44 Z. SZWEYKOWSKA-KULIÑSKA, B. SZARZYÑSKA,. SOBKOWIAK, A. JARMO OWSKI them are unexpectedly long (the longest, MIR156c 3108 bp) and contain introns. P

ROŒLINNE GENY MIKRO RNA 43 POSTÊPY BIOLOGII KOMÓRKI TOM 36, 2009 SUPLEMENT NR 25 (43 58) Rola komórek dendrytycznych w odpowiedzi transplantacyjnej* The role of dendritic cells in transplantation Maja Budziszewska1, Anna Korecka-Polak1, Gra yna Korczak-Kowalska1,2 1Zak³ad Immunologii, Wydzia³ Biologii, Uniwersytet Warszawski 2 Instytut Transplantologii, Warszawski Uniwersytet Medyczny *Dofinansowanie z grantu MNiSzW nr N N402 268036 Streszczenie: Komórki dendrytyczne (DC) s¹ najwa niejszymi komórkami prezentuj¹cymi antygen (APC) limfocytom T. Stopieñ dojrza³oœci komórki DC ma STRUKTURA ROŒLINNYCH GENÓW MIKRO RNA kluczowe znaczenie dla rodzaju odpowiedzi limfocytów T. Niedojrza³a komórka DC indukuje ORAZ stan POTENCJALNE tolerancji, podczas gdy MO LIWOŒCI dojrza³a komórka DC REGULACJI - pe³n¹ odpowiedÿ immunologiczn¹. Ma to ogromne ICH znaczenie EKSPRESJI w transplantologii, a zw³aszcza w reakcjach odrzucania przeszczepu po transplantacjach narz¹du. Komórka DC dawcy prezentuje antygen PLANT w sposób MICRO bezpoœredni, RNA GENE natomiast STRUCTURES komórka DC biorcy drog¹ poœredni¹. AND Komórki POSSIBLE DC WAYS niedojrza³e OF THEIR lub o w³aœciwoœciach EXPRESSION REGULATION tolerogennych mog¹ wyd³u yæ prze ycie przeszczepu allogenicznego. Takie oddzia³ywanie na funkcjê komórek Zofia DC, SZWEYKOWSKA-KULIÑSKA, aby by³y one niewra liwe na sygna³y Bogna dojrzewania SZARZYÑSKA, in vivo lub aktywowanie komórek ukasz SOBKOWIAK, DC charakteryzuj¹cych Artur JARMO OWSKI siê trwa³ymi w³aœciwoœciami tolerogennymi mo e poprawiæ tolerancjê przeszczepu. W tym celu wykorzystuje siê hodowle Zak³ad prowadzone Ekspresji w Genów, specyficznych Instytut Biologii warunkach, Molekularnej leczenie i farmakologiczne Biotechnologii, oraz in ynieriê Wydzia³ genetyczn¹. Biologii, Uniwersytet im. A. Mickiewicza w Poznaniu S³owa kluczowe: Komórka dendrytyczna, transplantacja, tolerancja przeszczepu. Streszczenie: Summary: Mikro The RNA, most to important krótkie (18 24 antigen-presenting nt) cz¹steczki kwasu cells rybonukleinowego (APCs) are dendritic pe³ni¹ce funkcje cells (DCs), regulatorowe which na poziomie present potranskrypcyjnym. antigen to T cells. Mikro The RNA state s¹ zaanga owane of maturation w regulacjê of DCs kluczowych is crucial for procesów induction rozwojowych of a T-cell u organizmów lymphocyte eukariotycznych. response. W The proces immature dojrzewania DCs cz¹steczek induce tolerance, mikro RNA the u roœlin mature zaanga owanych DCs - immunity. jest kilka bia³ek: This is DCL1, important HYL1, in SERRATE, transplantology, HEN1, DDL, especially HASTY. Biogeneza in graft cz¹steczek mikro RNA u roœlin i zwierz¹t ró ni siê w szczegó³ach. Bardzo ma³o wiadomo na temat rejection sekwencji nukleotydowych after organ transplantation. prekursorów mikro Donor RNA oraz DCs na act temat via struktury the direct, genów while koduj¹cych recipient cz¹steczki via mikro the RNA indirect u roœlin. pathways Do tej pory scharakteryzowano of allorecognition. dok³adnie Immature budowê jedynie DCs or 31 DCs spoœród with 190 DCs tolerogenic genów MIR u Arabidopsis properties thaliana. may prolong Geny MIR allograft u roœlin stanowi¹ survival. zazwyczaj Manipulating niezale ne DCs jednostki function transkrypcyjne, to be insensitive s¹ bardzo to d³ugie maturation (nawet 3108 signals pz) i or czêsto activate zawieraj¹ DCs introny. with U tolerogenic roœlin znane properties s¹ równie policistronowe geny MIR, jak równie geny koduj¹ce mikro RNA nak³adaj¹ce siê z genami koduj¹cymi bia³ka. are the Roœlinne promising mikro means RNA mog¹ of improving tak e wystêpowaæ allograft w intronach tolerance. genów There koduj¹cych are three bia³ka. approaches Transkrypty to genów achieve MIR these u A. thaliana aims: specific wykazuj¹ znaczn¹ cell culture heterogennoœæ conditions, budowy pharmacological i podlegaj¹ skomplikowanym treatment procesom and genetic dojrzewania: engineering. splicingowi, alternatywnemu splicingowi, stwierdzono obecnoœæ alternatywnych Keywords: miejsc poliadenylacji Dendritic prekursorów, cell, transplantation, a dodatkowo transkrypcja graft tolerance, tych genów graft mo e rejection. byæ inicjowana w wiêcej ni jednym miejscu. Transkrypcja, jak i potranskrypcyjna obróbka prekursorów mikro RNA Wstêp stanowi¹ etapy, na których dochodzi do regulacji poziomu dojrza³ych cz¹steczek mikro RNA. Wraz z przeszczepianym narz¹dem do organizmu biorcy dostaj¹ siê S³owa kluczowe: gen MIR, mikro RNA, pre-mirna, pri-mirna, splicing alternatywny, poliadenylacja, ró norodne komórki mi¹ szowe wyposa one w antygeny zgodnoœci tkankowej policistron, geny nak³adaj¹ce siê. (MHC) oraz grupa komórek okreœlanych jako "leukocyty pasa erskie", Summary: odpowiedzialna Micro RNAs za reakcjê are short odrzucania (18-24 nt) sequence-specific przeszczepu. S¹ regulatory to m.in. molecules komórki of eukaryotic dendrytyczne organisms. Micro RNAs control gene expression at the posttranscriptional level by targeting the cleavage of complementary (DC), które w mrnas pewnych or by inhibiting warunkach their zamiast translation. prowadziæ At least six proteins do odrzucenia are involved przeszczepu in the processing mog¹ of primary sprzyjaæ mirna jego precursors akceptacji in A. thaliana: [5,16]. DCL1, Precyzyjne HYL1, SE, okreœlenie DDL, HEN1 and roli HASTY. komórek Very little dendrytycznych is known about w plant odpowiedzi pri-mirnas transplantacyjnej and MIR gene structures. i opracowanie Until now only metod 31 Arabidopsis modyfikowania thaliana MIR ich genes funkcji from mo e among 190 przyczyniæ known MIR siê loci do are precisely poprawienia characterized. rezultatów Plant MIR osi¹ganych genes are usually w transcripted from their own loci. The analysis of Arabidopsis thaliana MIR genes revealed that most of transplantologii. 1. Charakterystyka komórek dendrytycznych Komórki dendrytyczne s¹ profesjonalnymi komórkami prezentuj¹cymi antygen (APC), obecnymi w centralnych (grasica i szpik) i we wtórnych (wêz³y limfatyczne, kêpki Peyer'a i œledziona) narz¹dach limfatycznych [2]. Posiadaj¹ zdolnoœæ do

