CHEMIA ŚRODOWISKA - laboratorium ĆWICZENIE 6. OZNACZANIE ŚLADOWYCH ILOŚCI FENOLU W WODACH POWIERZCHNIOWYCH Głównymi chemicznymi zanieczyszczeniami wód są detergenty, pestycydy (fosforoorganiczne, polichlorowęglowodorowe), wielopierścieniowe węglowodory aromatyczne (WWA), polichlorofochodne bifenylu (PCB), fenole, metale ciężkie, azotany i związki fosforu. Każde z wymienionych zanieczyszczeń ma różne pochodzenie, niemniej ich obecność w wodzie w przekraczających normy ilościach stanowi zagrożenie z uwagi na toksyczne w większości właściwości. Fenole są wodorotlenowymi pochodnymi benzenu i stanowią liczną grupę związków chemicznych, które można oznaczać podobnymi metodami jak fenol. Ich obecność w środowisku wynika ze stosowania fenoli w wielu gałęziach przemysłu. Fenole są także produktem ubocznym w przemyśle chemicznym. Duże ilości fenoli dostają się do wód powierzchniowych wraz ze ściekami komunalnymi, a także przemysłowymi. Źródłami zanieczyszczenia wód fenolami są ścieki pochodzące z fabryk tworzyw sztucznych, produkcji barwników, farb, klejów czy lakierów, a także z przemysłu koksochemicznego, petrochemicznego i farmaceutycznego. Fenole spotykane w wodach naturalnych powstają z biologicznego rozkładu roślin, garbników i substancji humusowych na dnie zbiorników, jednak ich udział jest niewielki. Zatrucie fenolami zwykle jest efektem bezpośredniego kontaktu ze skórą lub z drogami oddechowymi. Obecność fenoli w wodach przyczynia się do wysokiej śmiertelności organizmów wodnych. Podczas chlorowania wody zawierającej nawet niewielkie ilości fenoli, 0,002 mg/dm 3, tworzą się chloropochodne fenoli charakteryzujące się przykrym zapachem, który czyni wodę niezdatną do użytku. Dopuszczalną ilość fenoli w wodach reguluje Rozporządzenie Ministra Środowiska w sprawie klasyfikacji dla prezentowania stanu wód powierzchniowych i podziemnych, sposobu prowadzenia monitoringu oraz sposobu interpretacji wyników i prezentacji stanu tych wód (Dz. U. Nr 32, poz. 284). Dopuszczalne zawartości fenoli w wodach o różnych klasach czystości zamieszczono w Tabeli 1. Tabela 1. Graniczne wartości stężeń fenoli w wodach. Klasa czystości wody I II III IV V Jakość wody bardzo dobra dobra zadowalająca niezadowalająca zła Fenole, mg/l 0,001 0,005 0,01 0,05 > 0,05 1
Spektrofotometria UV/VIS jest powszechnie stosowana do oznaczania fenoli w wodzie lub ściekach poprzez uprzednie przeprowadzenie fenoli w barwny związek absorbujący promieniowanie UV/VIS. Badaną próbkę zakwasza się do ph poniżej 4 za pomocą roztworu kwasu fosforowego (V) i poddaje się destylacji z parą wodną. W środowisku kwaśnym fenole są niezdysocjowanymi kwasami lotnymi, a fenolany nie destylują z parą wodną. Do oznaczeń wykorzystuje się tworzenie przez fenole barwnych pochodnych z 4-aminoantypiryną (1-fenylo-2,3-dimetylo-4-aminopirazolem). Reakcję prowadzi się w środowisku zasadowym w obecności heksacyjanożelazianu (III) potasu. Fenole z frakcji wodnej ekstrahuje się do frakcji chloroformowej wytrząsając w rozdzielaczu. Roztwory chloroformowe poddawane są pomiarom spektrofotometrycznym. Do oznaczenia fenoli wykorzystywana jest także chromatografia gazowa (GC). Stosując detektor płomieniowo-jonizacyjny (FID) oznaczalność fenoli wynosi 0,1 mg/dm 3. Detektor wychwytu elektronów (ECD) charakteryzuje większa oznaczalność, 0,05 µg/ dm 3. Niewielkie stężenia fenoli można oznaczać metodą chromatografii gazowej sprzężonej z detektorem masowym (GC-MS), a także za pomocą chromatografii cieczowej. EKSTRAKCJA DO FAZY STAŁEJ (SOLID PHASE EXTRACTION - SPE) Pomimo znanych licznych technik analitycznych służących do oznaczania coraz większej ilości analitów na poziomie śladowym niezwykle ważnym etapem procedury analitycznej jest przygotowanie próbki. Przygotowanie próbki do analizy jest etapem najbardziej czasochłonnym i takim, na którym można popełnić najwięcej błędów mogących wpłynąć na poprawność wyniku analizy. W celu ograniczenia liczby błędów popełnianych podczas przygotowania próbki do analizy należy starać się ograniczyć ilość przeprowadzanych procesów. Ekstrakcja do fazy stałej (SPE) lub też ekstrakcja ciecz-ciało stałe jest coraz bardziej popularną metodą przygotowania próbek do analiz, ponieważ umożliwia wyeliminowanie wieloetapowego przygotowania próbki, oddzielenie analitu od matrycy oraz zatężenie próbki. Ponadto technika ta nie wymaga wirowania czy destylacji. W technice SPE roztwór analizowanej próbki przechodzi przez złoże kolumny ekstrakcyjnej, na którym adsorbowane są anality. W kolejnym etapie wymywane są zanieczyszczenia, a następnie przy użyciu niewielkich ilości rozpuszczalnika zaadsorbowane anality. Poszczególne etapy techniki SPE przedstawiono na Rysunku 1. 2
Rysunek 1. Schemat postępowania podczas ekstrakcji do fazy stałej. Przed przystąpieniem do ekstrakcji SPE ważnym etapem jest dobór odpowiedniego wypełnienia kolumny. Są trzy typy sorbentów: polarne, niepolarne i wymieniacze jonowe. Najczęściej stosowane są sorbenty na bazie krzemionki, np. C-18, w którym żel krzemionkowy modyfikowany jest grupami oktadecylowymi, Florisil czy też niemodyfikowany żel krzemionkowy. W Tabeli 2 przedstawiono kilka rodzajów kolumienek do ekstrakcji SPE różnego typu związków. Tabela 2. Rodzaje kolumn wykorzystywanych do ekstrakcji do fazy stałej. Rodzaj analizowanych związków Związki niepolarne i średnio polarne Związki polarne Mocne kationy i zasady organiczne Słabe aniony i kwasy organiczne Symbol kolumny C-2 C-18 Ph CN Si Florisil SCX NH 2 Faza stała etylowymi oktadecylowymi fenolowymi cyjanopropylowymi Żel krzemionkowy Dwutlenek magnezu Kwas sulfonowy cyjanopropylowymi i aminopropylowymi Pierwszym etapem jest kondycjonowanie złoża kolumny, które służy do aktywowania przed naniesieniem roztworu analizowanej próbki. W tym celu przez kolumnę przepuszcza się rozpuszczalnik, którego dobór zależy od rodzaju kolumny. Należy pamiętać, aby nie dopuścić do wyschnięcia złoża 3
pomiędzy kondycjonowaniem a naniesieniem próbki. W tym celu pozostawia się nadmiar ok. 1 mm rozpuszczalnika w kolumnie. Kolejnym etapem jest naniesienie próbki na złoże kolumny. Ten rodzaj ekstrakcji pozwala na dozowanie od kilku mikrolitrów do litrów roztworu. Szybkość przepływu roztworu przez złoże nie powinna przekraczać 5 ml/min. Najczęściej stosuje się wymuszenie przepływu poprzez wytworzenie podciśnienia. Odmywanie matrycy stosuje się, aby usunąć z próbki zanieczyszczenia. Rozpuszczalnik powinien być tak dobrany, aby nie rozpuszczał zaadsorbowanych analitów. Optymalizuje się także skład (mieszaniny rozpuszczalników), ph i polarność. Ostatnim