Wektory DNA - klonowanie molekularne
Fragment DNA (np. pojedynczy gen) można trwale wprowadzić do komórek gospodarza (tzn. zmusić go do powielania w tym gospodarzu) tylko wtedy, gdy zostanie on wbudowany tj. zrekombinowany in vitro z odpowiednim elementem genetycznym zwanym wektorem czyli cząsteczką DNA zdolną do wnikania do wnętrza komórek tego gospodarza zdolną do autonomicznej replikacji O takim fragmencie DNA wbudowanym do wektora i wprowadzonym do jakiegoś gospodarza (najczęściej bakteryjnego) mówimy że jest on sklonowany w bakteriach
Co oznacza klonowanie molekularne? Termin klonowanie w odniesieniu do pojedynczego fragmentu DNA oznacza namnożenie określonego odcinka DNA w komórkach gospodarza, najczęściej bakterie np. Escherichia coli, przy zastosowaniu odpowiedniego wektora. Klonowanie DNA jest podstawową techniką inżynierii genetycznej. Klonowanie molekularne umożliwia: znalezienie, wyizolowanie i namnożenie wybranego genu z genomu jakiegoś organizmu, przeprowadzania manipulacji, na przykład mutagenezy, uzyskiwania ekspresji genu, czyli produkcji kodowanego przez niego produktu. Do klonowania molekularnego niezbędne są dwa elementy: wektor gospodarz
Nie zawsze celem klonowania molekularnego jest produkcja białka przez komórki bakteryjne - sklonowanie fragmentu DNA jest często celem samym w sobie Transformation
Klonowanie molekularne można przeprowadzić w komórkach mikroorganizmów jak i eukariotycznych, ale: Klonowanie w komórkach prokariotycznych jest nieporównywalnie prostsze ponieważ komórki bakteryjne łatwo jest hodować i izolować z nich duże ilości specyficznego DNA, które można poddawać kolejnym zabiegom: : sekwencjonowaniu, mapowaniu, transformacji, hybrydyzacji itd. W bakteriach możemy z powodzeniem klonować (powielać) geny prokariotyczne i eukariotyczne. Mówimy klonowanie molekularne = myślimy klonowanie w bakteriach
Jako wektorów do klonowania molekularnego w mikroorganizmach używa się: 1. Plazmidów 2. Bakteriofagów 3. Kombinacji elementów genetycznych plazmidowofagowych np. kosmidów, fagemidów, itp.
Wektory plazmidowe 1. Ogólnego przeznaczenia proste powielanie wybranego genu 2. Wektory do zadań specjalnych (są to wektory, które oprócz samego powielania DNA umożliwiają np. wydajną ekspresję sklonowanego genu produkcję białka badanie własności sklonowanego genu lub odcinka DNA otrzymywanie jednoniciowego DNA (ssdna) stabilne powielanie ekstremalnie duże fragmentów DNA konstrukcja banków (bibliotek) genomowych
Cechy dobrego wektora plazmidowego Zdolny do autonomicznej replikacji (niezależnej od chromosomu gospodarza) kilkadziesiąt kilkaset pz musi posiadać tzw. origin replikacji oriv (nieliczne wektory integracyjne, wbudowują się do DNA gospodarza, są bardziej stabilne, mają mniejszą ilość kopii) Marker selekcyjny (czyli gen kodujący białko odpowiedzialne za łatwo wyróżnialne cechy fenotypowe. Wektor musi być tak skonstruowany aby istniała możliwość selekcji tych komórek, do których wniknął. MCS (multiple cloning site miejsce wielokrotnego klonowania tzw. polilinker) Pozwala na swobodny dobór odpowiedniego do klonowania enzymu Wektor powinien być niezdolny do przeżycia poza komórką gospodarza, namnażać się w niewielu szczepach (mały zakres gospodarza), nie posiadać zdolności koniugacyjnych. Powinien być stosunkowo niewielki (poniżej 10 kpz)
Wektory plazmidowe miejsce startu replikacji Miejsce startu replikacji (oriv ) wektora plazmidowego determinuje: ilość kopi wektora w komórce zgodność z innymi wektorami plazmidowymi Plazmid Replikon (oriv) Ilość kopii na komórkę pbr322 i pochodne pmb1 15-20 wektory serii puc pmb1 500-700 pacyc i pochodne p15a 10-12 psc101 i pochodne psc101 ~5 ColE1 ColE1 15-20 Replikony ColE1 i pmb1 są niezgodne, są natomiast zgodne z psc101 i p15a
Plazmidy takie jak puc umożliwiają tzw. wizualną identyfikację klonów zrekombinowanych dzięki wstawieniu do wektora genu kodującego enzym, który rozkłada barwny substrat. MCS znajduje się wtedy w obrębie tego genu. Jego przerwanie przez wstawienie obcego DNA sprawia że kolonie zawierające zrekombinowany i niezrekombinowany wektor rosną na płytce w różnych kolorach Wektor zawiera N-końcowy fragment beta-galaktozydazy (genu lacz), wprowadza się go komórek, które syntetyzują tylko część C-końcową LacZ (niosących zmutowany gen lacz). Obydwa peptydy mogą asocjować ( -komplementacja) tworząc aktywne enzymatycznie białko.
