Praca oryginalna Czy technika MLPA jest przydatna w diagnostyce prenatalnej aberracji regionów subtelomerowych u płodów z wadami rozwojowymi? Is subtelomeric MLPA test (Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification) useful in prenatal diagnosis of congenital malformations? Autorzy: Lech Dudarewicz 1, Anna Krzymińska 2, Wanda Hawuła 1, Magdalena Kozłowska 1, Urszula Laskowska 1, Agnieszka Gach 1, Maciej Borowiec 3, Wojciech Młynarski 3, Wojciech Ałaszewski 1, Lucjusz Jakubowski 1 1 Zakład Genetyki ICZMP w Łodzi, 93-338 Łódź, ul. Rzgowska 281/289, 2 Zakład Badań Neuropeptydów UM w Łodzi, 90-136 Łódź, ul. Narutowicza 60, 3 Klinika Pediatrii, Onkologii, Hematologii i Diabetologii UM w Łodzi, 91-738 Łódź, ul. Sporna 36/50 Polska Kardiologia Prenatalna ECHO PŁODU, 2013, 1 (8), 15-21 Streszczenie Cel badań: W chwili opracowywania projektu badań, w dostępnym piśmiennictwie nie było doniesień na temat częstości występowania rearanżacji subtelomerowych u płodów z nieprawidłowościami fenotypowymi widocznymi w obrazie USG oraz z prawidłowym kariotypem uzyskanym klasycznymi technikami cytogenetycznymi. Celem niniejszych badańbyła próba uzupełnienia tej luki. Materiał i metodyka: Badaniom techniką MLPA z wykorzystaniem we wszystkich przypadkach zestawów P036 i P070 ukierunkowanych na wykrywanie niezrównoważonych aberracji regionów subtelomerowych poddano próbki płynu owodniowego lub kosmków trofoblastu uzyskanych od: 137 płodów z nieprawidłowościami obrazu USG w obrębie co najmniej dwóch układów lub narządów 96 płodów z przeziernością karkową (NT-Nuchal Translucency) powyżej 3.5 mm (99 centyla), 85 płodów bez uchwytnych nieprawidłowości fenotypowych (grupa kontrolna). Potwierdzenia wykrytej nieprawidłowości dokonano za pomocą techniki fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH). Wyniki: W grupie płodów z nieprawidłowościami obrazu USG w obrębie co najmniej dwóch układów narządów stwierdzono jeden przypadek delecji subtelomerowej, (del1p36 de novo), co równa się częstości występowania submikroskopowych rearanżacji subtelomerowych 0.84% w tej grupie płodów. W grupie kontrolnej oraz w grupie płodów z pogrubieniem NT powyżej 99 centyla nie stwierdzono rearanżacji regionów subtelomerowych za pomocą stosowanej metody. Wnioski: Niska wykrywalność rearanżacji subtelomerowych w grupie badanej, w powiązaniu z ograniczoną wiarygodnością metody (tylko jedna sekwencja z danego regionu subtelomerowego badana w jednym eksperymencie) oraz z koniecznością potwierdzania wyników patologicznych za pomocą innej metody (np. FISH) stawiają pod znakiem zapytania sens wykorzystywania subtelomerowego testu MLPA w diagnostyce przedurodzeniowej, zwłaszcza w obecnej erze mikromacierzy całogenomowych, charakteryzujących się wysoką pewnością diagnozy oraz zakresem badania obejmującym prawie cały genom, co prowadzi do zwiększenia wykrywalności patologicznych rearanżacji, niewykrywalnych metodami klasycznymi. Słowa kluczowe: delecje subtelomerowe, rearanżacje subtelomerowe, aberracje chromosomowe submikroskopowe, diagnostyka prenatalna, diagnostyka przedurodzeniowa, wady rozwojowe płodu, badanie ultrasonograficzne ciąży, USG płodu, MLPA Abstract Objective of the study: At the moment of study design, there was no data available on prevalence of subtelomeric imbalanced rearrangements in fetuses with abnormal phenotype assessed by ultrasound and with normal classical karyotype, consequently this study was initiated to fill in this gap. 15
Polska Kardiologia Prenatalna Echo Płodu, 2013, 1 (8) Material & Method: Amniotic fluid samples or chorionic villi from: 137 fetuses with abnormalities in two or more organ systems 96 fetuses with nuchal translucency above 3.5 mm (99th centile), 85 apparently healthy fetuses (control group) were studied by subtelomeric MLPA, using two kits (P036 and P070) in all cases. Confirmation of a rearrangement was obtained by means of fluorescence in situ hybridization (FISH) studies. Results: In the group of fetuses with abnormalities in two or more organ systems, one subtelomeric deletion (de novo deletion (del1p36).) was detected, yielding the detection rate of cryptic subtelomeric imbalances in these pregnancies of 