Streszczenie Analiza polimorfizmu konformacji jednoniciowych fragmentów DNA (ang. single stranded conformation polymorphism, SSCP) jest łatwą, szybką i jedną z najczęściej stosowanych technik elektroforetycznych umożliwiających wykrywanie polimorfizmu genetycznego oraz innych niewielkich zmian w materiale genetycznym, takich jak: mutacje punktowe, małe delecje i insercje, czy też mikroinwersje. Technika ta wykorzystuje fakt, że podczas elektroforezy w warunkach niedenaturujących każda jednoniciowa cząsteczka DNA przyjmuje właściwą sobie konformację zależną między innymi od jej sekwencji, w związku z czym zamiana nawet pojedynczego nukleotydu w kilkuset nukleotydowej nici spowoduje zmianę struktury przestrzennej, co w konsekwencji prowadzi do różnic w ruchliwości elektroforetycznej. Elektroforeza w gradiencie czynnika denaturującego (ang. denaturing gradient gel electrophoresis, DGGE) jest znaną od dawna metodą, powszechnie wykorzystywaną do przesiewowego wykrywania mutacji w materiale genetycznym. Pozwala ona na zidentyfikowanie, ale nie na dokładną charakterystykę mutacji punktowych oraz niewielkich insercji i delecji. Technika DGGE wykorzystuje fakt, że zmutowane cząsteczki DNA ulegają częściowej denaturacji w żelu w innym stężeniu czynnika denaturującego, niż cząsteczki niezmutowane. W przedstawionej pracy opisano odmiany wyżej wymienionych technik molekularnych, ich zalety i ograniczenia stosowania. Opisano również nową technikę HRM przydatną do analizy polimorfizmów. Abstract Single-stranded conformation polymorphism analysis of DNA fragments (SSCP) is easy, fast and one of the most commonly used electrophoretic techniques to detect genetic polymorphisms and other minor changes in the genetic material, such as point mutations, small deletions, insertions and microinversions. This technique exploits the fact that during the electrophoresis under non-denaturing conditions each single-stranded DNA molecule adopts a proper conformation dependent on its sequence, and therefore even a single nucleotide substitution in several hundred nucleotide strands will change the spatial structure, which in turn leads to differences in electrophoretic mobility. Electrophoresis in a gradient of denaturing factor (DGGE) is a well known method commonly used for screening detection of mutations in the genetic material. It allows identification, but not an accurate characterization of point mutations, small insertions and deletions. DGGE technique exploits the fact that the mutant DNA molecules undergo partial denaturation in a gel at different concentration of denaturing factor than non-mutated ones. In the paper, these two molecular techniques have been described including their advantages and limitations of use. Also desribes a new HRM technique which useful for the analysis of polymorhisms. Key words: SSCP analysis, DGGE analysis, HRM analysis, molecular diagnostics Słowa kluczowe: analiza SSCP, analiza DGGE, analiza HRM, diagnostyka molekularna Technika SSCP Analiza polimorfizmu konformacji jednoniciowych fragmentów DNA (ang. single stranded conformation polymorphism, SSCP) jest łatwą, szybką i jedną z najczęściej stosowanych technik elektroforetycznych umożliwiających wykrywanie polimorfizmu genetycznego oraz innych niewielkich zmian w materiale genetycznym, takich jak: mutacje punktowe, małe delecje i insercje, czy też mikroinwersje [1, 2]. Technika ta wykorzystuje fakt, że podczas elektroforezy w warunkach niedenaturujących każda jednoniciowa cząsteczka DNA przyjmuje właściwą sobie konformację zależną między innymi od jej sekwencji, w związku z czym zamiana nawet pojedynczego nukleotydu w kilkuset nukleotydowej nici spowoduje zmianę struktury przestrzennej, co w konsekwencji prowadzi do różnic w ruchliwości elektroforetycznej [1, 2]. Materiał do analizy SSCP stanowią próbki DNA genomowego, bądź będącego produktem reakcji odwrotnej transkrypcji, komplementarnego DNA (cdna, complementary DNA). Docelowa sekwencja jest amplifikowana w reakcji łańcuchowej polimerazy (ang. polymerase chain reaction, PCR), której produkty są następnie wykorzystywane do właściwego badania polimorfizmu konformacji jednoniciowego DNA (single-strand DNA, ssdna) [1, 2].
Pierwszy etap analizy SSCP obejmuje denaturację termiczną dwuniciowego DNA (double-strand DNA dsdna,) w buforze obciążającym z dodatkiem czynnika denaturującego (najczęściej formamid, rzadziej mocznik lub wodorotlenek sodu) i mieszaniny barwników oraz szybkie schłodzenie w celu zapobiegnięcia renaturacji rozdzielonych fragmentów DNA [1]. W drugim etapie badania uzyskane jednoniciowe cząsteczki poddawane są elektroforezie w niedenaturującym żelu poliakrylamidowym. Ruchliwość elektroforetyczna fragmentów ssdna zależy od ich wielkości, ładunku oraz struktury przestrzennej. W warunkach niedenaturujących poszczególne jednoniciowe cząsteczki DNA przyjmują określoną konformację (strukturę drugo- i trzeciorzędową), uwarunkowaną wewnątrzcząsteczkowymi