Ćwiczenie A-4 Metody rozdzielania i oczyszczania substancji chemicznych. Wymagania teoretyczne: 1. Metody rozdzielania i oczyszczania substancji: a) Krystalizacja b) Ekstrakcja c) Sublimacja d) Destylacja e) Chromatografia 2. Podstawy procesu rozdzielania w metodach chromatograficznych. 3. Podział metod chromatograficznych ze względu na fazę rozdzielczą. 4. Chromatografia cienkowarstwowa TLC. Literatura: T. Lipiec, Z. Szmal - Chemia analityczna z elementami analizy instrumentalnej. Praca zbiorowa pod red. P. Kowalskiego Laboratorium chemii organicznej techniki pracy i zasady bhp. Pytania treningowe: 1. Na czym polega krystalizacja? Do czego ona służy? 2. Co to jest ekstrakcja? Podaj podstawy teoretyczne procesu. 3. Czym różni się ekstrakcja od chromatografii? 4. Co to jest chromatografia? 5. Czym różni się chromatografia TLC od chromatografii kolumnowej? 6. Opisz kolejne etapy wykonania chromatogramu TLC. 7. Co to jest współczynnik R f i do czego on służy? Część teoretyczna: Podczas przeprowadzania reakcji chemicznych, niestety niemal zawsze obserwuje się niemały udział reakcji ubocznych. Stanowi to poważną trudność przy wyodrębnianiu czystych substancji z mieszaniny reakcyjnej. W niektórych przypadkach dochodzi do utworzenia jednocześnie kilku określonych związków chemicznych, które trzeba od siebie oddzielić, w innych z kolei chodzi o oddzielenie związku, możliwie bez strat, od niepożądanych produktów towarzyszących, często oleistych lub smolistych. Preparat, który zamierzamy uzyskać musi być oczyszczony z całą starannością od niepożądanych związków towarzyszących. Do tego celu służą między innymi: a. krystalizacja b. ekstrakcja c. sublimacja d. destylacja: prosta, próżniowa, frakcyjna e. chromatografia. I. Ekstrakcja Polega na wydzieleniu jednego z kilku składników z mieszaniny substancji stałych lub ciekłych za pomocą odpowiednio dobranych rozpuszczalników. Proces ten nie powinien powodować zmian chemicznych ekstrahowanej substancji. Rozpuszczalnik nie może reagować ani z substancją ekstrahowaną ani innymi znajdującymi się w mieszaninie. Należy dobierać taki rozpuszczalnik który rozpuszcza tylko żądany składnik a pozostałych nie rozpuszcza. Rozpuszczalnik powinien być czysty i po odparowaniu nie może pozostawić żadnych pozostałości. Ekstrakcję przeprowadza się w temperaturze pokojowej lub w temperaturze wrzenia rozpuszczalnika. Na ogół stosuje się rozpuszczalnik o niskiej temperaturze wrzenia: eter etylowy, eter izopropylowy, eter naftowy, benzyna, chloroform itp. Ekstrakcja ma zastosowanie przede wszystkim do rozdzielania substancji organicznych. Do ekstrahowania substancji nieorganicznych jako rozpuszczalnika stosuje się najczęściej wodę. 1
Ilościową zależność rozdziału przez ekstrakcję określa prawo podziału zgodnie, z którym substancja rozpuszczona dzieli się między dwa nie mieszające się rozpuszczalniki tak, że w stanie równowagi stosunek stężeń substancji rozpuszczonej w tych dwu rozpuszczalnikach jest stały w danej temperaturze i nie zależy od ogólnego stężenia substancji. Stosunek ten wyraża stała podziału P, którą opisuje równanie: c0 P Przy czym c o i c w oznaczają stężenia danego składnika w rozpuszczalniku i w roztworze wodnym. Prawo podziału jest słuszne, a stała podziału P ma wartość niezmienną tylko wtedy, gdy rozpuszczona substancja znajduje się w obydwu fazach w takiej samej postaci. Metody ekstrakcji: A) Ekstrakcja z roztworów- nie jest procesem ciągłym i wykonuje się je rozdzielaczach Pojemność rozdzielacza powinna być 2 razy większa niż objętość roztworu, natomiast