44 Z. SZWEYKOWSKA-KULIÑSKA, B. SZARZYÑSKA,. SOBKOWIAK, A. JARMO OWSKI them are unexpectedly long (the longest, MIR156c 3108 bp) and contain introns. Plant MIR genes can be also organized in polycistrons and there are examples of micro RNA-coding sequences overlapping with other genes or localized within introns of other, protein-coding plant genes. Pri-miRNAs are heterogenous in length and structures. Micro RNA precursors undergo splicing and alternative splicing, posses alternative polyadenylation sites and their transcription can start at alternative transcription start sites. The cellular level of mature micro RNA molecules can be regulated during transcription and also at posttranscriptional level during processing of pri-mirnas. Key words: MIR gene, micro RNA, pre-mirna, pri-mirna, alternative splicing, polyadenylation, polycistron, overlapping genes. WSTÊP Mikro RNA s¹ przedstawicielami klasy krótkich RNA (srna small RNA). Ich d³ugoœæ waha siê w przedziale 18 24 nt. Cz¹steczki te wystêpuj¹ u niemal wszystkich organizmów eukariotycznych, a ich funkcj¹ jest potranskrypcyjne hamowanie ekspresji docelowego genu. Mikro RNA, w³¹czone w wielobia³kowy kompleks RISC (ang. RNA Induced Silencing Complex), hybrydyzuj¹ z docelow¹ cz¹steczk¹ mrna. Regulacja ekspresji genu zachodzi albo poprzez hamowanie translacji, albo rozcinanie mrna w œrodku rejonu tworz¹cego dupleks z mikro RNA. Cz¹steczki mikro RNA po raz pierwszy zidentyfikowano w pracowni Victora Ambrosa, który prowadzi³ prace nad regulacj¹ ekspresji genów w trakcie rozwoju nicienia Caenorhabditis elegans [17]. Okaza³o siê, e mikro RNA, zwany lin-4, blokuje translacjê bia³ka Lin-4, co zapewnia prawid³owy przebieg wczesnych etapów rozwoju larwalnego. Wyniki te sugerowa³y zatem, e mikro RNA mog¹ byæ kluczowe w kontroli procesów rozwojowych u Eukaryota. Przypuszczenie to okaza³o siê s³uszne i dziœ wiemy, e mikro RNA bior¹ udzia³ w kontroli fundamentalnych procesów rozwojowych i ró nicowania organizmów eukariotycznych. Pierwsze prace na temat roœlinnych mikro RNA ukaza³y siê dopiero w 2002 roku i dotyczy³y identyfikacji 16 takich cz¹steczek u modelowej roœliny Arabidopsis thaliana [22, 24]. Dziœ znanych jest 190 ró nych genów mikro RNA (MIR) u tej roœliny, a dane na ich temat zdeponowane s¹ w bazie mirbase (dane z dnia 24.11.2009 r., www.mirbase.org/cgibin/browse.pl) [10]. Ta sama baza danych podaje, e u cz³owieka znanych jest 721 genów MIR. Dysproporcja w liczbie zidentyfikowanych ró nych genów MIR miêdzy cz³owiekiem i rzodkiewnikiem (niemal cztery razy wiêcej u cz³owieka, podczas gdy liczba genów koduj¹cych bia³ka jest tylko 1,4 razy wy sza) mo e sugerowaæ, e najprawdopodobniej genom tej roœliny zawiera szereg loci koduj¹cych dot¹d niescharakteryzowane mikro RNA. ZWIERZÊCE I ROŒLINNE MIKRO RNA: PODOBIEÑSTWA I RÓ NICE Intensywnie prowadzone badania nad zwierzêcymi i roœlinnymi mikro RNA doprowadzi³y do ustalenia podobieñstw i ró nic w powstawaniu i dzia³aniu tych cz¹steczek. Z pewnym zdziwieniem stwierdzono, e brak takich samych rodzajów

ROŒLINNE GENY MIKRO RNA 45 mikro RNA u zwierz¹t i roœlin. Odkrycie to sugeruje, e u wspólnego przodka przedstawicieli królestw roœlin i zwierz¹t brak by³o œcie ki regulacji ekspresji genów przez mikro RNA oraz e œcie ka ta powsta³a dwa razy, niezale nie, z bardziej pierwotnego systemu [18]. Zarówno u zwierz¹t, jak i u roœlin prekursory mikro RNA s¹ g³ównie transkrybowane przez polimerazê RNA II, a co za tym idzie, na koñcu 5' transkryptów znajduje siê struktura kapu, a na koñcu 3' ogon polia. W pierwotnych transkryptach wystêpuje charakterystyczna struktura spinki do w³osów. Transkrypty nosz¹ miano pri-mirna (ang. primary mirna). J¹drowy enzym Drosha u zwierz¹t, a DCL1 (DICER-LIKE 1) u roœlin skraca pri-mirna do pre-mirna (ang. precursor mirna). Reakcja ta polega na usuniêciu sekwencji oskrzydlaj¹cych strukturê spinki do w³osów. U roœlin brak enzymu bêd¹cego homologiem zwierzêcego bia³ka Drosha; DCL1 zarówno skraca pri-mirna, jak i bierze udzia³ w dalszych etapach dojrzewania prekursora mirna. Zatem wycinanie dupleksu mirna/mirna* ze struktury spinki do w³osów zachodzi u roœlin w j¹drze i jest katalizowane przez enzym DCL1. U zwierz¹t natomiast prekursor o strukturze spinki do w³osów jest przenoszony do cytoplazmy, gdzie enzym o nazwie Dicer wycina dupleks mirna/mirna*. Porównanie in silico struktur drugorzêdowych typu spinka do w³osów prekursorów mikro RNA wykaza³o, e struktury te s¹ z zasady d³u sze i bardziej z³o one u roœlin ni u zwierz¹t. W dojrzewaniu prekursorów mikro RNA bia³ku DCL1 u roœlin towarzysz¹ bia³ka, takie jak: SE (SERRATE), HYL1 (HYPONASTIC LEAVES 1), CBP20 (CAP BINDING PROTEIN 20), CBP80 (CAP BINDING PROTEIN 80), DDL (DAWDLE), i HEN1 (HUA ENHANCER1) [25, 35], natomiast w biogenezie zwierzêcych mikro RNA udzia³ bierze kompleks bia³kowy o nazwie Mikroprocesor, zawieraj¹cy zasadniczo enzym Drosha i bia³ko DGCR8 (jego odpowiednik u Drosophila nazywa siê Pasha), o masie cz¹steczkowej oko³o 600 kda [14, 32]. Dupleks mirna/mirna* jest eksportowany u roœlin z j¹dra do cytoplazmy przez bia³ko HASTY, a u zwierz¹t Eksportyna 5 przenosi prekursor w formie spinki do w³osów do cytoplazmy, gdzie staje siê ona substratem dla enzymu Dicer. Ostatecznie zarówno zwierzêce, jak i roœlinne mikro RNA zostaj¹ wcielone w kompleks bia³kowy RISC i doprowadzaj¹ go do docelowych mrna. U roœlin g³ównym sposobem dzia³ania mikro RNA jest rozciêcie docelowego mrna, natomiast u zwierz¹t dochodzi g³ównie do hamowania translacji. Porównanie stopnia komplementarnoœci pomiêdzy mikro RNA a docelowym mrna u roœlin i zwierz¹t wykaza³o, e u tych pierwszych wymagany jest znaczenie wy szy stopieñ komplementarnoœci zasad ni w przypadku zwierz¹t [13, 14, 25]. Etapy biogenezy mikro RNA same w sobie oraz ich lokalizacja s¹ znacznie lepiej poznane w przypadku zwierz¹t ni w przypadku roœlin i mo na oczekiwaæ, e pewne detale tego procesu oraz miejsce okreœlonych zdarzeñ w komórkach roœlin mog¹ zostaæ uszczegó³owione lub zmienione. Wiêkszoœæ genów MIR ssaków (80%) zosta³o zidentyfikowanych w obrêbie intronów genów koduj¹cych bia³ka lub transkrypty mrna-podobne, syntetyzowanych przez polimerazê RNA II. Geny MIR znajduj¹ce siê pomiêdzy innymi genami s¹ czêsto zorganizowane w zespo³y genów, sk³adaj¹ce siê z pokrewnych lub ró nych