interakcjami. Przyjęta struktura zależna jest od długości nici, sekwencji nukleotydów oraz umiejscowienia i liczby regionów, w obrębie których doszło do wewnętrznego sparowania zasad [3]. Technika SSCP umożliwia wykrywanie zarówno znanych mutacji i polimorfizmów, jak również nie opisanych dotychczas zmian w materiale genetycznym. Nieznana mutacja może zostać dokładnie scharakteryzowana po zakończeniu analizy SSCP. W tym celu należy wypłukać z żelu zmutowany fragment DNA, a następnie poddać go reamplifikacji i sekwencjonowaniu [3]. Czynniki wpływające na czułość metody SSCP Na czułość opisanej metody wpływa wiele czynników, takich jak: wielkość badanego fragmentu DNA i zawartość w nim par GC, obecność specyficznych mutacji w analizowanym fragmencie, temperatura żelu podczas elektroforezy, rodzaj żelu i stopień jego usieciowania, obecność glicerolu w żelu, skład buforu (siła jonowa i ph) oraz stężenie DNA. Optymalna długość fragmentów ssdna do analizy SSCP mieści się w zakresie 150-200 nukleotydów i zapewnia wykrywalność zmian w sekwencji na poziomie 80-90%. Dla fragmentów o długości >300 par zasad (pz) obserwuje się znaczny spadek czułości [2, 4, 5]. Uważa się, że za wyjątkiem transwersji G T, typ mutacji w badanym fragmencie DNA nie wpływa znacząco na czułość techniki [4]. Odkryto natomiast, że duża zawartość par GC w matrycowym DNA poprawia czułość SSCP. Jest to prawdopodobnie spowodowane tworzeniem większej liczby wiązań wodorowych, a zatem, bardziej stabilnych konformerów [2, 5]. Z kolei stosunek cytozyny do adenozyny w analizowanym fragmencie dodatnio koreluje z optymalną temperaturą elektroforezy (T S ), która może zostać oszacowana przy użyciu następującego wzoru: T S = [80 C/(A+1)]/{2.71 + [C/(A+1)]} [6]. Temperatura żelu jest jednym z najważniejszych czynników wpływających na szybkość z jaką migrują cząsteczki ssdna podczas elektroforezy i nie powinna przekraczać 20 C. W zbyt wysokiej temperaturze zmniejsza się wydajność tworzenia konformerów. Poza tym, często dochodzi do powstawania dwóch niestabilnych struktur, które w trakcie rozdziału elektroforetycznego przechodzą z jednej formy w drugą, czego efektem jest obecność smug i rozmytych prążków w elektroforegramie. Dane eksperymentalne wskazują, że niewystarczająca kontrola temperatury podczas elektroforezy może spowodować zmianę temperatury żelu nawet o 10 C. Stąd też, aby zapewnić powtarzalność wyników oraz zapobiec wynikom fałszywie ujemnym, bardzo ważne jest utrzymanie jednolitej temperatury w trakcie elektroforezy [1, 7]. Najpowszechniej wykorzystywanym żelem do rozdziału kwasów nukleinowych w przebiegu SSCP jest żel poliakrylamidowy o niskim stopniu usieciowania. W analizie SSCP najczęściej wykorzystuje się żele o całkowitym stężeniu akrylamidu w zakresie 4-12% oraz stopniu usieciowania pomiędzy 2% a 3,4% [8]. Stopień usieciowania żelu wyrażany jest przy pomocy parametru %C, czyli stosunku masy bisakrylamidu do sumy mas akrylamidu i bisakrylamidu w przeliczeniu na 100 ml (%C = (bisakrylamid [g]/akrylamid+bisakrylamid [g]) 100) [2, 8]. Stopień usieciowania żelu można wyrażać też jako stosunek akrylamidu do bisakrylamidu (np. 19:1) [1]. Alternatywnymi podłożami używanymi w analizie SSCP fragmentów znakowanych radioaktywnie są żele takie jak Hydrolink, Hydrolink-D5000 oraz Hydrolink-MDE (MDE). Udowodniono, iż żel Hydrolink cechuje się, w stosunku do akrylamidu, większą jednolitością pod względem wielkości porów oraz daje wyraźniejsze prążki, co wiąże się z jego lepszą rozdzielczością [9]. Obecność w żelu dodatkowych składników może wpłynąć na poprawę jego zdolności rozdzielczej. Najczęściej dodawanym związkiem jest glicerol o stężeniu 5-10% [2, 3]. Przyjmuje się, że jego pozytywny wpływ na wykrywanie mutacji w trakcie rozdziału elektroforetycznego jest związany z obniżeniem ph buforu Tris-boranowego ze względu na reakcję glicerolu z jonami boranowymi bądź też wiąże się z osłabieniem sił elektrostatycznego odpychania pomiędzy ujemnie naładowanymi resztami fosforanowymi obecnymi w szkielecie cząsteczki DNA, co prowadzi do większej stabilności konformerów [2, 10]. Glicerol opóźnia także migrację cząsteczek w żelu, szczególnie w temperaturze 4 C, co prawdopodobnie ma związek z jego lepkością [2, 3]. Glavač i Dean [11] wykazali, że do żelu mogą zostać dodane inne związki o działaniu denaturującym, takie jak 5% mocznik lub formamid, bądź też obojętne (10% dimetylosulfotlenek lub 10-15% sacharoza). Niemniej jednak, spośród nich jedynie sacharoza wywiera podobny do glicerolu, wyraźnie korzystny wpływ na zdolność rozdzielczą badanego żelu. Dowiedziono również, że nałożenie do studzienki żelu próbki o zbyt dużym stężeniu DNA spowoduje renaturację jednoniciowych fragmentów kwasu nukleinowego, co z kolei przyczyni się do nieefektywnej analizy SSCP. Aby temu zapobiec wystarczy bardziej rozcieńczyć próbkę buforem obciążającym [1]. W niekorzystny sposób na skuteczność SSCP może również wpłynąć obecność w próbce starterów pozostałych po reakcji PCR. Będą one łączyć się z komplementarnymi regionami w ssdna, zmieniając ich konformację, a w związku z tym profil SSCP [12]. Wybrane odmiany techniki SSCP Od momentu, gdy w 1989 roku opisano po raz pierwszy technikę SSCP, dokonano wielu modyfikacji mających na celu zwiększenie jej czułości, wydajności, a także bezpieczeństwa [1, 2]. Choć zasadniczo technika SSCP jest wykorzystywana do badania DNA, to analiza polimorfizmu konformacji ssrna