ilość rozpuszczalnika powinna stanowić ok. 1/3 objętości roztworu ekstrahowanego. Początkowo, wytrząsanie prowadzimy ostrożnie, aby nie dopuścić do gwałtownego wzrostu prężności par rozpuszczalnika w rozdzielaczu. Co pewien czas należy wyrównać ciśnienie przez otwarcie zaworu odpowietrzającego lub też poprzez odwrócenie rozdzielacza nóżką ku górze i otwarcie kranu. Po wytrząsaniu, pozostawiamy rozdzielacz w celu rozdzielenia warstw nie mieszających się cieczy. B) Ekstrakcja z mieszaniny substancji stałych -jest to proces ciągły i wykonuje się go w specjalnym aparacie Soxhleta. II. Sublimacja Polega na ogrzewaniu substancji stałej i przeprowadzenie jej w stan gazowy a następnie przez oziębienie par ponownie w stan stały z pominięciem stanu ciekłego. Metodę tą stosuje się do oczyszczania oraz do wydobywania z mieszaniny substancji która przechodząc w gaz nie topi się np.: jod, naftalen, bezwodnik ftalowy. Temperatura sublimacji musi być niższa od temperatury topnienia oraz od temperatury rozkładu danej substancji. Stosując sublimacje do oczyszczania można osiągnąć duży stopień czystości. Poprzez sublimacje można też oddzielać od takich zanieczyszczeń od których jest trudno je rozdzielić np. przez krystalizacje. Ze względu na to że niewiele substancji sublimuje metodę tą stosuje się rzadko. III. Krystalizacja Jest to najczęstszy stosowany sposób oczyszczania substancji stałej. Polega ono na wykorzystaniu różnej rozpuszczalności substancji i jej zanieczyszczeń w odpowiednio dobranym rozpuszczalniku. Etapy przeprowadzania krystalizacji: 1. Substancje rozpuszcza się w gorącym rozpuszczalniku. 2. Otrzymany roztwór przesącza się na gorąco oddzielając w ten sposób substancje od nierozpuszczalnych zanieczyszczeń. 3. Otrzymany przesącz oziębia się pod zimną wodą, celem wykrystalizowania substancji z roztworu. 4. Otrzymane kryształki odsącza się i suszy. Dobór rozpuszczalnika zależy od właściwości rozpuszczanej substancji. Powinien spełniać następujące warunki: - Nie powinien reagować ze substancją. - Powinien dobrze rozpuszczać na gorąco a źle na zimno - Zanieczyszczenia powinny być praktycznie nierozpuszczalne - Oczyszczana substancja powinna łatwo z niego krystalizować - Powinien być łatwy do usuwania z powierzchni kryształów c w IV. Destylacja 2
Jest to metoda rozdziału składników cieczy. Polega ona na przeprowadzeniu ich w stan pary poprzez ogrzanie do temperatury wrzenia, a następnie na oziębieniu, skropleniu i zebraniu w postaci destylatów. W laboratoriach analitycznych destylacja stosowana jest do: - rozdzielania mieszanin ciekłych - oznaczania składu mieszanin ciekłych - identyfikacja ciekłych substancji organicznych - oczyszczanie cieczy - określenia stopnia oczyszczenia związków chemicznych Rozdzielenie mieszaniny jest tym łatwiejsze im większa jest różnica temperatur wrzenia jej składników. Temperatura wrzenia pod określonym ciśnieniem (760ml Hg) jest wielkością stałą dla danego związku chemicznego. Metody destylacji: 1) Destylacja zwykła Przeprowadza się wówczas gdy cieczy nie grozi rozkład w temperaturze wrzenia i gdy temperatura ta nie jest zbyt wysoka. Aparat do destylacji tej składa się z: kolby destylacyjnej, chłodnicy, odbieralnika, termometru i źródła ciepła. Aby zapobiec przegrzaniu cieczy do kolby dodaje się nieco potłuczonej porcelanki tzw. szamotki. 2) Destylacja frakcyjna Polega na zbieraniu poszczególnych frakcji do oddzielnych odbiorników. Każda frakcja ma inną temperaturę wrzenia. Konieczna jest ciągła kontrola temperatury (np. destylacja frakcyjna ropy naftowej). 