Szczep gospodarza bakteryjnego do klonowania molekularnego nie jest przypadkowy! X-gal sztuczny substrat dla beta-galaktozydazy IPTG sztuczny induktor beta-galaktozydazy (tzw. bezinteresowny)
Selekcja zrekombinowanych klonów może zachodzić przez zahamowanie namnażania się komórek zawierających niezrekombinowany plazmid. Takie wektory zawierają gen letalny dla komórki gospodarza. Insercja klonowanego DNA inaktywuje ekspresję letalnego genu umożliwiając wzrost rekombinantów.
Wektory plazmidowe specjalnego przeznaczenia I. Plazmidowe wektory ekspresyjne pozwalają na nadprodukcję (nadekspresję) białka w komórkach gospodarza - bakteriach Co wyróżnia wektory ekspresyjne? 1. Silny, regulowany promotor rozpoznawany przez polimerazę RNA gospodarza Silny promotor powoduje, że w specyficznych warunkach transkrypcja jest inicjowana wiele razy na minutę regulowany można go włączać i wyłączać Ptac promotor hybrydowy zlożony z regionu -35 promotora trp i regionu promotorowo/operatorowego-10 lac. Ekspresja Ptac podlega represji przez białko LacI. PL faga, lac E. coli, trp E. coli, bla (promotor genu -laktamazy E. coli).
2. Wektory ekspresyjne są wyposażone w sekwencje niezbędne do translacji mrna sklonowanego genu
II. Wektory do badania własności sklonowanego genu lub odcinka DNA, np. do badania aktywności promotorów Fragmenty DNA wprowadza się w tych wektorach w pobliżu genu reporterowego np. pozbawionego własnego promotora genu lacz i mierzy aktywność jego ekspresji oriv XhoI BglII EcoRI KpnI XbaI PstI orit trfa MCS lacz pmp220 (104000 pz) Tet
Wektory do rekombinacji nietypowych fragmentów DNA Nietypowych: uzyskanych inaczej niż przez trawienie cząsteczek DNA enzymami restrykcyjnymi np. fragmentów DNA, które zostały uzyskane w reakcji PCR
2. Wektory bakteriofagowe
Wektory fagowe: bakteriofag
Wektory fagowe: bakteriofag Fag zawiera ds DNA wielkości 48502 pz, 12 pz jednoniciowe lepkie końce cos Ok. 60% genomu faga jest niezbędna do jego litycznego cyklu życiowego, środkowa część 15 kpz (ok. 1/3) może być zastąpiona obcym DNA. DNA z delecją nie może być pakowany w główki, co staje się zaletą ponieważ tylko DNA ze wstawionym obcym DNA może się zapakować w główki (dobra selekcja fagów zrekombinowanych).
Schemat klonowania DNA w bakteriofagu
Inne wektory bakteriofagowe: pochodne bakteriofaga P1 (Sternberg 1990) podobne do faga, oparte na wersjach delecyjnych genomu faga P1. P1 ma większy niż genom co pozwala klonować większe fragmenty DNA do 125 kpz konstrukcja bibliotek genomowych
3. Kombinacje plazmidów i bakteriofagów a) Fagemidy Powstały przez wprowadzenie do wektora plazmidowego miejsca startu replikacji z bakteriofaga M13 lub f1 Wektory te służą do powielania fragmentu DNA oraz do otrzymywania jednoniciowych kopii DNA Jednoniciowe matryce stosowane są do sekwencjonowania DNA lub syntezy znakowanego np. radioaktywnie ssdna.
b) Kosmidy- wektory plazmidowe wyposażone w sekwencję cos faga, ich wielkość wynosi od 5 do 8 kpz co oznacza, że można do niego sklonować od 35-45 kpz. Zastosowanie Konstrukcja bibliotek genomowych
Fosmidy - specyficzna odmiana kosmidów Zawierają miejsce startu replikacji z plazmidu F oraz sekwencję cos z faga. Budowa podobna do kosmidów, Znacznie mniejsza ilość kopii na komórkę i dzięki temu większa stabilność.