także jest możliwa. W porównaniu do metody DNA-SSCP, w technice RNA-SSCP (rsscp) wymagany jest dodatkowy etap transkrypcji, w trakcie którego na bazie produktów PCR generowane są cząsteczki ssrna. Niemniej jednak, rsscp okazuje się być metodą skuteczniejszą w wykrywaniu mutacji, a ponadto umożliwia badanie fragmentów o długości większej niż zazwyczaj stosowane odcinki DNA. Przyjmuje się, że jest to wynikiem obecności w RNA dodatkowej grupy hydroksylowej, co sprzyja tworzeniu większego spektrum konformerów, które są dodatkowo bardziej stabilne niż w przypadku DNA. Poza tym, badanie RNA zmniejsza możliwość renaturacji jednoniciowych fragmentów kwasu nukleinowego [13]. Inną próbą adaptacji metody do badania fragmentów DNA dłuższych niż pozwala na to rutynowa analiza jest użycie podczas elektroforezy buforu o niskim ph. Umożliwia to wykrywanie mutacji we fragmentach o długości 300-800 pz [10]. Kolejną możliwość niesie włączenie do analizy SSCP trawienia zbyt długich produktów PCR enzymami restrykcyjnymi. Dzięki takiej modyfikacji możliwe jest otrzymanie fragmentów DNA o optymalnej długości do dalszego badania [14]. Jednym z problemów techniki SSCP jest reasocjacja komplementarnych nici DNA. Metoda pozwalająca na eliminację tej przeszkody polega na użyciu biotynylowanych primerów do reakcji PCR oraz perełek magnetycznych opłaszczonych streptawidyną, co umożliwia izolację i wykorzystanie do dalszej analizy tylko jednej z dwóch komplementarnych nici [15]. Dowiedziono również, że jeśli badanego DNA nie podda się działaniu wysokiej temperatury, to w elektroforegramie ujawnią się, oprócz głównych, stabilnych konformerów, także przejściowe, wolno migrujące prążki, które mogą dostarczyć dodatkowych informacji o zmianach w badanej sekwencji [16]. Maruya i wsp. [17] poddali produkty PCR denaturacji termicznej w roztworze o niskiej sile jonowej (ang. low ionic strength, LIS), co okazało się być bardziej efektywnym sposobem generowania ssdna niż powszechnie stosowana denaturacja termiczna w obecności formamidu. Co więcej, powstające cząsteczki ssdna były w roztworze LIS stabilne nawet w temperaturze pokojowej, w związku z czym nie było konieczności chłodzenia próbek w lodzie po denaturacji termicznej. Odmiana ta została określona jako low ionic strenght single-stranded conformation polymorphism (LIS -SSCP), a jej dodatkową zaletą jest bardziej czytelny wzór prążków w porównaniu do konwencjonalnego SSCP. Dane eksperymentalne wskazują, że połączenie SSCP z analizą heterodupleksów, a więc dwóch metod zdolnych do wykrywania niewielkich zmian w sekwencji i wymagających podobnego wyposażenia, daje możliwość detekcji większego odsetka mutacji, niż przy użyciu każdej z tych metod oddzielnie [18, 19]. Kolejna odmiana SSCP, charakteryzująca się znacznie wyższą czułością w porównaniu do klasycznej analizy, to wielotemperaturowe SSCP (ang. multitemperature SSCP, msscp). Technika msscp opiera się na obserwacji, że wskutek kilkukrotnej zmiany temperatury żelu podczas natywnej elektroforezy SSCP zwiększa się wskaźnik wykrywalności punktowych zmian sekwencji, a także skraca czas i całkowity koszt analizy. Dane eksperymentalne wykazały ponadto, że wzór prążków powstały w wyniku zastosowania msscp charakteryzuje się lepszą zdolnością dyskryminacyjną niż profile uzyskane z badania tych samych próbek w różnych, ale stałych temperaturach [7, 20]. Poprawę wydajności analizy SSCP można osiągnąć przez połączenie jej z techniką multipleks-pcr, która polega na jednoczesnej amplifikacji kilku różnych fragmentów DNA dzięki wprowadzeniu do mieszaniny reakcyjnej wielu par starterów. Produkty reakcji multipleks-pcr nakłada się następnie do jednej studzienki w żelu, przez co możliwe jest rozdzielenie nawet dziesięciu eksonów badanego genu na jednej ścieżce żelu. Modyfikacja taka jest określana jako multiplex-sscp (MSSCP) [21]. Kolejną odmianą pozwalającą na analizę wielu fragmentów ssdna na jednej linii żelu jest technika DOVAM -S (ang. detection of virtually all mutations-sscp), która dodatkowo charakteryzuje się praktycznie 100% czułością w wykrywaniu mutacji. W analizie DOVAM-S produkty PCR zostają poddane elektroforezie w pięciu odmiennych, niedenaturujących warunkach zgodnie z procedurą opisaną przez Liu i wsp. [22]. Różnice dotyczą rodzaju żelu, buforu, temperatury oraz dodatku glicerolu. W celu wyeliminowania używanych w technice DO- VAM-S znaczników radioizotopowych, a także zredukowania liczby żeli koniecznych do analizy, powstała kolejna odmiana