RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 212543 (13) B1 Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (21) Numer zgłoszenia: 372564 (22) Data zgłoszenia: 03.02.2005 (51) Int.Cl. C12N 15/10 (2006.01) C12N 15/33 (2006.01) C12N 15/29 (2006.01) (54) Sekwencja nukleotydowa fragmentu genu polihedryny bakulowirusa i zastosowanie sekwencji nukleotydowej do detekcji bakulowirusów (43) Zgłoszenie ogłoszono: 07.08.2006 BUP 16/06 (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: 31.10.2012 WUP 10/12 (73) Uprawniony z patentu: UNIWERSYTET GDAŃSKI, Gdańsk, PL INSTYTUT BADAWCZY LEŚNICTWA, Warszawa, PL BURKIEWICZ ADAM BURKIEWICZ MIKOŁAJ A & A BIOTECHNOLOGY SPÓŁKA CYWILNA, Gdynia, PL (72) Twórca(y) wynalazku: BOGUSŁAW SZEWCZYK, Gdańsk, PL PIOTR BARSKI, Sopot, PL IWONA SKRZECZ, Warszawa, PL AGNIESZKA BRZOZOWSKA, Sopot, PL MARIA PALUSZEK, Elbląg, PL KRYSTYNA BIEŃKOWSKA-SZEWCZYK, Gdańsk, PL (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Andrzej M. Jaeszke PL 212543 B1
2 PL 212 543 B1 Opis wynalazku Przedmiotami wynalazku są konserwowana sekwencja nukleotydowa wchodząca w skład genu polihedryny bakulowirusa i zastosowanie sekwencji nukleotydowej do detekcji bakulowirusów. Wynalazek dotyczy wykrywania bakulowirusów w warunkach naturalnych ich występowania. Przedmioty wynalazku służą do stosowania oligonukleotydów komplementarnych do sekwencji genu polihedryny, przy pomiarze postępu zakażenia bakulowirusem stawonogów będących szkodnikami upraw roślinnych. Kontrola biologiczna może być zdefiniowana jako regulacja występowania gatunku, który osiągnął poziom określany jako szkodliwy dla środowiska poprzez inny gatunek dodany do środowiska w celu ograniczenia gatunku szkodliwego. W gospodarce rolniczej i leśnej kontrola biologiczna staje się coraz bardziej znaczącą gałęzią ochrony przed szkodnikami, a wielką zaletą tego typu ochrony jest ograniczenie stosowania mało specyficznych pestycydów chemicznych. Wprowadzanie pestycydów chemicznych do środowiska, mimo niewątpliwego postępu w tej dziedzinie polegającego na stosowaniu bardziej specyficznych i nietrwałych związków, jest szkodliwe z co najmniej z dwóch względów: aspekt zdrowotny - obecność pestycydów chemicznych i produktów ich rozpadu w pożywieniu i powietrzu może prowadzić do chorób i zatruć u ludzi, aspekt środowiskowy - stosowanie pestycydów chemicznych prowadzi do śmierci co najmniej kilkudziesięciu milionów ptaków rocznie, a ilość niszczonych owadów pożytecznych lub neutralnych dla biocenoz jest trudna do oszacowania. W ostatnim czasie obserwuje się pojawienie się oporności wśród owadów szkodliwych, w związku z czym metody oparte na wiedzy o ekologii i biologii rozwoju gatunków szkodliwych i ich naturalnych wrogów stają się coraz częściej stosowane. Dobór naturalnego wroga do kontroli gatunku szkodliwego, wymaga odpowiedniej wiedzy i współpracy biologów o różnych specjalnościach, w tym również biologów molekularnych. Od wielu lat metody biologiczne kontroli owadów szkodliwych są udoskonalane, ciągle jednak stanowią tylko kilka procent rocznej sprzedaży pestycydów chemicznych. Największe zastosowanie w biologicznym ograniczaniu liczebności owadów znalazły jak dotychczas chorobotwórcze mikroorganizmy takie jak bakterie, grzyby i wirusy, z najtańszym biopestycydem z pośród nich jest ciągle bakteria Bacillus thuringiensis (Bt), produkująca toksyny cry, ze względu na możliwość hodowli bakterii na tanich pożywkach