Badanie mechanizmów działania fotouczulaczy - pomiary tlenu singletowego i wolnych rodników Marta Kempa Badanie aktywności fotouczulaczy stosowanych w terapii PDT metodami fizykochemicznymi (prof. dr hab. A. Ratuszna)
1 Terapia fotodynamiczna - Fotouczulacz Terapia fotodynamiczna lek (fotouczulacz) + tlen + światło Mechanizm działania fotouczulaczy: 0 I typ fotoreakcji (przeniesienie elektronu lub wodoru) II typ fotoreakcji (transfer energii) F h F * 1 ISC F * 3 Type-I reaction 3 F * RH FH 3 F * RH F R RH FH F O O H O 3 1 O F0 HO 3 1 O F0 O O O H O Me O n n 1 Me Me O O H SOD O OH (Haber Weiss reaction) OH n 1 n OH OH (Fenton reaction) Me Oxidation of Substraces and Cellular Damage Type-II reaction 3 F 3 1 1 * O O F0 Rysunek 1. Fizyczne i chemiczne mechanizmy zachodzące podczas PDT.
Badane fotouczulacze - przykładowe struktury badanych związków Chl C 41 H 53 N 5 O 5 M=695,89m/mol Chl b C 53 H 79 N 7 O 13 M = 10,3 g/mol Chl d C 47 H 6 N 6 O 14 M=935,03 g/mol Rysunek. Przykładowe struktury fotouczulaczy z grupy chloryn.
Spektrofotometria Pomiary widm absorpcyjnych w różnych środowiskach: hydrofilowym, hydrofobowym oraz aprotycznym (położenie ostatniego pasma absorpcji, kontrola nad formą występowania badanych związków w różnych środowiskach) 0,9 5µM Chl Abs (a.u.) 0,6 0,3 chl PBS chl PBS + 0.% Triton X100 chl DMSO 0,0 300 400 500 600 700 wavelength (nm) Wykres 1. Widmo absorpcji chloryny.
Spektroskopia laserowa - detekcja fosforescencji fotogenerowanego tlenu singletowego 1 O Rejestracja emisji przy długości fali 170nm. W celu weryfikacji obserwowanego sygnału do badanych próbek dodawany jest azydek sodu (fizyczny wygaszacz tlenu singletowego) oraz wykorzystywane są dodatkowe filtry 1195nm i 1355nm. Związki wzbudzane są światłem laserowym o dł. 355nm. Pomiary wykonywane są dla związków rozpuszczonych w różnych środowiskach. Stężenie badanych związków 10μM. Filtry 170, 1195 i 1355nm Maksimum fosforescencji tlenu singletowego położone jest przy długości fali 170nm. Przy długościach fali 1195nm i 1355nm nie powinien być rejestrowany sygnał pochodzący od wzbudzonego tlenu. Jeżeli sygnał jest rejestrowany, może to oznaczać, że nie pochodzi on od 1 O.
Spektroskopia Laserowa A Signal intensity (au.) 1000 800 600 400 00 chl PBS (170nm) chl PBS (1195nm) chl PBS (1355nm) chl PBS + 5mM NAN3 (170nm) B Signal intensity (a.u.) 600 400 00 chl PBS + 0.% Triton X100 (170nm) chl PBS + 0.% Triton X100 (1195nm) chl PBS + 0.% Triton X100 (1355nm) chl PBS + 0.% Triton X100 + 5mM NaN3(170nm) 0 C Signal intensity (a.u.) 6000 4000 000 0 0 8000 16000 Time (ns) chl PBS DMSO (170nm) chl PBS DMSO (1195nm) chl PBS DMSO (1355nm) chl PBS DMSO + 5mM NaN3(170nm) 0 0000 40000 Time (ns) 0 0000 40000 Time (ns) Wykres. Pomiar emisji luminescencji przy różnych długościach fali w A - środowisku wodnym (PBS), B -hydrofobowym (Triton x 100) oraz C- aprotycznym.
Spektroskopia EPR, Fotokonsumpcja tlenu przy użyciu sondy spinowej mhctpo. Rejestracja sygnału sondy spinowej w czasie naświetlania badanej próbki. Naświetlanie z zakresu 54-74nm. Obserwowany zanik tlenu będzie sugerował możliwość produkcji rodników w badanym układzie. Pomiary wykonywane są dla związków rozpuszczonych w różnych środowiskach. Dodatkowo metodą tą można pośrednio sprawdzić, czy w układzie generowany jest 1 O (zamiana środowiska z H O na D O, dodanie Histydyny, NaN 3 ). Rysunek 3. Struktura chemiczna sondy spinowej mhctpo. Rysunek 4. Sygnał sondy spinowej mhctpo. A wysoka koncentracja tlenu; B - niska koncentracja tlenu. Wyznaczany parametr R jest proporcjonalny do koncentracji tlenu w badanym układzie.
Fotokonsumpcja tlenu A 0,30 chl PBS chl PBS+ 0.5mM NADH chl PBS+ 0.5mM NADH + 5mM NaN3 chl PBS+ 1mM His chl DO+ 1mM His B 0,30 chl PBS+ 0.5% triton X100 chl PBS+ 0.5% triton X100 + 0.5mM NADH chl PBS+ 0.5% triton X100 + 0.5mM NADH + 5mM NaN3 chl PBS+ 0.5% tritonx100+1mm His chl DO+ 0.5% tritonx100+1mm His Oxygen concentration (a.u.) 0,5 0,0 0,15 0,10 0,05 0,00 Oxygen concentration (a.u.) 0,5 0,0 0,15 0,10 0,05 0,00 0 1 3 4 5 6 7 Irradiation time (min) 0 1 3 4 5 6 7 Irradiation time (min) Wykres 3. Zmiany stężenia tlenu w trakcie naświetlania chl. Pomiary dla próbki w środowisku A - wodnym oraz B - hydrofobowym.