fluorescent DOVAM-S (F-DOVAM-S) wykorzystująca barwniki fluorescencyjne. Technika F-DOVAM-S jest połączeniem elektroforezy msscp (multitemperature SSCP) w 2 zestawach warunków ze znakowaniem fluorescencyjnym. Pozwala to na wykrycie 97% mutacji, a ponadto przyczynia się do znacznego zwiększenia wydajności analizy. Użycie trzech barwników 6FAM (niebieski), VIC (zielony) oraz NED (żółty), daje możliwość rozdziału w każdej linii żelu jednocześnie próbek pochodzących od trzech pacjentów. Co więcej, stosowanie kilku różnokolorowych barwników stwarza możliwość włączenia do każdej ścieżki żelu wewnętrznego wzorca, wskutek czego identyfikacja nawet niewielkich zmian położenia prążków stanie się łatwiejsza [23]. Źródłem kolejnych modyfikacji w metodzie SSCP jest sposób detekcji konformerów. Czułą, choć stwarzającą potencjalne niebezpieczeństwo dla wykonującego analizę, metodą jest użycie znakowanych radioaktywnie starterów lub deoksynukleotydów do reakcji PCR [3]. Wśród najczęściej stosowanych radioizotopów znajdują się 32 P, 33 P oraz 35 S [3, 16, 24]. Jednym ze sposobów, które pozwalają na wykluczenie znaczników izotopowych z analizy SSCP jest zastosowanie w ich miejsce barwników fluorescencyjnych. Znakowanie fluorescencyjne możliwe jest zarówno w trakcie reakcji PCR, jak również po jej zakończeniu, a ponadto pozwala na wprowadzenie do analizy jednocześnie kilku barwników [23]. Innym rozwiązaniem dla nieizotopowej analizy SSCP jest barwienie żelu solami srebra po zakończeniu elektroforezy. Metoda ta jest prawie tak czuła jak znakowanie radioaktywne i daje możliwość trwałego zapisu wyników i długotrwałego przechowywania żeli [1, 2]. Opisywano przypadki barwienia żeli bromkiem etydyny, jednakże technika ta może być za mało czuła do wykrycia subtelnych
zmian w profilu SSCP ze względu na rozkład barwnika [1, 3, 16]. Niemniej jednak, okazuje się być przydatna w analizie rsscp [13]. Istnieją także doniesienia o wybarwianiu żeli barwnikami wykorzystywanymi w analizie sekwencyjnej, takimi jak SYBR Green lub SYBR Gold [3]. Kolejnym sposobem detekcji prążków jest przeniesienie rozdzielonych fragmentów ssdna na nylonową membranę w procesie Southern blotting oraz hybrydyzacja ze znakowanymi digoksygeniną produktami PCR, w połączeniu z detekcją chemi-luminescencyjną [25]. Technika DGGE Elektroforeza w gradiencie czynnika denaturującego (ang. denaturing gradient gel electrophoresis, DGGE) jest znaną od dawna metodą, powszechnie wykorzystywaną do przesiewowego wykrywania mutacji w materiale genetycznym. Pozwala ona na zidentyfikowanie, ale nie na dokładną charakterystykę, mutacji punktowych oraz niewielkich insercji i delecji [26]. Technika DGGE wykorzystuje fakt, że zmutowane cząsteczki DNA będą ulegały częściowej denaturacji w żelu w innym stężeniu czynnika denaturującego, niż cząsteczki niezmutowane [26]. Etapem poprzedzającym elektroforezę w gradiencie czynnika denaturującego jest amplifikacja badanego DNA techniką PCR. W przypadku heterozygot produktami PCR są dwa rodzaje homodupleksów i dwa typy heterodupleksów. Homodupleksy to struktury składające się z dwóch prawidłowych lub dwóch zmutowanych nici DNA, natomiast heterodupleksy powstają przez połączenie nici prawidłowej ze zmutowaną, czego skutkiem jest obecność regionu z niepełnym sparowaniem zasad w miejscu mutacji. W przypadku homozygot produktami PCR są jedynie homodupleksy, aby więc otrzymać mieszaninę homo- i heteodupleksów, a tym samym zwiększyć prawdopodobieństwo wykrycia mutacji, należy zmieszać badany DNA z DNA osoby zdrowej [19, 26]. Następnie, produkty PCR są poddawane elektroforezie w żelu poliakrylamidowym o wzrastającym stężeniu czynnika denaturującego (mocznik, formamid). Dodatkowo elektroforezę przeprowadza się w podwyższonej, stałej temperaturze, zazwyczaj mieszczącej się w zakresie 50-65 C. Elektroforeza może być wykonywana na żelach z prostopadłym lub równoległym, w stosunku do kierunku elektroforezy, gradientem związku denaturującego. W żelach z poziomym gradientem wykorzystuje się szeroki zakres stężeń czynnika denaturującego, zazwyczaj 0-100% lub 20-70%, natomiast w żelach z gradientem pionowym, zakres ten jest mniejszy, co pozwala uzyskać lepsze rozdzielenie badanych fragmentów DNA [8]. W tym ostatnim przypadku, na podstawie doniesień literaturowych, zaleca się, aby różnica pomiędzy najwyższym i najniższym stężeniem związku denaturującego nie przekraczała 30% [26]. W trakcie rozdziału elektroforetycznego produkty PCR migrują jako cząsteczki dwuniciowe, aż do miejsca, w którym stężenie związków denaturujących jest równe ich temperaturze meltingu (t m ). W tym punkcie żelu zaczyna się denaturacja dsdna, wskutek czego dochodzi do gwałtownego zahamowania jego migracji [8]. Profil meltingu fragmentu DNA zależy od jego sekwencji (składu zasad i długości). Obecność niesparowanych zasad w cząsteczkach heterodupleksów zmniejsza ich całkowitą stabilność, w związku z czym, w porównaniu do homodupleksów, denaturują one w