płynnych. Bakulowirusy są najczęściej stosowaną grupą wirusów w ochronie biologicznej roślin, ponieważ ze względu na swoją specyficzność nie wywierają negatywnego wpływu na inne gatunki motyli, jak również na parazytoidy. W trakcie wykonywania zabiegów ochronnych bakulowirusy mogą być mieszane z insektycydami chemicznymi, co pozwala na zmniejszenie dawki chemicznego pestycydu przy zachowaniu jego pełnej skuteczności. Do niedawna rodzinę Baculoviridae dzielono na podrodzinę Eubaculovirinae do której zaliczano wirusy poliedrozy jądrowej i wirusy granulozy, oraz podrodzinę Nudibaculovirinae. Obecnie ta ostatnia podrodzina została wyłączona z rodziny Baculoviridae. Rodzina Baculoviridae zawiera obecnie tylko dwa rodzaje - wirusy poliedrozy i wirusy granulozy. Genom bakulowirusowy to dwuniciowa kolista cząsteczka DNA o wielkości od około 100-170 tysięcy par zasad. DNA wirusowe jest związane z małym zasadowym białkiem o masie cząsteczkowej około 7 kda. Genom otoczony jest białkowym kapsydem, na powierzchni którego znajdują się białka otoczkowe. W przypadku formy okluzyjnej wirusa, cząstki wirusów otoczone są grubą warstwą białka polihedryny. Bakulowirusy infekują przede wszystkim stadia larwalne owadów, a zakażenie następuje drogą jelitową. W cyklu rozwojowym bakulowirusów występują dwie formy wirionów: forma okluzyjna (OV) i forma pączkująca (BV zwana również EV). Formy te różnią się pomiędzy sobą morfologią oraz rolą w zakażaniu komórek. Forma OV tworzy ciała okluzyjne w jądrach zakażonych komórek. Po śmierci żywiciela forma ta służy do zakażania kolejnych gąsienic. Głównym białkiem formy OV jest polihedryna chroniąca wirusa przed niekorzystnym wpływem środowiska zewnętrznego. Gen kodujący polihedrynę jest najmniej zmiennym genem bakulowirusów, przy czym w obrębie tego genu niektóre sekwencje są praktycznie identyczne u wszystkich gatunków bakulowirusów. W zasadowym środowisku jelita gąsienic następuje uwolnienie wirusów z powłoki polihedrynowej. Zakażają one komórki jelita, gdzie zachodzi pierwotny rozwój wirusa i tworzenie form potomnych BV, które nie zawierają polihedryny. Mogą one zakażać kolejne komórki w obrębie całego ciała gąsienic (lub kolejne komórki w hodowli tkankowej). Bakulowirusy działają dość wolno; przeważnie śmierć larwy następuje 1-2 tygodni od zakażenia, chociaż okres ten będzie zależał od gatunku wirusa, gatunku żywiciela i temperatury otoczenia. W rozprzestrzenianiu się wirusa dużą rolę odgrywają pasożyty i parazytoidy owadów. Wek-
PL 212 543 B1 3 torami mogą być również ptaki i drobne ssaki odżywiające się larwami owadów. Uwolnione z ciała martwych gąsienic poliedry, mogą być też przenoszone przez wiatr i deszcz. Ochronne działanie polihedryny powoduje, że wirusy znajdujące się w glebie są zakaźne przez kilka a nawet kilkanaście lat. Głównym czynnikiem inaktywującym wirusa jest promieniowanie ultrafioletowe. Ekspresja genów bakulowirusa zachodzi w kilku kolejnych fazach: wczesnej (dzielonej często na fazę bardzo wczesną i wczesną opóźnioną), późnej i bardzo późnej. Faza późna (6-18 godzin po infekcji) charakteryzuje się ekspresją genów, których produkty uczestniczą w tworzeniu formy BV. W tej fazie syntetyzowane są strukturalne białka kapsydu i rdzenia. Syntetyzowana jest również glikoproteina o masie cząsteczkowej 67 kda, odgrywająca istotną rolę w zakażeniu wtórnym międzykomórkowym przez formę BV. Faza bardzo późna (okluzyjna) trwa od około 18 godzin do około 80 godzin po