLP - polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych znakowanie radioaktywnymi cząstkami lub fluorochromami specyficznych sekwencji nukleotydów (sond) hybrydyzacja w celu identyfikacji genów lub określonych sekwencji