etapem jest elucja zaadsorbowanych analitów. Odpowiednio dobrany rozpuszczalnik, który rozpuszcza analizowaną substancję, o objętości od 200 µl do kilku ml należy dozować na złoże kilkoma małymi porcjami pozostawiając każdą porcję rozpuszczalnika na złożu od 20 do 60 sekund. Powoduje to wyższy stopień odzyskania analitów. Tak otrzymany eluat poddaje się odpowiedniej analizie lub, jeśli zachodzi taka konieczność, poddaje się dalszej obróbce. Znanych jest kilka układów aparaturowych, które umożliwiają zastosowanie techniki SPE. Najprostszą z nich jest specjalny zestaw próżniowy przedstawiony na Rysunku 2. Przy użyciu takiej aparatury można wykonywać kilka lub nawet kilkanaście ekstrakcji jednocześnie. Przepływ cieczy przez każde ze złóż można niezależnie regulować specjalnymi kranikami. Rysunek 2. Typowy zestaw do ekstrakcji techniką SPE. Bardzo podobny układ, ale jednostanowiskowy, można zmontować ze szkła dostępnego w każdym laboratorium. Potrzebna jest jedynie kolba próżniowa i kolumna SPE. Próżnię w układzie reguluje się manualnie. Schemat zestawu aparaturowego przedstawiono na Rysunku 3. 4
Próbka wody Korek powietrze Próżnia Probówka Rysunek 3. Zestaw do ekstrakcji techniką SPE w kolbie próżniowej. Przepływ substancji można wymusić poprzez zastosowanie strzykawki. Wciskanie tłoczka strzykawki lub wprowadzenie gazu powoduje przepływ cieczy przez kolumnę SPE, Rysunek 4. Przepływ wymuszony tłoczkiem strzykawki Przepływ wymuszony przez wprowadzenie gazu Strzykawka N2 lub Adapter Próbka wody Próbka wody Rysunek 4. Zestaw do ekstrakcji techniką SPE z użyciem strzykawki. 5
Próbki przygotowane metodą ekstrakcji do fazy stałej są wykorzystywane w analizach metodami chromatograficznymi, w chromatografii cieczowej (HPLC), gazowej (GC) i w spektrofotometrii FTIR. WYKONANIE ĆWICZENIA Przygotowanie próbki W 100 ml wody pobranej z rzeki lub jeziora należy rozpuścić 20 g NaCl. Stosując 1 M HCl doprowadzić do ph 2. Przygotowanie próbek z odpowiednim dodatkiem wzorca Do trzech 100 ml próbek wody dodać kolejno 5, 7.5 i 10 ml roztworu fenolu o stężeniu 20 mg/l. Następnie 20 g NaCl należy rozpuścić w każdej z próbek i 1 M HCl doprowadzić do ph 2. Ekstrakcja na fazie stałej Do ekstrakcji stosowane są kolumny C18 o objętości 3 ml, w której zawartość adsorbentu (oktadecylu osadzonego na żelu krzemionkowym) wynosi 500 mg. Kondycjonowanie kolumn Kolumny przemyć dwukrotnie 3 ml metanolu, a następnie dwukrotnie 3 ml 0,01 M HCl. Należy nie dopuścić do wyschnięcia kolumn. Naniesienie próbek Na kolejne kolumny nanieść próbki wody. Szybkość przepływu wody przez sorbent nie powinna być większa niż 5 ml na minutę. Przemywanie kolumn Kolumny przemyć dwukrotnie 500 μl 0,01 M HCl, a następnie osuszyć pod próżnią. Wymywanie analitu Wymyć analit do mikroprobówek trzykrotnie 500 μl metanolu. 6
Oznaczanie spektrofotometryczne fenolu Ilościowo przenieść ekstrakty do kolb o pojemności 50 ml. Kolejno dodać do kolb 1 ml nitroprusydku sodu o stężeniu 0,01 mol/l, 1 ml chlorowodorku hydroksyaminy o stężeniu 0,04 mol/l i 3 ml buforu fosforowego o ph=12 i dopełnić wodą destylowaną do kresek. Wymieszać, odczekać 15 min i zmierzyć absorbancję roztworów przy λ=700 nm. Obliczyć stężenie fenolu analizowanej próbki. Autorzy: Agata Śliwak, Grażyna Gryglewicz 7