46 Z. SZWEYKOWSKA-KULIÑSKA, B. SZARZYÑSKA,. SOBKOWIAK, A. JARMO OWSKI genów MIR i ulegaj¹ kotranskrypcji tworz¹c policistronowy RNA [8, 13]. Co ciekawe, zespo³y genów tworz¹ coœ na kszta³t operonu, gdy mog¹ wszystkie ulegaæ ekspresji niemal wy³¹cznie w danym organie. Najwiêkszy zespó³ genów MIR u cz³owieka zmapowano na chromosomie 19, rozci¹ga siê on na odcinku oko³o 100 kpz i obejmuje 46 genów, ulegaj¹cych ekspresji w ³o ysku [6]. Natomiast roœlinne geny MIR rzadko zorganizowane s¹ tandemowo. Ró nice w organizacji tych genów u roœlin i zwierz¹t mog¹ równie odzwierciedlaæ sposoby regulacji ich ekspresji u przedstawicieli obu królestw. Poni ej przedstawiamy najnowsze informacje dotycz¹ce budowy genów MIR u roœlin, a tak e dyskutujemy potencjalne mo liwoœci regulacji ich ekspresji, zwi¹zane z budow¹ prekursorów. MIKRO RNA KODOWANE PRZEZ NIEZALE NE JEDNOSTKI TRANSKRYPCYJNE U A. thaliana znanych jest obecnie 190 genów MIR, które mo na pogrupowaæ w 106 rodzin. Do jednej rodziny nale ¹ takie geny MIR, z których w szlaku biogenezy mikro RNA powstaj¹ cz¹steczki o identycznej b¹dÿ prawie identycznej sekwencji nukleotydowej. W bazie mirbase dostêpne s¹ sekwencje wszystkich dot¹d poznanych cz¹steczek pre-mirna A. thaliana, sk¹pa jest natomiast wiedza na temat sekwencji pri-mirna i budowy samych genów MIR. Do niedawna poznanych ich by³o jedynie piêæ [2, 4, 15, 20, 26, 31]. Eksperymenty 5' RACE oraz 3' RACE pozwoli³y naszemu zespo³owi uzyskaæ informacje na temat sekwencji nukleotydowych cz¹steczek pri-mirna powstaj¹cych w wyniku transkrypcji dwudziestu szeœciu genów MIR u A. thaliana. Przyrównanie sekwencji nukleotydowych cz¹steczek pri-mirna do sekwencji genomowej A. thaliana umo liwi³o nam z kolei dok³adn¹ charakterystykê budowy genów MIR. Nasze wyniki wskazuj¹, e geny koduj¹ce mikro RNA u A. thaliana s¹ czêsto bardzo d³ugie i mog¹ zawieraæ w swej sekwencji od jednego do trzech intronów. Tylko jedenaœcie z dotychczas opisanych genów MIR nie zawiera intronów. Spoœród trzydziestu jeden scharakteryzowanych genów MIR dwadzieœcia, co stanowi 64,5% poznanych genów, zawiera sekwencje intronowe. Jedenaœcie genów zawiera pojedyncze introny, cztery maj¹ po dwa introny, natomiast w piêciu genach MIR wystêpuj¹ trzy introny. Jak dot¹d wszytkie poznane introny w roœlinnych genach MIR nale ¹ do grupy U2 (tab. 1) [2, 4, 15, 20, 26, 29, 31]. Sekwencje intronowe mog¹ stanowiæ od 11% (MIR171b) do 77,8% (MIR156a) d³ugoœci ca³ego genu MIR. Najkrótszy gen MIR u A. thaliana, MIR160b, ma d³ugoœæ 378 pz i nie zawiera intronów. Najd³u szy gen koduj¹cy mirna u A. thaliana, MIR156a, ma d³ugoœæ 3108 pz i zawiera w swej sekwencji 3 introny (najd³u szy 1985 pz). Co ciekawe, w obrêbie jednej rodziny mirna mog¹ wystêpowaæ znaczne ró nice d³ugoœci genów MIR. Przyk³adowo gen koduj¹cy mirna160a ma d³ugoœæ 2034 pz i zawiera d³ugi intron (1151 pz), natomiast gen koduj¹cy mirna160b ma d³ugoœæ 378 pz i nie zawiera intronów (ryc. 1A). Niektóre

ROŒLINNE GENY MIKRO RNA 47 TABELA 1. Charakterystyka 20 wybranych genów MIR Arabidopsis thaliana. ^ W tym przypadku zarówno cz¹steczka mikro RNA, jak i mikro RNA* stanowi¹ cz¹steczki funkcjonalne TABLE 1. Characterization of 20 selected Arabidopsis thaliana MIR genes. ^ In this case also micro RNA* molecule acts like micro RNA Lp. Gen MIR Chromosom D³ugoœæ genu (pz) Numer egzonu, Liczba i d³ugoœæ intronów (pz) Udzia³ d³ugoœci intronów Ramiê spinki, w którym w którym wystêpuje mirna/mirna* w ca³ym genie (%) 1. 156a II 3108 2 3 (341, 1985, 92) 77, 8 5' 2. 156c IV 2580 1 3 (980, 490, 164) 37, 4 5' 3. 157c III 997 1 1 (231) 23, 2 5' 4. 158a III 535 1 1 (117) 21, 9 3' 5. 159a I 808 1 0 3' 6. 160a II 2034 1 1 (1151) 56, 6 5' 7. 160b IV 378 1 0 5' 8. 161 I 699 1 1 (128) 18, 3 5' 9. 164c V 832 1 0 5' 10. 166a II 1113 1 1 (473) 42, 5 3' 11. 166b III 1121 1 2 (95, 86) 16, 1 3' 12. 167a III 602 1 0 5' 13. 169f III 735 1 0 5' 14. 171b I 775 1 1 (86) 11, 1 3' 15. 171c I 861 1 1 (207) 24, 0 3' 16. 172a II 2097 1 2 (148, 694) 40, 2 3' wystêpuje mikro RNA 17. 172b V 1417 3 3 (117, 199, 280) 42, 0 5' mirna*, 3' mirna^ 18. 172e V 817 1 0 3' 19. 319b V 873 1 0 3' 20. 393a II 546 1 0 5' transkrypty genów MIR zawieraj¹cych introny podlegaj¹ procesowi alternatywnego splicingu. Gen MIR166b ma d³ugoœæ 1188 pz i zawiera 3 egzony. W puli cz¹steczek pri-mirna166b wystêpuj¹ cz¹steczki zawieraj¹ce tylko trzy egzony oraz cz¹steczki bêd¹ce wynikiem alternatywnych zdarzeñ splicingowych. Zidentyfikowaliœmy cz¹steczki, w których dosz³o do zatrzymania sekwencji pierwszego intronu, jak równie cz¹steczki powsta³e w wyniku dwóch jednoczesnych alternatywnych zdarzeñ splicingowych polegaj¹cych na: zatrzymaniu sekwencji pierwszego intronu i wyboru jednego z dwóch miejsc splicingowych 5' w obrêbie drugiego egzonu (ryc. 1B). Kolejnym przyk³adem genu MIR zawieraj¹cego introny, którego transkrypt podlega alternatywnemu splicingowi jest gen MIR156c. Gen ten ma d³ugoœæ 2580 pz i zawiera 4 egzony oraz 3 introny o d³ugoœciach: 980 pz, 490 pz oraz 164 pz. W puli zidentyfikowanych pri-mirna156c wystêpuj¹ cz¹steczki zawieraj¹ce wszystkie 4 egzony oraz cz¹steczki powsta³e w wyniku alternatywnego zdarzenia splicingowego polegaj¹cego na pominiêciu w cz¹steczce pri-mirna egzonu trzeciego (ryc. 1B).