infekcji. W fazie tej następuje intensywna synteza polihedryny (masa cząsteczkowa około 30 kda), która może stanowić do 50% masy wszystkich białek w komórce. Bakulowirus produkuje kilkadziesiąt cząstek OV w jednym jądrze komórkowym. Drugim bardzo późnym białkiem jest białko p10, ale jego rola jest dużo słabiej poznana. Białko p10 tworzy struktury cytoszkieletowe w komórce oraz uczestniczy w uwalnianiu cząstek OV z komórek. Niektóre bakulowirusy są bardzo dobrze poznane od strony genetycznej, ponieważ są stosowane jako wektory do ekspresji obcych genów. Najczęściej stosowanym gatunkiem bakulowirusa do ekspresji obcych genów jest wirus jądrowej polihedrozy Autographa californica (Autographa californica nuclear polyhedrosis virus) oznaczany skrótem AcNPV (Summers M.D. i Smith G.E, Texas Agricult. Exp. Station Bull., 1987; 1555, 1-57). Dwuniciowa kolista cząsteczka DNA tego wirusa ma wielkość około 128 tysięcy par zasad. Drugim gatunkiem bakulowirusa często stosowanym do ekspresji obcych genów, jest wirus jądrowej polihedrozy jedwabnika morwowego (Bombyx mori nuclear polyhedrosis virus) oznaczony skrótem BmNPV. Jest on w około 90% identyczny na poziomie sekwencji nukleotydowej z AcNPV. Podobieństwo sekwencji nukleotydowej powoduje, że skład białkowy obydwu wirusów jest bardzo podobny, jednak nie mają one żadnego wspólnego gospodarza. Rozwój obydwu wirusów przebiega prawie tak samo, a jedyną zauważalną różnicą jest ilość upakowanych cząstek wirusowych w okluzjach polihedrynowych. AcNPV zaliczany jest do grupy oznaczonej jako MNPV (multiple nuclear polyhedrosis viruses), ponieważ upakowanych jest wiele cząstek wirusowych w jedną okluzję polihedrynową, BmNPV natomiast należy do grupy oznaczonej SNPV (single nuclear polyhedrosis virus) ponieważ uważa się, że cząstki wirusowe pakowane są pojedynczo w osłony polihedrynowe. Niektóre inne genomy bakulowirusowe zostały już w całości zsekwencjonowane (m.in. Anticarsia gemmatalis NPV i Lymantria dispar NPV), jednak dane dotyczące biologii molekularnej innych wirusów niż prototypowe AcNPV i BmNPV nie są zbyt bogate. Jeśli chodzi o sekwencje polihedryny, to znane są one dla co najmniej kilkunastu bakulowirusów. Sekwencja tego białka jest bardzo silnie ewolucyjnie zachowywana i różnice w składzie amino kwasowym są bardzo niewielkie. Komórki owadzie są szczególnie łatwe do hodowli in vitro. Większość linii komórkowych może być hodowana zarówno w hodowlach jednowarstwowych jak i w zawiesinie. Optymalna temperatura hodowli wynosi 27 C co w praktyce oznacza, że możliwa jest hodowla w temperaturze pokojowej. Do hodowli nie jest również konieczna atmosfera dwutlenku węgla, a więc hodowla komórek owadzich może być prowadzona w wytrząsarkach powietrznych lub wodnych, identycznych jak stosowane do hodowli bakterii w standardowym laboratorium mikrobiologicznym (Bieńkowska-Szewczyk K., Szewczyk B., Acta Bioch. Polon., 1999, 46, 325-339). Mimo niewątpliwych zalet takich jak niski koszt produkcji, hodowle gąsienic do uzyskiwania większych ilości bakulowirusa nie zawsze są metodą z wyboru (m.in. niektóre gąsienice takie jak Spodoptera frugiperda mają skłonności kanibalistyczne). W przyszłości hodowle in vitro będą prawdopodobnie stosowane znacznie częściej ze względu na większą powtarzalność i łatwiejszą kontrolę warunków doświadczeń pod warunkiem, że zostanie obniżony koszt podłoży wzrostowych. Znanych jest ponad 400 linii komórek owadzich, jednak tylko kilka linii