3) Destylacja próżniowa Stosowana jest do rozdzielania cieczy które są nietrwałe w wyższych temperaturach. W takich przypadkach stosuje się rozrzedzenie par w temperaturze. Stosując rozrzedzenie par w destylacji do wartości ok. 10-20 mm Hg uzyskuje się obniżenie temperatury wrzenia o 80-100ºC. Rozrzedzenie tego rzędu stosuje się przy użyciu pompki wodnej. Chcąc uzyskać większe rozrzedzenie stosuje się specjalne pompki olejowe. Warunkiem przeprowadzenia tego typu destylacji jest szczelność aparatury. W porównaniu do poprzedniej metody zestaw destylacyjny należy zwiększyć o manometr, kolbę próżniową i pompkę wodną. 4) Destylacja z parą wodną Stosowana jest do wydzielania z mieszaniny ciekłej składników nie mieszających się z wodą. Warunkiem jest jednak aby składnik ten był lotny z parą wodną. Zestaw aparatury należy uzupełnić w kociołek do wytwarzania pary wodnej 3
Chromatografia jako metoda wyodrębniania i oczyszczania związków chemicznych. Chromatografia to technika analityczna lub preparatywna służąca do rozdzielania, identyfikacji i oznaczania substancji, czyli badania składu mieszanin związków chemicznych. Podstawy techniki chromatograficznej powstały na początku XX wieku w Warszawie w wyniku badań rosyjskiego chemika i biologa Michaiła Cwieta. Zajmował się on badaniem barwników roślinnych. Podczas przepuszczania roztworu zielonych barwników roślinnych przez kolumnę (rurkę szklaną) wypełnioną kredą (węglan wapnia), Cwiet uzyskał rozdział barwników w postaci szeregu poziomych barwnych pasm o barwie zielonej i żółtej. Ponieważ Cwiet rozpoznał i prawidłowo zinterpretował proces rozdziału, jest on powszechnie uważany za wynalazcę tej techniki. Terminu chromatografia użył dla określenia barwnych stref obserwowanych na kolumnie kredowej podczas rozdziałów (gr. chromatos = barwa + grapho = pisze). Układ chromatograficzny składa się z trzech zasadniczych elementów: fazy stacjonarnej nieruchoma warstwa substancji o rozwiniętej powierzchni, fazy ruchomej zwanej eluentem przepływający przez fazę stacjonarną strumień rozpuszczalników lub gazu, substancji rozdzielanej.,podstawą rozdziału chromatograficznego, niezależnie od techniki chromatograficznej jest proces podziału składników rozdzielanej mieszaniny, pomiędzy dwie nie mieszające się ze sobą fazy: stacjonarną i ruchomą. Rozdział substancji następuje w wyniku przepuszczenia roztworu badanej mieszaniny przez specjalnie spreparowaną fazę rozdzielczą (złoże), zwaną też fazą stacjonarną. Fazą rozdzielczą są substancje wykazujące właściwości sorpcyjne w stosunku do substancji przepływających. Jednocześnie podczas przepływu fazy ruchomej eluentu, przez fazę rozdzielczą następuje proces wymywania zaadsorbowanych (lub związanych) składników badanej substancji (rozdzielanej). Intensywność tego procesu jest różna dla poszczególnych składników mieszaniny. Jedne składniki są więc zatrzymywane w fazie dłużej, a inne krócej, dzięki czemu może następować ich rozdział. Czas przebywania danego składnika w kolumnie określany jest mianem czasu retencji Tr i jest podstawowym parametrem umożliwiającym identyfikację (analizę jakościową). Rozróżnia się następujące techniki chromatograficzne: I. W zależności od rodzaju fazy ruchomej: chromatografia cieczowa- w której eluentem jest ciekły rozpuszczalnik lub mieszanina rozpuszczalników, chromatografia gazowa - w której eluentem jest gaz (zwykle hel, argon lub wodór, czasem azot), chromatografia nadkrytyczna - w której eluentem jest gaz w stanie nadkrytycznym. II. W zależności od rodzaju i sposobu przygotowania fazy rozdzielczej: TLC - Thin Layer Chromatography, chromatografia cienkowarstwowa - w której fazę rozdzielczą stanowi cienka warstwa fazy stałej naniesiona na sztywną płytkę. Na tak spreparowaną płytkę nanosi się próbkę roztworu, po czym na skutek działania sił kapilarnych, grawitacji lub pola elektrycznego następuje przepływ i rozdział mieszaniny, chromatografia bibułowa - w której fazę rozdzielczą stanowi pasek lub arkusz bibuły filtracyjnej lub specjalnego typu bibuły chromatograficznej, chromatografia kolumnowa - w której faza rozdzielcza jest umieszczona w specjalnej kolumnie, przez którą przepuszcza się następnie roztwór badanej mieszaniny. Przepływ roztworu przez kolumnę można wymuszać grawitacyjnie lub stosując różnicę ciśnień na wlocie i wylocie kolumny, chromatografia powinowactwa - w której odpowiednio spreparowana faza rozdzielcza jest zdolna do oddziaływań chemicznych o zmiennym powinowactwie wobec rozdzielanych substancji, chromatografia jonowymienna - w której substancje oddziałują ze złożem za pomocą oddziaływań jonowych. Chromatografia cienkowarstwowa 4
Różne techniki chromatograficzne wykorzystują dwa zjawiska: podziału substancji między dwie różne fazy ciekłe obowiązuje tu prawo podziału Nernsta i adsorpcji substancji na nośniku, czyli fazie stałej. Znana od kilkudziesięciu lat chromatografia cienkowarstwowa - TLC (z angielskiego: thin layer chromatography) łączy w sobie obydwa te zjawiska, gdyż polega ona na poruszaniu się substancji organicznych z różną prędkością wraz z ruchomą fazą ciekłą przez cienką warstwę stałego adsorbenta naniesionego na płytkę szklaną, blaszkę aluminiową lub podłoże plastikowe. Towarzyszą temu procesy adsorpcji i desorpcji oraz podział między ciekłą fazę organiczną i wodę, która w niewielkich ilościach znajduje się na nośniku. Różnicowanie nośników (np. tlenek glinu, żel krzemionkowy, celuloza) oraz rozpuszczalników (lub ich kombinacji), czyli tzw. układów rozwijających, pozwala na rozdział mieszanin związków oraz ich identyfikację. Sposób postępowania w analitycznej chromatografii cienkowarstwowej jest prosty. Polega on na naniesieniu kapilarą roztworów badanych substancji na płytki pokryte adsorbentem w odległości około 1 cm od brzegu płytki, którą następnie zanurza się tym końcem w niewielkiej ilości rozpuszczalnika umieszczonego w zamykanej komorze rozwijającej, której ścianki wyłożone są bibułą. Wznoszący się rozpuszczalnik rozwija chromatogram. W momencie kiedy czoło rozpuszczalnika osiągnie zaznaczoną wcześniej na płytce linię mety, wyjmuje się płytkę z komory, suszy ją i analizuje chromatogram. Jeśli rozdział dotyczy substancji barwnych, ich plamki na chromatogramie są łatwo dostrzegalne. W przypadku substancji bezbarwnych, plamki chromatogramu wywołuje się np. przez spryskiwanie płytki substancjami dającymi ze związkami badanymi reakcje barwne (np. kwasem siarkowym(vi)), przez umieszczenie płytki w komorze wypełnionej parami jodu, które zabarwiają plamki lub obserwację płytek w świetle ultrafioletowym wywołującym fluorescencję. Poniższy rysunek przedstawia kolejne etapy wykonywania chromatogramu. Wielkością charakteryzującą przesuwanie się badanej substancji w systemie adsorbent - układ rozwijający, czyli położenie plamki na chromatogramie, jest współczynnik Rf definiowany następująco: droga przebyta przez substację R f droga przybyta przez rozpuszczanik Część praktyczna Ćwiczenie 1 Sublimacja jodu. Około 0,5 g jodu wsypać do czystej zlewki, przykryć ją szczelnie kolbą okrągłodenną z zimną wodą. Zlewkę ogrzewać palnikiem spirytusowym. Opisać obserwowane zjawisko. 5