żelu przy mniejszym stężeniu czynnika denaturującego, czyli charakteryzują się niższą temperaturą meltingu. Stąd też, obecność mutacji w badanym DNA jest widoczna w elektroforegramie jako dodatkowe prążki [19, 26, 27]. Całkowitemu rozdzieleniu dsdna zapobiega się wykorzystując jeden ze starterów w reakcji PCR, aby przyłączyć do wybranego końca badanego fragmentu DNA sekwencję bogatą w pary GC, tzw. GC clamp. Sekwencja taka, zazwyczaj o długości 40-60 nukleotydów, charakteryzuje się bardzo wysoką temperaturą denaturacji i pozostaje strukturą dwuniciową, podczas gdy reszta cząsteczki ulega rozdzieleniu. Ponadto przyłączenie sekwencji GC clamp zmienia profil meltingu badanej cząsteczki i przyczynia się do znacznego wzrostu czułości techniki DGGE [26]. Istotne znaczenie dla prawidłowego przebiegu DGGE ma określenie profilu meltingu badanego fragmentu DNA. Wykorzystywane w tym celu specjalne programy komputerowe są także pomocne w wyborze odpowiednich starterów oraz ustaleniu optymalnych warunków elektroforezy (zakresu gradientu czynnika denaturującego). Warunki DGGE mogą zostać również określone empirycznie, poprzez wykonanie elektroforezy z poziomym gradientem czynnika denaturującego [26, 27]. W trakcie DGGE możliwe jest wykrycie jedynie tych mutacji, które znajdują się w obrębie domeny o najniższej temperaturze meltingu. Krzywa denaturacji takiej domeny powinna być jak najbardziej spłaszczona. Zazwyczaj taki obraz krzywej otrzymuje się po przyłączeniu sekwencji GC clamp do jednego z końców badanego fragmentu DNA. W takim przypadku na wykresie powinna być widoczna także dodatkowa domena, o wysokiej temperaturze meltingu, odpowiadająca sekwencji GC clamp [26, 27]. Optymalna długość produktów PCR do przeprowadzenia DGGE mieści się w zakresie 200-400 pz, ponieważ dla fragmentów dłuższych trudno jest wyznaczyć krzywą meltingu [26]. Odmiany techniki DGGE TGGE (ang. temperature gradient gel electrophoresis) oraz TTGE (ang. temporal temperature gradient gel electrophoresis) opierają się na takiej samej zasadzie jak DGGE, z tą różnicą, że warunki denaturujące w trakcie elektroforezy uzyskuje się przez zastosowanie w miejsce wzrastającego stężenia chemicznego czynnika denaturującego, gradientu temperatury w połączeniu ze stałym stężeniem mocznika w żelu. Analogicznie obecność mutacji jest wykrywana dzięki temu, że heterodupleksy ulegają denaturacji w niższej temperaturze niż homodupleksy [8, 28]. W metodzie TTGE temperatura wzrasta stopniowo i jednostajnie podczas całej elektroforezy, tak że w danym momencie jest jednakowa w każdym punkcie żelu, natomiast w TGGE gradient temperaturowy jest stały, ustalony na początku rozdziału elektroforetycznego [29]. W przypadku obydwu wyżej wymienionych technik zastosowanie gradientu temperatury eliminuje konieczność przygotowywania żeli z gradientem związku chemicznego, co ułatwia wykonanie badania, a ponadto daje możliwość łatwej zmiany zakresu gradientu [28, 29].
Na podstawie profilu meltingu badanego fragmentu DNA, uzyskanego przy pomocy programu komputerowego, możliwe jest określenie zakresu temperatury odpowiedniego do wykrywania mutacji techniką TTGE. Biorąc pod uwagę, że w metodzie tej wykorzystuje się żele denaturujące, wyznaczoną najwyższą i najniższą temperaturę modyfikuje się względem zawartości mocznika w żelu, ponieważ każdy mol mocznika obniża temperaturę meltingu DNA o 2 C [8]. Technika TTGE umożliwia badanie cząsteczek DNA o wielkości nawet do 1000 pz. Ponadto, według niektórych autorów, może być przeprowadzana bez zastosowania sekwencji GC clamp. Upraszcza to dodatkowo procedurę badania oraz obniża jego koszty, a jednocześnie nie wpływa negatywnie na czułość metody [29, 30]. Biyani i Nishigaki [31] opisali technikę μtgge, która opiera się na zasadzie analogicznej do TGGE z tym, że elektroforezę przeprowadza się na pięcio- lub dziesięciokrotnie mniejszych żelach (2 2 0,5 cm). Dzięki temu do przeprowadzenia badania metodą μtgge wystarcza kilkukrotnie mniejsza objętość próbki (5 μl). Ponadto, w porównaniu do konwencjonalnego TGGE, znacznie skraca się czas zarówno samej elektroforezy (6-12 min), jak i całej analizy (< 1 h), co przekłada się na znaczne obniżenie kosztów badania. μtgge zapewnia stukrotnie wyższą wydajność niż TGGE, a przy tym dostarcza powtarzalnych wyników, które w 99% są zgodne z wynikami uzyskanymi klasyczną metodą TGGE. Kolejną odmianą DGGE jest technika CDGE (ang. constant denaturing gel electrophoresis), w której elektroforezę przeprowadza się w stałym stężeniu związku denaturującego. CDGE nie wymaga przygotowywania żeli z gradientem czynnika denaturującego, dzięki czemu może zostać wykorzystana do szybkiego i wydajnego poszukiwania w próbkach mutacji, uprzednio zidentyfikowanych przez DGGE [8]. Optymalne stężenie czynnika denaturującego dla CDGE określa się na podstawie żeli DGGE z poziomym lub pionowym gradientem związku denaturującego. Mianowicie, wybiera się takie stężenie, przy którym odległość pomiędzy