Spektroskopia EPR, Pułapkowanie spinowe w celu identyfikacji i porównania kinetyki fotogenerowanych rodników tlenowych w różnych układach modelowych. Badanie zmian amplitudy sygnału powstałych adduktów w trakcie naświetlania próbki. Naświetlanie w zakresie 54-74nm. Pomiary wykonywane dla związków rozpuszczonych w różnych środowiskach. R + ST ST- R Popularne pułapki: 1) -metylo--nitrozopropan, MNP ) α-fenylo-n-t-butylonitron, PBN 3) 5,5-dimetylo-1-pyrolino-N-tlenek, DMPO 4),,6,6-Tetrametyl-1-piperidinyloxy, TEMPO schemat reakcji pułapkowania spinowego Powstały addukt wykazuje charakterystyczne widmo EPR. Identyfikaca spułapkowanego rodnika oparta jest na stałych rozszczepienia nadsubtelnego występujące w widmach EPR próbki.
Pułapkowanie spinowe a N =14,3 G a H β=11,3 G a H I=1,4 G a N =14,9 G a H β=14,9 G Rysunek 5. A- Diagram pułapkowanego spinowo adduktu DMPO po interakcji z anionorodnikiem ponadtlenkowym oraz rodnikiem hydroksylowym, B- spektrum adduktu DMPO-OOH, C- spektrum adduktu DMPO-OH Hitoshi Togashi et al. Analysis of hepatic oxidative stress status by electron spin resonance spectroscopy and imaging, Free Radical Biology and Medicine, 000, 8 846-853
Signal intensity [a.u.] Signal intensity [a.u.] Pułapkowanie spinowe A,00E+05 1,50E+05 1,00E+05 5,00E+04 0,00E+00 + * + * * * + + + + B 1,50E+06 1,00E+06 5,00E+05 0,00E+00 * * * + + + + + + * -5,00E+04-5,00E+05-1,00E+05-1,50E+05 -,00E+05 3350 3360 3370 3380 3390 3400 3410 340 Magentic Field [G] -1,00E+06-1,50E+06 3350 3360 3370 3380 3390 3400 3410 340 Magnetic Field [G] Rysunek 6. Spektrum EPR adduktu DMPO-OH (*) oraz DMPO-CH(CH 3 )OH (+) powstałego podczas naświetlania roztworu A - chl w PBS, B - chl w PBS+0.5% Triton X100 OH+CH 3 CH OH CH(CH 3 )OH DMPO DMPO-CH(CH 3 )OH (a N =15,8 G, a H β=,8g)
Pułapkowanie spinowe Signal amplitude DMPO-OH (a.u.) 1400000 100000 1000000 800000 600000 400000 00000 0 0 1 3 4 5 6 7 8 Irradiation time (min) chl PBS chl PBS + 0,5mM NADH chl PBS + 5mM NaN3 chl PBS + 0,5% Triton X 100 Signal amplitude DMPO-OH (a.u.) 600000 500000 400000 300000 00000 100000 0 chl PBS chl PBS + 0,5mM NADH chl PBS + SOD 50ug/ml chl PBS+0.5mM NADH+50u/ml SOD chl PBS+10% EOH chl PBS+0.5mM NADH+10% EOH 0 1 3 4 5 6 7 8 Irradiation time (min) Wykres 4. Zmiany amplitudy rejestrowanego sygnału DMPO-OH w trakcie naświetlania chl.
Signal intensity [a.u.] A Spektroskopia EPR, Wykrywanie obecności anionorodnika ponadtlenkowego O przy użyciu sondy Tiron. Badanie generowania anionorodnika ponadtlenkowego przez badane związki w trakcie ich naświetlania. Naświetlanie w zakresie 54-74nm. Rejestracja sygnału semichinionu. Pomiary wykonywane dla związków rozpuszczonych w różnych 1,0E+06 8,0E+05 6,0E+05 4,0E+05,0E+05 0,0E+00 -,0E+05-4,0E+05-6,0E+05-8,0E+05-1,0E+06 środowiskach. -1,E+06 3380 3385 3390 3395 3400 Magnetic field [G] Rysunek 7. A - Przykładowy zarejestrowany sygnał semichinionu, B struktura chemiczna sondy spinowej Tiron. B Signal amplitude(a.u.) 1400000 100000 1000000 800000 600000 400000 00000 0 chl PBS chl PBS+50u/ml SOD chl PBS+0,5% tritonx100 (siatka) chl PBS+0,5% tritonx100+0,5mm NADH (siatka) 0 1 3 4 5 6 7 Irradiation time (min) Wykres 5. Zmiany amplitudy rejestrowanego sygnału semichinionu w trakcie naświetlania chl.
Podsumowanie Stopień monomeryzacji chloryn w badanych środowiskach determinuje fotosensybilizującą efektywność, wpływa również na rodzaj mechanizmu działania jaki dominuje w danym układzie. Prowadzone badania potwierdziły wytwarzanie przez badane związki reaktywnych form tlenu. W środowisku wodnym przeważa mechanizm typu I, w którym kluczowa rolę odgrywają wolne rodniki takie jak anionorodnik ponadtlenkowy i rodnik hydroksylowy. W środowisku micelarnym dużą rolę będzie odgrywał Typ II fotosensybilizowanego utleniania. Jednakże Typ I zdaje się wciąż być bardzo znaczący, a nawet bardziej niż w środowisku hydrofilowym.
Dziękuję za uwagę