Ćwiczenie 2 Ekstrakcja fioletu krystalicznego. Ekstrakcja pojedyncza Rozpuścić kryształek fioletu krystalicznego w 30 cm 3 wody. Podzielić roztwór na dwie równe części. Umieścić czysty, suchy i uprzednio nasmarowany rozdzielacz na 125 cm 3 na kółku i wlać do niego, przy zamkniętym kranie, pierwszą porcję roztworu fioletu krystalicznego i 15ml chloroformu. Rozdzielacz zamknąć starannie korkiem, odwrócić go i otworzyć kran dla wyrównania ciśnienia. Zamknąć kran wstrząsać rozdzielacz ostrożnie przez chwilę i z powrotem otworzyć kran w celu wyrównania ciśnienia. Następnie zamknąć kran, wytrząsać energicznie przez 1 minutę, a następnie po odwróceniu, umieścić rozdzielacz na kółku. Usunąć korek z rozdzielacza i pozostawić mieszaninę do rozdzielenia na dwie wyraźne warstwy. Spuścić dolną warstwę chloroformu do zlewki, a warstwę wodną wylać górną częścią rozdzielacza do drugiej zlewki. Ekstrakcja wielokrotna Ekstrahować w rozdzielaczu o pojemności 60 cm 3, drugą porcję początkowego roztworu fioletu krystalicznego, trzema oddzielnymi porcjami chloroformu o objętości 5 cm 3 każda. Połączyć trzy wyciągi (ekstrakty) chloroformowe i przenieść do trzeciej zlewki, a ekstrahowany roztwór wodny przelać górną częścią rozdzielacza do probówki zlewki. Porównać intensywność zabarwienia dwu roztworów chloroformowych, a następnie dwu roztworów wodnych. Porównać wyniki badań ekstrakcji pojedynczej i wielokrotnej. Wyciągnąć wnioski. Ćwiczenie 3 Analiza ekstraktów roślinnych za pomocą chromatografii cienkowarstwowej 1. Przygotowanie ekstraktu barwników roślinnych Odważ 1 g drobno pokrojonych liści pietruszki. Przenieś je do moździerza i ucieraj z 7 ml acetonu dodawanego porcjami. Zawartość moździerza przesącz przez sączek do małej zlewki. Zredukuj objętość rozpuszczalnika poprzez delikatne ogrzewanie suszarką. Otrzymany wyciąg stanowi materiał do chromatografii TLC i kolumnowej. 2. TLC: Celem ćwiczenia jest potwierdzenie przydatności chromatografii cienkowarstwowej do rozdziału barwników roślinnych zawartych w liściach pietruszki. Chromatograficzny rozdział barwników: Przygotować eluenty o następującym składzie objętościowym: a) heksan b) heksan: octan etylu 1:1 (v/v) c) heksan - alkohol etylowy bezwodny - toluen (4,0 : 0,45 : 1,5) (v/v) i wypełnić nimi komory chromatograficzne na wysokość ok 1 cm od dna. Pozostawić do ustalenia się warunków w komorach. Przygotować 3 płytki o szerokości około 2 cm i długości 5 cm. W odległości około 1 cm od dołu delikatnie zaznaczyć ołówkiem linię startu, na którą nanosić przy pomocy kapilary przygotowany ekstrakt roślinny. Po nałożeniu małej objętości odczekać chwilę aż miejsce nakładania podeschnie, po czym nałożyć w to samo miejsce kolejną porcję barwnika. Czynność powtórzyć 3 razy. Pozostawić płytkę do wyschnięcia na około 5 minut. Wysuszoną płytkę wstawić pionowo do komory chromatograficznej wypełnionej eluentem (wcześniej przygotowanym). Ilość eluentu powinna sięgać poniżej poziomu naniesionych ekstraktów barwników. Przykryć naczynie. Rozdział chromatograficzny prowadzić aż do momentu, gdy czoło rozpuszczalnika znajdzie się 0,5 cm przed górną krawędzią płytki. Uwaga: Nie należy pobrudzić, ani uszkodzić płytki; płytkę należy trzymać pincetą tylko za jej krawędź. Nakładać kolejne objętości kapilary tak, by tworzący się na płytce ślad miał średnicę nie większą niż 5 mm. Płytkę wyjąć z komory, pozostawić do wyschnięcia. Otrzymany chromatogram dołączyć do sprawozdania. Obliczyć współczynniki podziału R f dla każdej z substancji obecnej na chromatogramie. 6