48 Z. SZWEYKOWSKA-KULIÑSKA, B. SZARZYÑSKA,. SOBKOWIAK, A. JARMO OWSKI RYCINA 1. Budowa wybranych genów i prekursorów mikro RNA: (A) Ró nice w d³ugoœci i budowie genów MIR A. thaliana nale ¹cych do jednej rodziny. (B) Struktura genów MIR166b, MIR156c, MIR172b oraz struktura transkryptów podlegaj¹cych alternatywnym zdarzeniom splicingowym. (C) Alternatywne miejsca poliadenylacji w transkryptach primirna159a oraz pri-mirna161. Zaznaczono pozycjê cz¹steczek mikro RNA oraz mikro RNA* FIGURE 1. Structures of selected MIR genes and primirnas. (A) Differences in length and structure of A. thaliana MIR genes within the same family. (B) MIR166b, MIR156c, MIR172b gene structures and alternatively spliced primirnas. (C) Alternative polyadenylation sites within primirna159a and pri-mirna161. Micro RNA and micro RNA* positions are depicted

ROŒLINNE GENY MIKRO RNA 49 MIR172b ma d³ugoœæ 1417 pz i zawiera trzy introny o d³ugoœciach: 117 pz, 199 pz 280 pz. W puli cz¹steczek pri-mirna172b zaobserwowano cz¹steczki, z których w drodze splicingu wyciête zosta³y wszytkie 3 introny oraz wariant splicingowy powsta³y w wyniku rozpoznania alternatywnego miejsca splicingowego 3' w obrêbie trzeciego egzonu (ryc. 1B) [29]. Dodatkowe zró nicowanie prekursorów mikro RNA wprowadza obecnoœæ (w przypadku ka dego z badanych genów) kilku alternatywnych miejsc poliadenylacji. Miejsca poliadenylacji w prekursorach mikro RNA zaobserwowaliœmy nie tylko w egzonach, ale równie w obrêbie sekwencji intronowych. Przyk³adowo w puli cz¹steczek pri-mirna159a zaobserwowano 5 alternatywnych miejsc poliadenylacji. Z kolei w puli cz¹steczek pri-mirna161 zaobserwowano 7 alternatywnych miejsc poliadenylacji, z czego piêæ zlokalizowanych jest w obrêbie intronu (ryc. 1C). Wystêpowanie alternatywnych miejsc poliadenylacji w obrêbie intronów wskazuje na to, i proces poliadenylacji w cz¹steczkach roœlinnych pri-mirna mo e zachodziæ przed splicingiem. Do tej pory nie uda³o siê scharakteryzowaæ adnych szczególnych sygna³ów poliadenylacji w obrêbie pri-mirna [29]. Heterogennoœæ cz¹steczek pri-mirna u A. thaliana jest te spowodowana wystêpowaniem alternatywnych miejsc startu transkrypcji w genach MIR. Spoœród 31 genów MIR, scharakteryzowanych do tej pory, siedem ma alternatywne miejsca startu transkrypcji (MIR156a, MIR158a, MIR160a, MIR166b, MIR169f, MIR171a, MIR393a). Przyk³adowo gen MIR160a ma dwa miejsca startu transkrypcji, które s¹ oddalone od siebie o 49 pz, natomiast w genie MIR166b alternatywne miejsca startu transkrypcji s¹ oddalone od siebie o 67 pz [26, 29]. CZ STECZKI MIKRO RNA ZLOKALIZOWANE W INNYCH GENACH U Arabidopsis jak dot¹d zidentyfikowano jedynie 11 mikro RNA kodowanych przez sekwencje zlokalizowane w obrêbie innych genów [7, 23]. Spoœród nich sekwencje piêciu mikro RNA (mir162, mir842, mir844, mir850 i mir852) wystêpuj¹ w intronach genów o nieznanej funkcji, natomiast w kolejnych piêciu przypadkach (mir402, mir837, mir838, mir853 i mir862) sekwencje mikro RNA nak³adaj¹ siê z sekwencjami intronów genów koduj¹cych bia³ka. Jeden gen zawiera sekwencjê koduj¹c¹ mikro RNA, mir840, w obrêbie rejonu 3' UTR genu koduj¹cego bia³ko. Poznane dot¹d geny Arabidopsis zawieraj¹ce w obrêbie intronów sekwencje koduj¹ce mikro RNA wykazuj¹ du e zró nicowanie pod wzglêdem d³ugoœci i organizacji egzonowo-intronowej [7, 23]. Wœród opisywanych 10 przypadków, znajduj¹ siê zarówno geny zawieraj¹ce po jednym intronie (At2g23348, At5g13890), jak i geny wielointronowe (At1g01040 i At2g25170 maj¹ce odpowiednio 20 i 30 intronów). D³ugoœæ intronów koduj¹cych mikro RNA obejmuje szeroki zakres od kilkuset do ponad dwóch tysiêcy par zasad (256 pz w przypadku At5g08185 i 2620 pz w przypadku At4g13495). Trudno wyznaczyæ regu³ê tak e pod wzglêdem lokalizacji intronów koduj¹cych mikro RNA w odniesieniu do ca³ego genu:

50Z. SZWEYKOWSKA-KULIÑSKA, B. SZARZYÑSKA,. SOBKOWIAK, A. JARMO OWSKI sekwencje koduj¹ce mikro RNA s¹ zlokalizowane zarówno w intronach znajduj¹cych siê w rejonach UTR (w intronie zidentyfikowanym w obrêbie 5' UTR w przypadku At2g23348 czy w obrêbie intronu 3' UTR w przypadku At5g13890), jak i w obrêbie intronów sekwencji koduj¹cych (At1g01040, At1g18880, At1g77230, At2g25170, At3g23325). Oprócz wymienionych 10 przypadków mikro RNA zakodowanych w obrêbie intronów innych genów, dotychczas zidentyfikowano jeden prekursor mikro RNA A. thaliana, pre-mir840, kodowany przez sekwencjê w ca³oœci zlokalizowan¹ w obrêbie 3' UTR genu At2g02750 [23, 19]. Gen At2g02750 koduje bia³ko o nieznanej funkcji nale ¹ce do rodziny PPR (ang. PentatricoPeptide Repeatcontaining) [30]. Przypuszczalny cel dzia³ania mir840 stanowi transkrypt genu WHY3 (WHIRLY3, At2g02740), koduj¹cy homolog plastydowego bia³ka p24 ziemniaka. Bia³ko p24 ma zdolnoœæ wi¹zania DNA i stanowi transkrypcyjny regulator ekspresji genów zwi¹zanych z odpowiedzi¹ roœliny na atak patogenów. Na uwagê zas³uguje fakt, i gen obejmuj¹cy sekwencjê koduj¹c¹ mir840 czêœciowo nak³ada siê z sekwencj¹ genu WHY3, jednak e ich transkrypcja zachodzi w przeciwnych kierunkach. Mikro RNA 840 jest komplementarny do 3' UTR transkryptu WHY3 i zgodnie z przewidywaniami bioinformatycznymi mo e wyznaczaæ miejsce jego rozciêcia. Na rycinie 2 przedstawiono budowê genów, w intronach których zakodowane s¹ cz¹steczki mikro RNA. GENY MIR NAK ADAJ CE SIÊ Z INNYMI GENAMI Poza opisanymi wy ej przypadkami genów w genach, u Arabidopsis znane s¹ loci MIR, które jedynie czêœciowo pokrywaj¹ siê sekwencjami koduj¹cymi bia³ka. Poniewa granice znacznej grupy genów MIR Arabidopsis nie zosta³y dot¹d wyznaczone, trudno jest oceniæ powszechnoœæ wystêpowania tego zjawiska. Do znanych przyk³adów nale y mir777 kodowany przez sekwencjê zlokalizowan¹ w obrêbie 5' UTR genu At1g70650, przy czym sekwencja koduj¹ca pre-mirna wykracza poza granicê 5' tego genu [23, 19]. Inny ciekawy przyk³ad stanowi para: MIR841 (At4g13564) oraz gen HTA4 (At4g13570) ulegaj¹ce transkrypcji w przeciwnym kierunku. D³ugoœæ genu MIR841 i jego organizacja egzonowo-intronowa nie by³y dotychczas szczegó³owo badane, jednak e wed³ug danych NCBI MapViewer v8 sekwencja pre-mir841 jest komplementarna do rejonu 3' pre-mrna HTA4 koduj¹cego histon H2A. Gen HTA4 zawiera jeden intron; rejon pierwotnego transkryptu HTA4 komplementarny do pre-mir841 obejmuje po³¹czenie egzon-intron. Jak dot¹d nie zidentyfikowano eksperymentalnie celu dzia³ania mir841, jednak e analizy bioinformatyczne wykaza³y, i mo e on braæ udzia³ w rozcinaniu mrna HTA8 (At2g38810) koduj¹cego inny wariant histonu H2A [21, 23]. Brak jest informacji o znaczeniu komplementarnoœci pre-mrna HTA4 i prekursora mir841, przypuszczalnie jednak mo e ona wp³ywaæ zarówno na powstawanie dojrza³ego mrna HTA4, jak i biogenezê mir841 oraz modulowaæ regulacjê poziomu mrna HTA8 z udzia³em mir841.

ROŒLINNE GENY MIKRO RNA 51 RYCINA 2. Sekwencje koduj¹ce mirna zlokalizowane w obrêbie intronów innych genów Arabidopsis: (A D) Geny koduj¹ce bia³ka. (E H) Geny o nieznanej funkcji (na podstawie [7]). Strukturê genu o nieznanej funkcji At5g08185 zawieraj¹cego sekwencjê koduj¹c¹ mir162a oraz pierwotnego transkryptu genu At1g01040 (DCL1) zawieraj¹cego sekwencjê prekursora mir838 przedstawiono na ryc. 4. Przerywane linie reprezentuj¹ introny, natomiast sekwencje koduj¹ce prekursory mirna przedstawione s¹ lini¹ ci¹g³¹. Bia³e prostok¹ty odpowiadaj¹ egzonom, a ukoœne kreskowanie wyznacza rejony UTR. D³ugoœæ sekwencji koduj¹cej pre-mirna podana jest poni ej. Ca³kowita d³ugoœæ genu oraz jego funkcja podane s¹ w nawiasach po lewej stronie rysunku FIGURE 2. MicroRNA-coding sequences localized within introns of other Arabidopsis genes: (A D) Protein-coding genes. (E H) Genes of unknown function (based on [7]). Organization of a At5g08185 gene of unknown function, coding for mir162a precursor as well as the structure of At1g01040 (DCL1) gene primary transcript containing mir838 precursor sequence are presented in the Figure 4

52 Z. SZWEYKOWSKA-KULIÑSKA, B. SZARZYÑSKA,. SOBKOWIAK, A. JARMO OWSKI Na koniec tego rozdzia³u warto nadmieniæ o szczególnej organizacji genów mikro RNA u mchu Physcomitrella patens, u którego a 118 z 205 dotychczas opisanych sekwencji koduj¹cych mikro RNA nak³ada siê z loci koduj¹cymi bia³ka. W dodatku a w 60% przypadków spoœród nich orientacja pre-mirna jest zgodna z kierunkiem transkrypcji genu koduj¹cego bia³ko [3]. POLICISTRONOWE GENY MIR U Arabidopsis geny MIR mog¹ce stanowiæ jednostki policistronowe nale ¹ do rzadkoœci. Locus MIR161 jest niezwyk³y z uwagi na fakt, e koduje dwie nachodz¹ce na siebie sekwencje cz¹steczek mikro RNA (mir161.1 i mir161.2), znajduj¹ce siê nastêpnie w obrêbie jednego prekursora [1]. Poza tym w genomie j¹drowym A. thaliana zidentyfikowano obecnoœæ trzech loci odpowiadaj¹cych mir399f, mir399d i mir399e, zawartych w odcinku o d³ugoœci 2 kpz; mir399e i mir399f s¹ kodowane na tej samej nici DNA, natomiast mir399d na przeciwnej. Nie mo na wykluczyæ, e mir399e i mir399f ulegaj¹ razem transkrypcji [27]. Równie w przypadku rodziny mikro RNA 395 stwierdzono obecnoœæ dwóch zespo³ów, ka dy zawieraj¹cy trzy struktury spinki do w³osów na odcinku 4 kpz. W ka dym z zespo³ów dwie struktury spinki znajduj¹ siê na jednej nici DNA, a trzecia na przeciwnej. Istnieje zatem du e prawdopodobieñstwo, e przynajmniej dwa mikro RNA z rodziny 395 z ka dego zespo³u powstaj¹ jako efekt dojrzewania jednego prekursora. U ry u stwierdzono obecnoœæ EST zawieraj¹cego szereg mikro RNA z rodziny 395, co potwierdza mo liwoœæ powstawania takiego prekursora u rzodkiewnika [12]. W przypadku innych roœlin dysponujemy równie kilkoma zaledwie przyk³adami dotycz¹cymi udowodnionej b¹dÿ potencjalnej mo liwoœci policistronowej organizacji genów MIR. W przypadku kukurydzy zidentyfikowano transkrypt d³ugoœci 749 nt, nios¹cy dwie cz¹steczki mikro RNA: mir156b i mir156c [9]. POTENCJALNE MO LIWOŒCI REGULACJI EKSPRESJI MIKRO RNA NA POZIOMIE POTRANSKRYPCYJNYM Zwa ywszy na fakt, i powsta³e w wyniku transkrypcji genów MIR cz¹steczki pri-mirna koduj¹ jedynie 18 24 nt regulatorowe RNA, skomplikowany proces ich dojrzewania wydaje siê bardzo intryguj¹cy. Niewykluczone, i obecnoœæ intronów, splicing, splicing alternatywny oraz heterogennoœæ d³ugoœci prekursorów mikro RNA, spowodowana obecnoœci¹ alternatywnych miejsc poliadenylacji i alternatywnych miejsc startu transkrypcji, wp³ywaj¹ na obraz mikrotranskryptomu komórek roœlinnych, a tym samym reguluj¹ poziom wielu bia³ek (g³ównie czynników transkrypcyjnych). Heterogennoœæ d³ugoœci cz¹steczek pri-mirna u A. thaliana dotyczy w