ma bardzo szerokie zastosowanie jako gospodarz bakulowirusów. AcNPV jest najczęściej namnażany na liniach komórkowych wywodzących się ze Spodoptera frugiperda lub Trichoplusia ni. Dla wielu bakulowirusów (jak np. dla LdNPV - Lymantria dispar nuclear polyhedrosis virus) wyprowadzone zostały linie komórkowe z naturalnego gospodarza. Znanych jest kilka podłoży podstawowych do hodowli in vitro komórek owadzich, w których namnaża się bakulowirusa. Są to między innymi podłoże Grace a, IPL-41 i TC-100, które są dostępne w formie stałej lub płynnej. Przed użyciem dodaje się do nich płodową surowicę bydlęcą do stężenia 10%. Pojawiły się również podłoża nie wymagające dodatku surowicy bydlęcej, które są niezastąpione w wielu wypadkach, jak np. izolacja białek eksportowanych do podłoża wzrostowego. Są to między
4 PL 212 543 B1 innymi: ExCell 400 i ExCell 401 (J.R.H. Biosciences), HyQ-CCM-3 (HyClone), Sf900 i Sf900-II (GIB- CO/BRL), SFM1 i SFM2 (Sigma). Bakulowirusy mogą stanowić ważny czynnik regulujący liczebność szkodliwych owadów w lasach strefy umiarkowanej Europy. Mogą one powodować epizocje prowadzące do efektywnej kontroli owadów występujących gradacyjnie, w ten sposób redukując użycie pestycydów chemicznych. Stwierdzono występowanie w warunkach naturalnych wirusów rozwijających się w populacjach wielu owadów liściożernych. Znane są bakulowirusy najbardziej groźnych szkodników leśnych, m.in. brudnicy mniszki, brudnicy nieparki, strzygonii choinówki i zwójki sosnóweczki należących do Lepidoptera, oraz borecznika rudego i borecznika sosnowca należących do Hymenoptera. Wirozy występują najczęściej w okresie największego zagęszczenia populacji i są odpowiedzialne za przejście do fazy retrogradacji. Symptomami powszechnego występowania choroby wirusowej, jest znaczna ilość wysuszonych lub wypełnionych brunatną cieczą larw przyczepionych do liści lub gałązek. Jest to jednak etap późny wykrywania zakażenia wirusowego. W etapach wcześniejszych zakażenie jest niewykrywalne lub trudno zauważalne. W praktyce może to powodować użycie pestycydów chemicznych w rejonach gdzie zakażenie wirusem jest już masowe a ciągle nie ma wyraźnych śladów infekcji. Metoda wczesnego wykrywania infekcji wirusowej mogłaby przyczynić się do zaniechania oprysków pestycydami chemicznymi tam gdzie naturalna, lub regulowana przez człowieka kontrola biologiczna jest wystarczająca i gdzie jej efekt będzie widoczny w przeciągu kilku dni. Taka metoda prowadziłaby do znacznych oszczędności użycia pestycydów chemicznych, co poza efektami finansowymi ma olbrzymie znaczenie ekologiczne. Opisane powyżej badania znacznie poszerzyły wiedzę na temat stosowania ochrony biologicznej przed szkodliwymi owadami, w dalszym ciągu nie ma jednak preparatu, który mógłby być użyty do wczesnego diagnozowania zakażenia bakulowirusami szkodników lasu oraz do szacowania wirusa przenoszonego przez wektory biologiczne. Celem wynalazku jest dostarczenie środków, które mogłyby być wykorzystane do wczesnego i uniwersalnego określania ilości bakulowirusa w preparatach biologicznych. Te preparaty to owady zakażone bakulowirusem, owady przenoszące bakulowirusa oraz odchody ptaków i ssaków żywiących się larwami zakażonymi bakulowirusami. Nieoczekiwanie realizacja tak określonego zadania i rozwiązanie opisanych w stanie techniki problemów związanych z prognozowaniem postępu zakażenia populacji owadów, zostały osiągnięte w niniejszym wynalazku. Przedmiotem