prawidłowym, a zmutowanym DNA jest największa [8]. Niemniej jednak, aby uzyskać wiarygodne wyniki należy zachować ostrożność przy dobieraniu stężenia związku denaturującego do CDGE, ponieważ okazuje się, że wykrycie różnych mutacji, nawet w obrębie jednej domeny meltingu może wymagać wykonania elektroforezy w różnych warunkach [32]. W celu detekcji badanego DNA w metodzie DGGE oraz jej odmianach stosuje się barwienie żeli bromkiem etydyny lub solami srebra [8]. Denaturacja DNA z wysoką rozdzielczością (HRM) Technika HRM umożliwia wykrywanie polimorfizmów i identyfikację fragmentów DNA różniących się długością, zawartością par GC lub sekwencją na podstawie krzywej denaturacji DNA bez stosowania specyficznych sond. Pozwala na identyfikacje delecji, insercji i substytucji, a także na detekcję pojedynczych podstawień nukleotydowych (np. SNP). Pierwszym etapem analizy jest amplifikacja badanego fragmentu DNA, następnie denaturacja i powolna renaturacja w celu utworzenia heterodupleksu. W ostatnim etapie mieszanina zostaje poddana precyzyjnej denaturacji w obecności barwika interkalującego. Podczas powolnego schładzania poszczególne nici DNA hybrydyzują losowo. Hybrydyzacja niekomplementarnych nici prowadzi do utworzenia heterodupleksu. Niesparowane odcinki DNA posiadają niższą stabilność konformacyjną i tym samym denaturują w niższych temperaturach. Identyfikacja fragmentów DNA polega, podobnie jak w przypadku standardowej denaturacji DNA, na analizie krzywych topnienia. Delecje i insercje powyżej pięciu nukleotydów tworzą stabilne heterodupleksy i można je identyfikować również poprzez standardową denaturację. W przypadku zmiany pojedynczych nukleotydów niezbędny jest system gwarantujący precyzyjną akwizycję sygnału fluorescencyjnego i niezwykle stabilną (co najmniej ±0.1 C) temperaturę [33, 34]. Metoda HRM jest prostsza i znacznie tańsza od genotypowania opartego na znakowanych sondach, a także od czasochłonnych metod standardowych takich jak SSCP, DHPLC, RFLP. Reakcje amplifikacji i denaturacji przeprowadzane są w jednej probówce, a wyniki otrzymywane w ciągu około 40-60 min w zależności od protokołu amplifikacji. Metoda wykorzystywana jest między innymi do:wykrywania mutacji punkowych/screening, genotypowania SNP/ dyskryminacji alleli, identyfikacji gatunkowej; identyfikacji metylowanego DNA, analizy mikrosatelitów. Stosowanie metody HRM znacznie ogranicza ilość fragmentów DNA poddawanych sekwencjonowaniu dzięki wstępnej eliminacji tych, które nie wykazują różnic w sekwencji [33, 34]. Analiza SNP Eco Real time PCR System może być wykorzystany do wykrywania wszystkich czterech znanych klas polimorfizmów SNP: (1) C/T i G/A (2) C/A i G/T (3) C/G (4) A/T. Najtrudniejsze do identyfikacji są polimorfizmy klasy czwartej ze względu na najmniejsze różnice w temperaturze topnienia (<0.2 C). Identyfikacja fragmentów odbywa się poprzez porównanie kształtów krzywych denaturacji oraz precyzyjne wyznaczenie temperatury topnienia poszczególnych fragmentów DNA [33, 34]. Reakcja amplifikacji/analiza HRM Analiza HRM powinna być poprzedzona wnikliwą analizą reakcji amplifikacji DNA. Zła wydajność amplifikacji DNA z reguły prowadzi do błędnej analizy HRM. Przed analizą HRM należy przeanalizować trzy podstawowe parametry amplifikacji: wartość Ct, końcową wartość fluorescencji oraz wydajność reakcji. Pierwszym etapem analizy HRM jest normalizacja. Wymaga ona zdefiniowania linii podstawowej przed- i po denaturacji tak, aby składała się z możliwie dużej ilości punktów, lecz nie zachodziła na region przejścia. Normalizacja pozwala na porównanie krzywych denaturacji między sobą i automatyczną identyfikację genotypów na podstawie różnic w temperaturze topnienia (homozygoty) i kształtów krzywej denaturacji (heterozygoty). Krzywe zaliczane są do tego samego genotypu na podstawie wartości współczynnika procentowego. Oprogramowanie Systemu Eco pozwala także na przedstawienie wyników w postaci
różnicy krzywych denaturacji wyznaczonej w stosunku do wybranej próby referencyjnej. Wykresy te dobrze ilustrują różnice w badanych próbach [33, 34]. Podsumowanie Czułość metody msscp została oceniona na 86%, a jej powtarzalność na 99% w badaniach Bezak i wsp. [35], którzy wykorzystali tę technikę w analizie genu XI czynnika krzepnięcia, a następnie otrzymane wyniki potwierdzili przeprowadzając sekwencjonowanie z użyciem znaczników fluorescencyjnych. Biorąc pod uwagę mnogość czynników wpływających na efektywność analizy SSCP oraz fakt, że mutacje powodujące zmianę ruchliwości w jednych warunkach, mogą w innych okolicznościach takiej zmiany nie spowodować, dany fragment DNA bada się zazwyczaj w różnych warunkach, aby zwiększyć prawdopodobieństwo ujawnienia zmian sekwencji. Odsetek mutacji wykrywanych metodą SSCP mieści się w zakresie od 70% do >95% dla badań ze zmiennymi dwoma lub trzema parametrami [1, 2]. Jednym z najważniejszych czynników wpływających na efektywność analizy SSCP jest wielkość badanego fragmentu