ROŒLINNE GENY MIKRO RNA 53 g³ównej mierze koñców 3'. Wiêkszoœæ zdarzeñ splicingowych w cz¹steczkach prekursorów mikro RNA ma miejsce poni ej sekwencji nukleotydowej, która tworzy drugorzêdow¹ strukturê typu spinki do w³osów [29]. Modelowanie struktur drugorzêdowych RNA wykaza³o, i pomimo skomplikowanych mechanizmów dojrzewania prekursorów mikro RNA struktury typu spinka do w³osów, w których zlokalizowane s¹ dojrza³e cz¹steczki mikro RNA, s¹ stabilne i nie dochodzi w ich obrêbie do drastycznych zmian struktury drugorzêdowej RNA [29]. Zmiany struktury drugorzêdowej w cz¹steczkach pri-mirna obserwowane s¹ natomiast poni ej struktur typu spinka do w³osów, z których wycinane s¹ dojrza³e cz¹steczki mikro RNA (dane niepublikowane). Niewykluczone, i zmiany w d³ugoœci oraz strukturze drugorzêdowej prekursorów mikro RNA wp³ywaj¹ na stabilnoœæ cz¹steczek pri-mirna. Nie mo na te wykluczyæ, i z³o ony proces dojrzewania cz¹steczek pri-mirna jest zwi¹zany z mo liwoœci¹ wystêpowania w obrêbie transkryptów genów MIR otwartych ramek odczytu dla bia³ek. Przemawia za tym obecnoœæ otwartych ramek odczytu w alternatywnych wariantach splicingowych cz¹steczek pri-mirna156c oraz primirna166b [29]. Z wyj¹tkiem genu MIR841, opisanego w rozdziale o genach MIR nak³adaj¹cych siê z innymi genami, w pozosta³ych opisanych przypadkach orientacja sekwencji koduj¹cych mikro RNA jest zgodna z kierunkiem transkrypcji genów, w obrêbie których siê znajduj¹, st¹d potencjalnie mog¹ ulegaæ koekspresji. Zaobserwowano, i u cz³owieka intronowe mikro RNA i geny, w obrêbie których s¹ one zlokalizowane, zazwyczaj charakteryzuj¹ siê takim samym profilem ekspresji, co pozwala s¹dziæ, i ich transkrypcja zachodzi pod kontrol¹ wspólnego promotora [5]. Jak dot¹d niewiele wiadomo na temat podobnej korelacji pomiêdzy syntez¹ i dojrzewaniem prekursora mikro RNA a transkrypcj¹ genu-gospodarza i wzajemnego wp³ywu kompleksów bior¹cych udzia³ w dojrzewaniu mikro RNA i wycinaniu intronów mrna. Mo liwe s¹ nastêpuj¹ce scenariusze zdarzeñ (ryc. 3): (A) Katalizowane przez DCL1 przycinanie pre-mirna do dupleksu mirna/mirna* mo e prowadziæ do dezintegracji pre-mrna i uniemo liwiaæ prawid³owy przebieg splicingu, (B) dzia³anie DCL1 zachodzi równolegle z wycinaniem intronu, ale ju po rozpoznaniu miejsc splicingowych 5' i 3 ' przez spliceosom, b¹dÿ te (C) DCL1 rozcina prekursor mikro RNA po uwolnieniu i linearyzacji intronu. Przycinanie prekursora mikro RNA z udzia³em DCL1 podczas lub po splicingu nie wp³ywa³oby na powstanie dojrza³ego mrna [7]. Interesuj¹cym obiektem badañ mo e okazaæ siê wspomniany mir853 A. thaliana, kodowany przez sekwencjê zlokalizowan¹ w obrêbie intronu genu At3g23325 [7, 19]. Gen ten koduje podjednostkê czynnika splicingowego SF3b, jednak e wp³yw biogenezy mikro RNA na powstawanie dojrza³ego mrna SF3b, poziom syntezy tego bia³ka, a w konsekwencji splicing w ogóle nie zosta³ dot¹d poznany. Dotychczas scharakteryzowano nieco bli ej proces dojrzewania jedynie dwóch intronowych mikro RNA Arabidopsis. Obie cz¹steczki mikro RNA: mir162 oraz mir838, reguluj¹ poziom transkryptu DCL1 tworz¹c negatywne sprzê enie zwrotne (ryc. 4C) Sekwencja koduj¹ca mir162a jest zlokalizowana w obrêbie intronu genu At5g08185 (ryc.

54 Z. SZWEYKOWSKA-KULIÑSKA, B. SZARZYÑSKA,. SOBKOWIAK, A. JARMO OWSKI RYCINA 3. Modele przedstawiaj¹ce mo liwy przebieg dojrzewania mirna zlokalizowanych w intronach pre-mrna (na podstawie [7]): (A) Dojrzewanie mirna oraz splicing pre-mrna wykluczaj¹ siê wzajemnie. (B) Przycinanie prekursora mirna przez DCL1 oraz splicing pre-mrna zachodz¹ równoczeœnie prowadz¹c do powstania funkcjonalnych cz¹steczek. (C) Przycinanie prekursora mirna przez DCL1 nastêpuje po wyciêciu intronu z pre-mrna. Przerywane linie reprezentuj¹ introny, natomiast ich fragmenty zawieraj¹ce prekursor mirna i tworz¹ce strukturê spinki przestawione s¹ za pomoc¹ linii ci¹g³ej. Bia³e prostok¹ty odpowiadaj¹ egzonom FIGURE 3. Models presenting maturation of mirna precursors originating from pre-mrna introns (based on [7]): (A) Cleavage of the pre-mirna catalyzed by DCL1 and pre-mrna splicing may be mutually exclusive. (B) Cleavage of the pre-mirna may occur after splicing complex assembly resulting in both mirna and mrna production. (C) DCL1-dependent cleavage of pre-mirna may occur after pre-mrna splicing 4A) [7]. Pierwotny transkrypt tego genu ulega alternatywnemu splicingowi, w wyniku którego powstaje piêæ izoform (FS1-FS5). Oprócz transkryptu z zachowanym intronem tylko dwie zidentyfikowane formy mog¹ potencjalnie ulegaæ dojrzewaniu do mir162a. Jedn¹ z mo liwoœci stanowi katalizowane przez DCL1 wyciêcie premirna z uwolnionej sekwencji intronu (FS1). W drugim przypadku (FS2) nastêpuje rozpoznanie konstytutywnego miejsca splicingowego 5' oraz alternatywnego miejsca splicingowego 3' (zlokalizowanego u podstawy struktury spinki tworzonej przez premirna) i wyciêcie intronu, a powsta³y transkrypt mo e stanowiæ substrat dla DCL1. Funkcja pozosta³ych trzech form splicingowych transkryptu At5g08185 nie jest znana. Po³o enie scharakteryzowanych alternatywnych miejsc splicingowych w stosunku do sekwencji pre-mir162a pozwala jednak przypuszczaæ, e spliceosom oraz maszyneria biogenezy mikro RNA wspó³zawodnicz¹ o miejsce wi¹zania z transkryptem. Wyciêcie fragmentu intronu wyznaczonego poprzez alternatywne miejsce splicingowe 5' zlokalizowane w obrêbie pêtli struktury spinki tworzonej przez pre-mir162 oraz kryptyczne (ukryte) miejsce splicingowe 3' (3 nt poni ej konstytutywnego miejsca splicingowego 3') rozcina prekursor mikro RNA (FS3, FS4) i uniemo liwia jego dojrzewanie. Natomiast rozpoznanie miejsca splicingowego 3' u