Wektory drożdżowe Drożdże jako komórki gospodarzy posiadają pewne niezaprzeczalne zalety: mają struktury komórkowe typowe dla eukariota ale są jednokomórkowe geny w nich klonowane mogą zawierać sekwencje intronowe ponieważ proces obróbki mrna jest zbliżony do tego, który występuje u wyższych eukariontów powstające białka mogą podlegać modyfikacjom potranslacyjnym. Kiedy zatem użyć drożdży jako gospodarza w klonowaniu molekularnym? 1. W przypadku klonowania eukariotycznych genów 2. wtedy gdy zależy nam nie tylko na prostym powieleniu DNA, ale także na uzyskaniu ekspresji genu w komórce eukariotycznej i otrzymaniu białek odpowiednio zmodyfikowanych potranslacyjnie
WEKTORY DROŻDŻOWE - wektory wahadłowe (ang. shuttle vector) wahadłowość to cecha typowa dla wielu wektorów eukariotycznych Wektory bifunkcjonalne (wahadłowe) mają odrębne miejsca startu replikacji (jedno z nich uruchamiane jest w eukariotycznych komórkach drożdży, drugie zaś w prokariotycznych komórkach E. coli) geny markerowe dla komórek drożdżowych jak i bakteryjnych np. E. coli umożliwia to wygodne utrzymywanie wektora w komórkach bakteryjnych oraz np. wprowadzanie i badanie ekspresji genów eukariotycznych w drożdżach. 1983 Murray i Szostak sztuczny chromosom drożdżowy - YAC (Yeast artificial chromosome)
YAC składa się z części eukariotycznej która zawiera: odcinek ori ARS, centromer CEN, telomery i geny selekcyjne (np. his3, trp1, ura3 nie są to geny oporności na antybiotyk) przynajmniej jedno unikalne miejsce restrykcyjne do klonowania obcego DNA System do wizualnej selekcji klonów zrekombinowanych sup4 (białe i różowe) ale nie jest to alfa-komplementacja prokariotycznej- (plazmidowe ori i marker selekcyjny oporność na antybiotyk) BamH1 Sup4 BamH1 YAC ma wielkość 10-15 kb (chromosom drożdżowy od 230-1700 kpz) co oznacza w YAC-u można sklonować odcinek DNA rzędu 2,5 Mpz) Wady: niestabilność wstawionego DNA i tendencja do rearanżacji wstawek przez nikontrolowaną rekombinację
Zrekombinowane YAC-i są w drożdżach stabilne mitotycznie nawet bez presji selekcyjnej i utrzymują się jako liniowy minichromosom (w ilości 1-2 kopii na kom.)
Wektory do komórek wyższych eukariontów (zwierząt i ludzi) Należy rozpatrywać je raczej w kategoriach systemów dostarczania gotowego konstruktu DNA lub transgenu Są w większości wektorami wahadłowymi Oparte głównie na wirusach: są to rekombinowane wirusy zawierające wewnątrz otoczki zrekombinowane DNA np. sekwencje terapeutyczne, które zastępują geny kodujące samego wirusa. Podstawowe wirusowe systemy transferu genów do komórek eukariotycznych (zwierzęcych i ludzkich) to: - rekombinowane wektory retrowirusowe oraz lentiwirusowe (HIV), - rekombinowane wektory adenowirusowe, - rekombinowane wektory na bazie wirusów typu herpes Znajdują zastosowanie w tzw. badaniach podstawowych in vitro (linie komórkowe) oraz terapii genowej i transgenezie Rekombinowane wektory retrowirusowe i adenowirusowe są najczęściej stosowanymi wektorami wirusowymi wykorzystywanymi w nielicznych dopuszczonych protokołach terapii genowej np. nowotworów
Podstawowe kryteria którymi należy kierować się przy tworzeniu wektorów wirusowych np. niosących terapeutyczne DNA to bezpieczeństwo specyficzność i stabilność dostarczania genów efektywność namnażania się w liniach komórkowych (produkcyjnych) - wysokie miano (liczba cząsteczek rekombinowanego wirusa w jednostce objętości) prosty system produkcji możliwość dostarczania materiału genetycznego o dużych rozmiarach brak immunogenności Aktualnie nie dysponujemy jednym uniwersalnym nośnikiem wirusowym, a powyższe cechy charakteryzują różne systemy wektorów. W związku z tym faktem, poszczególne systemy wirusowe wykorzystuje się do odpowiednich strategii i zastosowań lub konkretnych typów terapii genowych