DNA. Optymalna długość ssdna powinna mieścić się w zakresie 150-200 pz. Dla fragmentów dłuższych niż 300 pz czułość analizy znacznie spada [2]. Zaletą techniki SSCP jest łatwa interpretacja wyników badania ze względu na możliwość porównania położenia prążka w żelu względem wzorca markera wielkości DNA. Wykorzystana w przeprowadzonych badaniach odmiana SSCP msscp charakteryzuje się wyższą czułością w stosunku do klasycznej analizy polimorfizmu konformacji jednoniciowych fragmentów DNA, z powodu zastosowania podczas elektroforezy gradientu temperatury zamiast przeprowadzania kilku rozdziałów elektroforetycznych w stałych temperaturach [7, 20]. Czułość techniki DGGE jest oceniana na 82-100%, kiedy do badanego fragmentu dołączona zostaje sekwencja GC clamp [4, 19, 36]. Jednakże niektórzy autorzy uważają, że na dzień dzisiejszy czułość DGGE jest za niska, aby metoda ta mogła być rutynowo wykorzystywana w praktyce klinicznej [19]. Aby analiza DGGE była w pełni efektywna, należy określić profil meltingu badanej sekwencji DNA oraz ustalić zakres gradientu, w którym przewiduje się uzyskać najlepsze rozdzielenie badanych fragmentów. Wyboru warunków dla elektroforezy z pionowym gradientem czynnika denaturującego można dokonać na dwa sposoby: albo wykorzystując specjalny program komputerowy (np. MacMelt firmy Bio-Rad), albo empirycznie, przez wykonanie elektroforezy poziomej w szerokim zakresie stężeń czynnika denaturującego (0-100%) [8, 27]. Użyteczność techniki DGGE jest ograniczona ze względu na konieczność posiadania specjalnego aparatu, przygotowywania żeli z gradientem związków denaturujących oraz syntezy primerów bogatych w pary GC (GC clamp). Dodatkowo, w przypadku pewnych sekwencji DNA (np. bogatych w pary GC lub zawierających więcej niż jedną domenę meltingu), istnieje konieczność modyfikowania produktu PCR albo sekwencji primera przed dokonaniem elektroforezy w gradiencie czynnika denaturującego, co wydłuża czas analizy i utrudnia jej wykonanie [8, 19, 26, 27]. Obecnie, metoda DGGE ustępuje miejsca swoim odmianom (TGGE, TTGE, CDGE), których główną zaletą jest wyeliminowanie z użycia żeli z gradientem chemicznego czynnika denaturującego [8, 28, 29]. Również μtgge wydaje się być techniką potencjalnie użyteczną w praktyce klinicznej, ze względu na znaczną redukcję kosztów i czasu analizy, a także niewielką objętość próbki potrzebną do przeprowadzenia badania. Jednakże na dzień dzisiejszy metoda ta nie jest powszechnie wykorzystywana, ponieważ dotychczas nie przeprowadzono badań oceniających na szeroką skalę jej czułość oraz swoistość [19, 31]. W przypadku analizy DGGE wskazane jest określenie, przy pomocy programu komputerowego, profilu meltingu dla każdego z badanych amplimerów, ponieważ w trakcie elektroforezy w gradiencie czynnika denaturującego istnieje możliwość wykrycia tylko tych mutacji, które znajdują się w obrębie domeny o najniższej temperaturze meltingu. Ponadto analiza komputerowa jest pomocna w wyborze optymalnych warunków analizy (zakresu gradientu czynnika denaturującego) oraz dobraniu odpowiednich sekwencji starterów [27]. Nową opartą na analizie PCR w czasie rzeczywistym techniką przydatną w analizie polimorfizmów jest analiza HRM. Piśmiennictwo 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. Napierała D i wsp. Wykrywanie mutacji punktowych i polimorfizmu DNA metodą SSCP. [W:] Słomski R red. Przykłady analiz DNA. Poznań: Wydawnictwo Akademii Rolniczej im. Augusta Cieszkowskiego w Poznaniu; 2004: 95-96. Vorechovsky I. Single Strand Conformation Polymorphism (SSCP) Analysis. [W:] Walker JM, Rapley R. red. Medical Biomethods Handbook. Totowa, New Jersey: Humana Press, Inc.; 2005: 73-77. Gasser RB i wsp. Single-strand conformation polymorphism (SSCP) for the analysis of genetic variation. Nat Protoc 2006; 1 (6): 3121-3128. Kakavas VK i wsp. PCR-SSCP: a method for the molecular analysis of genetic diseases. Mol Biotechnol 2008; 38(2): 155-163. Kakavas KV i wsp. Identification of the commonest cystic fibrosis transmembrane regulator gene DeltaF508 mutation: evaluation of PCR--single-strand conformational polymorphism and polyacrylamide gel electrophoresis. Biomed Chromatogr 2006; 20(10): 1120-1125. Li W i wsp. Estimation of the optimal electrophoretic temperature of DNA single-strand conformation polymorphism by DNA base composition. Electrophoresis 2003; 24 (14): 2283-2289. Constantinou M i wsp. Application of multiplex FISH, CGH and MSSCP techniques for cytogenetic and molecular analysis of transitional cell carcinoma (TCC) cells in voided urine specimens. J Appl Genet 2006; 47(3): 273-5. The DCode Universal Mutation Detection System. Bio-Rad 1996: 11-14, 27-28, 34-35. (http://www.bio-rad. com/webroot/web/pdf/lsr/literature/m1709080c.pdf). Børresen AL. Mismatch detection using heteroduplex analysis. Curr Protoc Hum Genet 2002 Aug;Chapter 7:Unit 7.3.