ROŒLINNE GENY MIKRO RNA 55 ich RYCINA 4 (A) Organizacja genu MIR162a (At5g08185) A. thaliana i alternatywne formy splicingowe (FS) jego transkryptu (FS1-FS5) (na podstawie [7]). Funkcja izoform FS3-FS5 nie jest znana. Transkrypt nieulegaj¹cy splicingowi, uwolniony wyciêty intron oraz forma FS2 zawieraj¹ sekwencjê pre-mir162a i potencjalnie mog¹ byæ rozpoznawane przez DCL1 (B) Budowa pe³nej d³ugoœci premrna genu DCL1 (B1) i funkcjonalny mrna DCL1 po splicingu (B2). Dojrza³a cz¹steczka mir838 powstaje ze struktury spinki tworzonej przez czêœæ sekwencji intronu czternastego pre-mrna DCL1 [23]. Przycinanie prekursora mir838 katalizowane przez DCL1 prowadzi do powstania skróconego transkryptu DCL1 koduj¹cego niefunkcjonalne bia³ko (B3). (C) Autoregulacja szlaku biogenezy mirna z udzia³em mir162 i mir838 (na podstawie [23]). Zarówno kierowane przez mir162 rozcinanie mrna DCL1, jak i wycinanie prekursora mir838 z intronu pre-mrna DCL1 prowadzi do obni enia poziomu dojrza³ego transkryptu koduj¹cego endonukleazê DCL1 i obni enia poziomu dojrza³ych mirna, w tym tak e mir162 i mir838. Z kolei mniejsza produkcja wspomnianych mirna prowadzi do akumulacji dojrza³ych transkryptów DCL1 i wiêkszej iloœci syntetyzowanego enzymu. NLS-sygna³ lokalizacji j¹drowej, DUF sekwencja koduj¹ca domenê o nieznanej funkcji, PAZ sekwencja koduj¹ca domenê PIWI/Argonaute/Zwille, dsrbd sekwencja koduj¹ca domenê wi¹ ¹c¹ dwuniciowy RNA. Introny zaznaczono lini¹ przerywan¹. Wyj¹tek stanowi¹ sekwencje koduj¹ce prekursory mirna i transkrypty tych rejonów oznaczone lini¹ ci¹g³¹. Bia³e prostok¹ty reprezentuj¹ egzony, a ich rejony koduj¹ce konserwatywne domeny bia³ka zaznaczono kolorem czarnym. Ukoœne kreskowanie wyznacza rejony UTR FIGURE 4. (A) A.thaliana MIR162a (At5g08185) gene organization and alternative splicing isoforms (FS1-FS5) of its primary transcript (based on [7]). Functions of FS3-FS5 isoforms remain unknown. Intron-containing transcript, intron sequence released after splicing and FS2 splicing variant contain pre-mir162a sequence and may be possibly recognized by DCL1 (based on [11]). (B) Full-length DCL1 gene primary transcript (B1) and functional DCL1 mrna after splicing (B2). Mature mir838 molecule arises from a hairpin structure formed by a part of DCL1 pre-mrna fourteenth intron sequence [23]. Pre-miR838 cleavage catalyzed by DCL1 leads to formation of truncated DCL1 mrna coding for unfunctional protein (B3). (C) MicroRNA-mediated DCL1 autoregulatory feedback loop [23]. Both mir162a-guided DCL1 mrna cleavage oand cleavage of pre-mir838 located within DCL1 pre-mrna lead to decrease in DCL1 mrna level and, as a consequence, lower mirna production including mir162a and mir838. This in turn results in DCL1 mrna accumulation and promotes DCL1 protein synthesis

56 Z. SZWEYKOWSKA-KULIÑSKA, B. SZARZYÑSKA,. SOBKOWIAK, A. JARMO OWSKI podstawy struktury spinki po stronie 5' (FS2) pozwala s¹dziæ, i w tym przypadku organizacja aparatu dojrzewania mikro RNA i/lub formowanie struktury drugorzêdowej pre-mirna zlokalizowanego w obrêbie intronu poprzedza tworzenie kompleksu spliceosomu i mo e wp³ywaæ na wybór miejsc splicingowych. W przypadku mir838 sekwencja koduj¹ca prekursor mikro RNA jest zlokalizowana w obrêbie czternastego intronu genu koduj¹cego endorybonukleazê DCL1 (ryc. 4B) [23]. Analizy transkryptu DCL1 przeprowadzone technik¹ RACE oprócz funkcjonalnego mrna DCL1 (B2) pozwoli³y zidentyfikowaæ dwie dodatkowe grupy produktów: fragment maj¹cy na koñcu 5' strukturê kap, o koñcu 3' wyznaczonym przez 5' miejsce splicingowe intronu czternastego oraz niejednorodn¹ pulê poliadenylowanych fragmentów, spoœród których najd³u szy mia³ koniec 5' zlokalizowany w obrêbie intronu czternastego (B3) [23, 33]. Wyniki te pozwalaj¹ s¹dziæ, i kompleksy bior¹ce udzia³ w splicingu mrna i dojrzewaniu mikro RNA wspó³zawodnicz¹ miêdzy sob¹ prowadz¹c do powstania b¹dÿ dojrza³ego mrna DCL1 pe³nej d³ugoœci, b¹dÿ dojrza³ych mikro RNA i niefunkcjonalnego transkryptu DCL1. W ten sposób mir838 bierze udzia³ w autoregulacji poziomu kluczowego enzymu biogenezy mikro RNA, DCL1. Powy sze przyk³ady pokazuj¹, i splicing oraz dojrzewanie mikro RNA mog¹ wykluczaæ siê wzajemnie. Z drugiej jednak strony wykazano, i u ry u splicing jest warunkiem koniecznym do powstawania niektórych spoœród mikro RNA, gdy wyciêcie intronu z transkryptu o nieznanej funkcji umo - liwia uformowanie struktury prekursora mikro RNA [27]. PODSUMOWANIE Przedstawione w tej pracy bardzo ró norodne sposoby organizacji genów mikro RNA u roœlin z pewnoœci¹ maj¹ decyduj¹cy wp³yw na ekspresjê poszczególnych mikro RNA. Pozostawiaj¹c z boku regulacjê ekspresji mikro RNA ma poziomie inicjacji transkrypcji nale y stwierdziæ, e z³o onoœæ powstaj¹cych prekursorów mikro RNA mo e byæ istotnym elementem regulacji poziomu dojrza³ych cz¹steczek mikro RNA w komórce roœlinnej. LITERATURA [1] ALLEN E, XIE Z, GUSTAFSON AM, SUNG G-H, SPATAFORA JW, CARRINGTON JC. Evolution of microrna genes by inverted duplication of target gene sequences in Arabidopsis thaliana. Nat Genet 2004; 36: 1282 1290. [2] AUKERMAN MJ, SAKAI H. Regulation of flowering time and floral organ identity by a microrna and its APETALA2-like target genes. Plant Cell 2003; 11: 2730 2741. [3] AXTELL MJ, SNYDER JA, BARTEL DP. Common functions for diverse small RNAs in land plants. Plant Cell 2007; 19: 1790 1789. [4] BAKER CC, SIEBER P, WELLMER F, MEYEROWITZ EM. The early extra petals1 mutant uncovers a role for microrna mir164c in regulating petal number in Arabidopsis. Curr Biol 2005; 15(4): 303 315.