wynalazku jest sekwencja nukleotydowa primerów przedstawiona na Fig. 2, służących do powielenia fragmentów genu polihedryny bakulowirusów w obrębie ewolucyjnie silnie zachowanego fragmentu tego genu dla bakulowirusów atakujących gąsienice owadów będących głównymi szkodnikami lasów, oraz zastosowanie sekwencji nukleotydowej primerów do powielenia odcinka DNA polegające na tym, że przeprowadza się reakcję PCR i analizuje się produkty' reakcji rozdzielając je na żelu agarozowym lub poliakryloamidowym, a następnie barwiąc DNA przy użyciu bromku etydyny i oglądając je pod lampą UV, oraz stosując metodę MSSCP. Wynalazek jest szczegółowo zilustrowany na załączonych rysunkach, których figury pozwalają na lepsze wyjaśnienie istoty wynalazku. Figura 1 przedstawia sekwencje genu polihedryny i sekwencje nukleotydów otaczających ten gen różnych bakulowirusów z zaznaczeniem sekwencji wybranej do powielenia metodą PCR. Figura 2A przedstawia sekwencje primerów zdegenerowanych używanych do powielenia ewolucyjnie najmniej zmiennego rejonu polihedryny. Figura 2B jest graficznym przedstawieniem genu polihedryny odnośnikowego bakulowirusa AcNPV, na którym zaznaczono fragment powielany przy użyciu primerów o sekwencji podanej na Fig. 2A. Figura 3 przedstawia drzewo porównawcze sekwencji nukleotydowych genu polihedryny pochodzących z dobrze poznanych bakulowirusów. Figura 4 przedstawia żel agarozowy 1% po rozdziale produktów reakcji PCR przy użyciu primerów zdegenerowanych i bakulowirusowego DNA genomowego. Na poszczególne ścieżki naniesiono: 1. AcNPV (kontrola pozytywna) 2. LmNPV 3. NsNPV 4. LdNPV 5. DpNPV 6. PfNPV
PL 212 543 B1 5 7. LdNPV 8. kontrola negatywna-mutant bakulowirusowy Δpolyh 9. kontrola negatywna-komórki Sf9 nie zakażone 10. puc mix marker 8 (fragm. 1116, 883, 692, 501, 489, 404, 331, 242, 190, 147, 111, 110, 67 bp), przy czym oznaczenia bakulowirusów podane są w dalszej części opisu. Figura 5 przedstawia żel poliakryloamidowy po rozdziale jednoniciowego DNA uzyskanego na matrycy DNA bakulowirusowego. Na poszczególne ścieżki naniesiono: 1. puc mix marker 8 2. (fragm. 1116, 883, 692, 501, 489, 404, 331, 242, 190, 147, 111, 110, 67 bp) 3. AcNPV 4. LdNPV3 5. LdNPV8 6. LmNPV 7. PfNPV Poniżej przedstawia się przykładowe realizacje wynalazku. P r z y k ł a d 1. Powielanie fragmentów genu polihedryny różnych bakulowirusów przy pomocy reakcji PCR Sekwencje te zostały otrzymane w reakcji PCR przy zastosowaniu odpowiednich komplementarnych starterów pokazanych na Fig. 2. Te zdegenerowane startery zostały zaprojektowane na podstawie analizy sekwencji polihedrynowych pokazanych na Figurze 1. Jako matrycowe DNA zastosowano genomowe DNA wyizolowane z następujących modelowych bakulowirusów: Autographa californica NPV (AcNPV) - najlepiej poznany bakulowirus używany jako narzędzie do ekspresji obcych genów, Lymantria dispar NPV (LdNPV) - bakulowirus pasożytujący na jednym z głównych szkodników lasów liściastych - brudnicy nieparce, Lymantria monacha NPV (LmNPV) - bakulowirus pasożytujący na jednym z głównych szkodników lasów iglastych - brudnicy mniszce, Panolis flammea NPV (PfNPV) - bakulowirus pasożytujący na ważnym szkodniku drzew iglastych - strzygonii choinówce, Diprion pini NPV (DpNPV) - bakulowirus pasożytujący na ważnym szkodniku drzew iglastych - boreczniku sosnowcu, Neodiprion pini NPV (NsNPV) - bakulowirus pasożytujący na ważnym szkodniku drzew iglastych - boreczniku rudym. Reakcja PCR prowadzona była w następujących warunkach: 3x 94 C 5 min. 48 C 1 min. 72 C 1 min. 30x 94 C 5 min. 48 C 30 sek. 72 C 1 min. 1x 94 C 1 min. 48 C 30 sek. 72 C 5 min. Po przeprowadzeniu reakcji PCR, produkty reakcji były analizowane metodą elektroforezy agarozowej oraz poliakryloamidowej, prążki po wybarwieniu bromkiem etydyny były oświetlane promieniowaniem nadfioletowym w zakresie około 360 nm i analizowane wizualnie na transiluminatorze. Prążki DNA na wysokości prążka 190bp wzorca puc mix marker 8 (fragm. 