Co w trakcie konstrukcji wektora można usunąć z wirusa a co musi w nim pozostać? Funkcje (i geny) wirusowe można podzielić na cis i trans. Cis to takie które nie mogą zostać usunięte z genomu wirusa np. miejsce startu replikacji lub sygnał "pakujący". Natomiast trans to geny których funkcje mogą z powodzeniem zostać zastąpione przez analogi pochodzące od zmodyfikowanych linii komórek pakujących. Zwykle dąży się do tego aby wszystkie geny trans usunąć z genomu wirusa i umieścić je w genetycznych elementach pomocniczych. Daje to dużo miejsca na obce geny a poza tym zwiększa bezpieczeństwo, gdyż tak powstały wirus jest niezdolny do namnażania się poza komórkami pakującymi
Rekombinowane wektory retrowirusowe Wektory retrowirusowe oparte są najczęściej na Mysim Wirusie Białaczki Moloney a - MoMLV (Moloney Murine Leukemia Virus) Retrowirusy to podstawowa grupa znajdująca zastosowanie w terapii nowotworów, gdyż mają one naturalną skłonność do infekowania intensywnie dzielących się komórek (zaleta i wada) gag strukturalne białka płaszcza wirusa pol odwrotna transkryptaza env glikoproteiny otoczki wirusa LTR - Long terminal repeat sekwencja promotoroworegulatorowa na każdym z końców genomu RNA wirusa
Ponieważ wektor jest wahadłowy możemy go zrekombinować w bakteriach np. E. coli
Drugi składnik to linia komórek tzw. pakujących z prowirusem pozbawionym sekwencji psi a posiadającym geny kodujące białka otoczki wirusa i odwrotną transkryptazę (geny: gag, pol, env). DNA retrowirusa z włączonym do niego obcym genem (pierwszy składnik) wprowadza się do komórek pakujących W komórkach pakujących DNA retrowirusa zostaje przepisane na RNA a to z kolei jest pakowane jest w otoczki białkowe. Takie wiriony izoluje się i infekuje nimi komórki docelowe, w których następuje przepisanie RNA na DNA, które z kolei włączane jest do chromosomu właściwego biorcy
wektory wahadłowe rekombinuje się w bakteriach np. E. coli a do komórek eukariotycznych (pakujących) wprowadza się gotowe konstrukty
Osobną grupę wektorów retrowirusowych stanowią pochodne lentivirusów, takich jak HIV. Mogą one zakażać nie tylko komórki dzielące się lecz praktycznie wszystkie Wektory adenowirusowe Adenowirusy mogą infekować duży wachlarz typów komórek, także nie dzielące się i są w miarę łagodne Ekspresja genów wprowadzony za ich pomocą jest silna i stabilna ale dość krótkotrwala, ponieważ DNA wirusa znajduje się poza DNA gospodarza (nie integrują się z genomem gospodarza) i dlatego nie ulega replikacji. W kolejnych pokoleniach komórek wprowadzonego DNA jest coraz mniej. Doskonale nadają się do terapii genowej mającej na celu zniszczenie komórek (suicide genes), ale nie są odpowiednie do dostarczania genów terapeutycznych
Wektory bazujące na herpeswirusach Spośród herpeswirusów jako wektory są wykorzystywane dwa: Herpes simplex i Epstein-Barr pojemność wektora Herpes simplex wynosi 40-50 kb. Epstein-Barr virus ma duży genom (ok. 172 kb), a przy tym koniecznymi elementami cis są tylko dwa elementy, orip, miejsce startu replikacji i gen EBNA-1, w sumie mające długość ok. 4 kb. Pozwala to na wprowadzenie bardzo dużych fragmentów DNA Wirusy herpes nie wbudowują swojego meteriału genetycznego w genom gospodarza. Mają one jednak powinowactwo do neuronów, dlatego bada się je głównie pod kątem ukierunkowanej terapii genowej tkanki nerwowej, m.in. w leczeniu choroby Parkinsona, złośliwych gliom (nowotworów mózgu).
Markery selekcyjne stosowane w wektorach eukariotycznych W eukariotycznych komórkach biorcy najczęściej selekcjonuje się tzw. markery dominujące, czyli geny wyrażane w każdym tle genetycznym (nie są to geny oporności na antybiotyki) Wyjątkami jeśli chodzi o markery selekcyjne będące genami oporności, które mogą być użyte w komórkach eukoriotycznych są: Kan - gen kodujący kinazę kanamycyny (możliwa do użycia w komórkach roślinnych) oporność na kanamycynę Neo bakteryjny gen oporności na neomycynę. Może on ulegać ekspresji w komórkach eukariotycznych jeśli wyposaży się go w eukariotyczne sekwencje regulatorowe Neo może być używane do selekcji komórek eukariotycznych, ponieważ produkt genu inaktywuje antybiotyk G418, który jest toksyczny dla komórek eukariotycznych. Ponadto nie występuje spontaniczna oporność na G418 w komórkach eukariotycznych.