10. Kozlowski P, Krzyzosiak WJ. Structural factors determining DNA length limitations in conformation-sensitive mutation detection methods. Electrophoresis 2005; 26(1): 71-81. 11. Krasteva ME, Garanina Z, Georgieva EI. Optimized polymerase chain reaction-based single-strand conformation polymorphism analysis of p53 gene applied to Bulgarian patients with invasive breast cancer Clin Exp Med 2003; 3(3): 173-180. 12. van Oers JM. A simple and fast method for the simultaneous detection of nine fibroblast growth factor receptor 3 mutations in bladder cancer and voided urine Clin Cancer Res 2005; 11(21): 7743-7748. 13. Wang QM i wsp. Rapid Differentiation of Phenotypically Similar Yeast Species by Single-Strand Conformation Polymorphism of Ribosomal DNA Appl Environ Microb 2008; 74(9): 2604-2611. 14. Tsuji T, Niida Y. Development of a simple and highly sensitive mutation screening system by enzyme mismatch cleavage with optimized conditions for standard laboratories Electrophoresis 2008; 29(7): 1473-1483. 15. Kakavas VK. PCR-SSCP: a method for the molecular analysis of genetic diseases. Mol Biotechnol 2008; 38(2): 155-163. 16. Kasuga T, Cheng J, Mitchelson KR. Metastable singlestrand DNA conformational polymorphism analysis results in enhanced polymorphism detection. PCR Methods Appl 1995; 4(4): 227-233. 17. Abba MC, Gómez MA, Golijow CD. HLA-DQA1 allele typing by nonisotopic PCR-LIS-SSCP Braz J Med Biol Res 2001; 34(7): 867-869. 18. Kozlowski P, Krzyzosiak WJ. Combined SSCP/duplex analysis by capillary electrophoresis for more efficient mutation detection. Nucleic Acids Res 2001 15; 29(14): E71. 19. Hestekin CN, Barron AE. The potential of electrophoretic mobility shift assays for clinical mutation detection. Electrophoresis 2006; 27 (19): 3805-3815. 20. I Konferencja Użytkowników DNA Pointer System. Analiza zróżnicowania genetycznego metodą MSSCP. Kucharczyk Techniki Elektroforetyczne; Warszawa 15.05.2003: 14-22, 25 (http://www.kucharczyk.com.pl/ konf2003/full.pdf). 21. Yip SP, Fung LF, Lo ST. Rapid detection of common southeast Asian beta-thalassemia mutations by nonisotopic multiplex PCR-SSCP analysis. Genet Test 2004; 8(2): 104-108. 22. Feng J i wsp. Candidate gene analyses by scanning or brute force fluorescent sequencing: a comparison of DOVAM-S with gel-based and capillary-based sequencing. Genet Test. 2007; 11(3): 235-240. 23. Mroske C i wsp. Toward a fluorescent SSCP technique that detects all mutations: F-DOVAM-S. Anal Biochem 2007; 368 (2): 250-257. 24. Buzin CH i wsp. Scanning by DOVAM-S detects all unique sequence changes in blinded analyses: evidence that the scanning conditions are generic. Biotechniques 2000; 28 (4): 746-753. 25. Fregel R i wsp. Description of a simple multiplex PCR- SSCP method for AB0 genotyping and its application to the peopling of the Canary Islands. Immunogenetics 2005; 57(8): 572-578. 26. Roelfsema JH, Peters DJM. Denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE). [W:] Walker JM, Rapley R red. Medical Biomethods Handbook. Totowa, New Jersey: Humana Press, Inc.; 2005: 79-86. 27. Wu Y i wsp. Improvement of fragment and primer selection for mutation detection by denaturing gradient gel electrophoresis. Nucleic Acids Res. 1998; 26 (23): 5432-5440. 28. Buch JS. DNA mutation detection in a polymer microfluidic network using temperature gradient gel electrophoresis. Anal Chem 2004; 76(4): 874-81. 29. Shaji RV i wsp. Rapid detection of β-globin gene mutations and polymorphisms by temporal temperature gradient gel electrophoresis. Clin Chem 2003; 49 (5): 777-781. 30. Wong LJ i wsp. Improved detection of CFTR mutations in Southern California Hispanic CF patients. Hum Mutat. 2001; 18 (4): 296-307. 31. Biyani M, Nishigaki K. Hundredfold productivity of genome analysis by introduction of microtemperature-gradient gel electrophoresis. Electrophoresis 2001; 22 (1): 23-28. 32. Ridanpää M i wsp. Comparison of DGGE and CDGE in detection of single base changes in the hamster hprt and human N-ras genes. Mutat Res 1995; 334 (3): 357-364. 33. Wojdacz T i wsp. Limitations and advantages of MS- HRM and bisulfite sequencing for single locus methylation studies. Expert Review of Molecular Diagnostics 2010, 10(5): 575-580. 34. Montgomery JL., Sanford LN., Wittwer CT. High-resolution DNA melting analysis in clinical research and diagnostics. Expert Review of Molecular Diagnostics 2010, 10(2): 219-240. 35. Bezak A i wsp. Detection of single nucleotide polymorphisms in coagulation factor XI deficient patients by multitemperature single-strand conformation polymorphism analysis. J Clin Lab Anal 2005; 19 (6): 233-240. 36. Balogh K i wsp. Genetic screening methods for the detection of mutations responsible for multiple endocrine neoplasia type 1. Mol Genet Metab 2004; 83 (1-2): 74-81. data otrzymania pracy: 11.09.2010 r. data akceptacji do druku: 02.11.2010 r. Adres do korespondencji: dr Ewa Moric-Janiszewska Katedra i Zakład Biochemii Śląski Uniwersytet Medyczny w Katowicach ul. Narcyzów 1 41-200 Sosnowiec Tel. +48 32 364 10 06 e -mail: ejaniszewska@sum.edu.pl