1116, 883, 692, 501, 489, 404, 331, 242, 190, 147, 111, 110, 67 bp) odpowiadały mniej więcej wielkością fragmentowi, który powinien powstawać w reakcji PCR przy użyciu zdegenerowanych starterów. W celu potwierdzenia powielenia fragmentu polihedryny w reakcji PCR, prążki odpowiadające właściwej masie cząsteczkowej były izolowane z żelu poliakryloamidowego 8%. Oczyszczone fragmenty ligowano z wektorem pgem T-easy (PROMEGA), który służy do klonowania produktów po reakcji PCR. Po 2-godzinnej ligacji w temperaturze pokojowej mieszaniną reakcyjną, transformowano komórki Escherichia coli TOP10, a następnie wysiewano je na płytki z podłożem selekcyjnym zawierającym w końcowych stężeniach: ampicylinę 100 μg/ml, 0.5 mm IPTG, X-Gal 80 μg/ml. Kolonie fenotypowo białe namnażano
6 PL 212 543 B1 w hodowli płynnej z dodatkiem ampicyliny w stężeniu końcowym 100 μg/ml i izolowano DNA plazmidowe za pomocą kolumienek firmy A&A BIOTECHNOLOGY. Każdy z plazmidów poddawano dokładnej analizie restrykcyjnej. Plazmidy zawierające wklonowane fragmenty i niezmieniony plazmid wyjściowy były w końcowym etapie sekwencjonowane przy użyciu uniwersalnych primerów SP6 i T7 (których sekwencja jest w wektorze pgem T-easy) w celu potwierdzenia, że plazmid posiada sekwencję nukleotydową całkowicie zgodną z przewidywaniami teoretycznymi. P r z y k ł a d 2. Analiza MSSCP produktów reakcji PCR Powstałe w wyniku reakcji PCR produkty oczyszczono, a następnie poddano analizie MSSCP (ang. Multitemperature Single Strand Conformation Polymorphism). Metoda ta pozwala na wykrywanie mutacji punktowych w jednoniciowych fragmentach DNA rozdzielonych w żelu poliakryloamidowym. DNA zawieszano w buforze do denaturacji firmy KUCHARCZYK - TECHNIKI ELEKTROFORETYCZ- NE i inkubowano przez 15 minut w 55 C. Następnie próby nanoszono na żel poliakryloamidowy 9% i prowadzono elektroforezę w gradiencie temperatur: 1. 35 C, 25 min. 2. 15 C, 25 min. 3. 5 C, 25 min. Żel barwiono srebrem za pomocą zestawu do barwienia DNA/RNA w żelach poliakryloamidowych firmy KUCHARCZYK - TECHNIKI ELEKTROFORETYCZNE. Zastrzeżenia patentowe 1. Sekwencja nukleotydowa primerów przedstawiona na Fig. 2, służących do powielenia fragmentów genu polihedryny bakulowirusów w obrębie ewolucyjnie silnie zachowanego fragmentu tego genu dla bakulowirusów atakujących gąsienice owadów będących głównymi szkodnikami lasów. 2. Zastosowanie sekwencji nukleotydowej primerów jak określono w zastrz. 1, do powielenia odcinka DNA charakteryzujące się tym, że przeprowadza się reakcję PCR i analizuje się produkty reakcji rozdzielając je na żelu agarozowym lub poliakryloamidowym, a następnie barwiąc DNA przy użyciu bromku etydyny i oglądając je pod lampą UV, oraz stosując metodę MSSCP.
PL 212 543 B1 7 Rysunki
8 PL 212 543 B1
PL 212 543 B1 9
10 PL 212 543 B1
PL 212 543 B1 11
12 PL 212 543 B1
PL 212 543 B1 13
14 PL 212 543 B1
PL 212 543 B1 15
16 PL 212 543 B1 Departament Wydawnictw UP RP Cena 4,92 zł (w tym 23% VAT)