ROŒLINNE GENY MIKRO RNA 57 [5] BASKERVILLE S, BARTEL DP. Microarray profiling of micrornas reveals frequent coexpression with neighboring mirnas and host genes. RNA 2005; 11: 241 247. [6] BENTWICH I, AVNIEL A, KAROV Y, AHARONOV R, GILAD S, BARAD O, BARZILAI A, EINAT P, EINAV U, MEIRI E. Identification of hundreds of conserved and nonconserved human micro RNAs. Nat Genet 2005; 37: 766 770. [7] BROWN JWS, MARSHALL DF, ECHEVERRIA M. Intrinsic noncoding RNAs and splicing. Trends Plant Sci 2008; 13: 335 342. [8] BORTOLIN-CAVAILLE M-L, DANCE M, WEBER M, CAVAILLE J. C19MC micrornas are processed from introns of large Pol-II, non-protein-coding transcripts. Nucl Acids Res 2009; doi:10.1093 [9] CHUCK G, CIGAN AM, SAETEURN K, HAKE S. The heterochronic maize mutant Corngrass1 results from overexpression of a tandem microrna. Nat Genet 2007; 39: 544 549. [10] GRIFFITHS-JONES S, SAINI HK, VAN DONGEN S, ENRIGHT AJ. mirbase: tools for microrna genomics. Nucleic Acids Res 2008; 36: D154 D158. [11] HIRSCH J, LEFORT V, VANKERSSCHAVER M, BOUALEM A, LUCAS A, THERMES C, D'AUBEN- TON-CARAFA Y, CRESPI M. Characterizations of a 43 non-protein-coding mrna genes in Arabidopsis, including the MIR162a-derived transcripts. Plant Physiol 2006; 140: 1192 1204. [12] JONES-RHOADES M, BARTEL DP. Computational identification of plant micrornas and their targets, including a stress-induced mirna. Mol Cell 2004; 14: 787 799. [13] KIM VN. MicroRNA biogenesis: coordinated cropping and dicing. Nat Rev Mol Cell Biol 2005; 6: 376 385. [14] KIM VN, HAN J, SIOMI MC. Biogenesis of small RNAs in animals. Nat Rev Mol Cell Biol 2009; 10: 126 139. [15] KURIHARA Y, WATANABE Y. Arabidopsis micro-rna biogenesis through Dicer-like 1 protein functions. Proc Natl Acad Sci USA 2004; 101(34): 12753 12758. [16] KUTTER C, SCHÖB H, STADLER M, MEINS F JR, SI-AMMOUR A. MicroRNA-mediated regulation of stomatal development in Arabidopsis. Plant Cell 2007; 8: 2417 2429. [17] LEE RC, FEINBAUM RL, AMBROS V. The C. elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14. Cell 1993; 75: 843 854. [18] MILLAR AA, WATERHOUSE PM. Plant and animal micrornas: similarities and differences. Funct Integr Genomics 2005; 5: 129 135. [19] NCBI MapViewer http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/mapview/ [20] NIKOVICS K, BLEIN T, PEAUCELLE A, ISHIDA T, MORIN H, AIDA M, LAUFS P. The balance between the MIR164A and CUC2 genes controls leaf margin serration in Arabidopsis. Plant Cell 2006; 18(11): 2929 2945. [21] NOBUTA K, VEMARAJU K, TEJ SS, SKOGEN JW, MEYERS BC. Arabidopsis MPSS Plus Plant MPSS databases: signature-based transcriptional resources for analyses of mrna and small RNA. Database http://mpss.udel.edu/at/. Nucleic Acids Res 2006; 34: D731 D735. [22] PARK W, LI JJ, SONG RT, MESSING J, CHEN XM. CARPEL FACTORY, a Dicer homolog, and HEN1, a novel protein, act in microrna metabolism in Arabidopsis thaliana. Curr Biol 2002; 12: 1484 1495. [23] RAJAGOPALAN R, VAUCHERET H, TREJO J, BARTEL DP. A diverse and evolutionarily fluid set of micrornas in Arabidopsis thaliana. Genes Dev 2006; 20: 3407 3425. [24] REINHART BJ, WEINSTEIN EG, RHOADES MW, BARTEL B, BARTEL DP. MicroRNAs in plants. Genes Dev 2002; 16: 1616 1626. [25] SOBKOWIAK, SZARZYÑSKA B, SZWEYKOWSKA-KULIÑSKA Z. Biogeneza roœlinnych mikro RNA Post Biochem 2008; 54: 308 316. [26] SONG L, HAN MH, LESICKA J, FEDOROFF N. Arabidopsis primary microrna processing proteins HYL1 and DCL1 define a nuclear body distinct from the Cajal body. Proc Natl Acad Sci USA 2007; 104(13): 5437 5442. [27] SUNKAR R, ZHU J-K. Novel and stress-regulated micrornas and other small RNAs from Arabidopsis. Plant Cell 2004; 16: 2001 2019. [28] SUNKAR R, KAPOOR A, ZHU J-K. Posttranscriptional induction of two Cu/Zn superoxide dismutase genes in Arabidopsis is mediated by downregulation of mir398 and important for oxidative stress tolerance. Plant Cell 2006; 18: 2051 2065. [29] SZARZYNSKA B, SOBKOWIAK L, PANT BD, BALAZADEH S, SCHEIBLE WR, MUELLER-RO- EBER B, JARMOLOWSKI A, SZWEYKOWSKA-KULINSKA Z. Gene structures and processing of Arabidopsis thaliana HYL1-dependent pri-mirnas. Nucleic Acids Res 2009; 37(9): 3083 3093.

58 Z. SZWEYKOWSKA-KULIÑSKA, B. SZARZYÑSKA,. SOBKOWIAK, A. JARMO OWSKI [30] The Arabidopsis Information Resource TAIR http://www.arabidopsis.org/ [31] WARTHMANN N, DAS S, LANZ C, WEIGEL D. Comparative analysis of the MIR319a microrna locus in Arabidopsis and related Brassicaceae. Mol Biol Evol 2008; 25(5): 892 902. [32] WINTER J, JUNG S, KELLER S, GREGORY RI, DIEDERICHS S. Many roads to maturity: microrna biogenesis pathways and their regulation. Nat Cell Biol 2009; 11: 228 234. [33] XIE Z, KASSCHAU KD, CARRINGTON JC. Negative feedback regulation of Dicer-Like1 in Arabidopsis by microrna-guided mrna degradation. Curr Biol 2003; 13: 784 789. [34] XIE Z, ALLEN E, FAHLGREN N, CALAMAR A, GIVAN SA, CARRINGTON JC. Expression of Arabidopsis MIRNA genes. Plant Physiol 2005; 138: 2145 2154. [35] YU B, CHEN X. The FHA domain proteins DAWDLE in Arabidopsis and SNIP1 in humans act in small RNA biogenesis. Proc Natl Acad Sci USA 2008; 105: 1073 1078. Zofia Szweykowska-Kuliñska Zak³ad Ekspresji Genów, Instytut Biologii Molekularnej i Biotechnologii Wydzia³ Biologii, Uniwersytet im. Adama Mickiewicza w Poznaniu ul. Umultowska 89, 61-614 Poznañ e-mail: zofszwey@amu.edu.pl