0.84%. In the control group and in the group of fetuses with NT measurement above 3.5 mm, no abnormalities were found. Conclusion: The low detection rate of subtelomeric rearrangements in the studied group, together with the low robustness of the method (only one sequence per telomere is studied in one experiment) and necessity to confirm the pathological findings with another method, imply low usefulness of the method in the prenatal setting. In the current era, there are genome-wide methods, like CGH-arrays or SNP-array, which are better-suited for prenatal diagnosis, because of higher yields and lack of necessity of confirmation of the pathological results. Key words: subtelomeric deletions, subtelomeric rearrangements, submicroscopic chromosome aberrations, prenatal diagnosis, congenital defects, fetal structural defects, abnormal fetal fenotype, fetal ultrasound, prenatal ultrasound, MLPA WSTĘP Badania płodu w ramach diagnostyki prenatalnej mogą mieć szeroki zakres związany z oceną zdrowia płodu. Część tej diagnostyki dotyczy badań pod kątem wad rozwojowych lub chorób uwarunkowanych genetycznie. Badania te mogą być efektem wcześniejszego już zakwalifikowania rodziny do grupy ryzyka wystąpienia tego typu nieprawidłowości rozwojowych, lub są konsekwencją obserwacji poczynionych podczas rutynowej opieki położniczej. Nawet rutynowe badanie ultrasonograficzne lub wynik nieinwazyjnych badań przesiewowych mogą kwalifikować ciężarną do przeprowadzenia dalszych procedur diagnostycznych. W dotychczasowym piśmiennictwie niewiele opracowań poświęcono badaniom rearanżacji subtelomerowych w odniesieniu do płodów z wadami rozwojowymi i prawidłowym kariotypem. W odróżnieniu od pacjentów w okresie postnatalnym, w odniesieniu do płodów z nieprawidłowym fenotypem istnieją jedynie nieliczne publikacje na temat występowania rearanżacji subtelomerowych, a wyniki tych badań są często sprzeczne 1,2,3,4. CEL PROJEKTU U większości płodów i noworodków z zespołem wad rozwojowych nie udaje się ustalić rozpoznania przyczynowego, co utrudnia poradnictwo genetyczne. W związku z powyższym, celem przeprowadzonych badań było uzyskanie danych odnośnie występowania rearanżacji subtelomerowych wśród płodów z prawidłowym kariotypem, określonym na podstawie klasycznego badania cytogenetycznego, diagnozowanych w Zakładzie Genetyki Instytutu Centrum Zdrowia Matki Polki w Łodzi z powodu nieprawidłowego fenotypu na podstawie obrazu ultrasonograficznego i określenie przydatności skriningu rearanżacji subtelomerowych z wykorzystaniem techniki MLPA w grupie płodów z prawidłowym kariotypem i niewyjaśnionymi nieprawidłowościami fenotypowymi. Dodatkowym celem planowanym w założeniach badań było określenie ewentualnej korelacji pomiędzy rodzajem obserwowanych u płodów nieprawidłowości fenotypowych i typem rearanżacji subtelomerowych. MATERIAŁ I METODYKA Grupę badaną stanowiły płody diagnozowane z powodu nieprawidłowego obrazu ultrasonograficznego. Wykluczono z badania przypadki nieprawidłowości kariotypu, widocznych w klasycznym badaniu cytogenetycznym w mikroskopie świetlnym i przypadki z danymi niekompletnymi lub z wynikami nieinformatywnymi. Z badania wykluczono również płody z izolowanymi nieprawidłowościami układu kostnego, moczowego, pokarmowego, ścian jamy brzusznej i układu krążenia. Aberracje chromosomowe rozpoznawano lub wykluczano przed urodzeniem na podstawie badania kariotypu płodu, w części przypadków badanie kariotypu było weryfikowane po porodzie. Wiek ciążowy określano na podstawie pomiarów ultrasonograficznych najczęściej wykonanych podczas pierwszego trymestru. Przed przystąpieniem do badań wszystkim pacjentkom udzielano szczegółowej porady genetycznej i informacji na temat badań, w tym inwazyjnych badań przedurodzeniowych. Pacjentki wyrażały i dokumentowały na piśmie zgodę na przeprowadzenie badań. Podczas badania USG dokonywano oceny budowy anatomicznej płodu oraz parametrów biometrycznych. Pomiar przezierności karkowej płodu wykonywano zgodnie z zaleceniami FMF (Fundacji Medycyny Płodowej, Londyn, www.fetalmedicine.com) przez operatora z aktualnym 16
certyfikatem. Badania USG rozpoczynano przez powłoki brzuszne, a jeżeli nie udało się uzyskać optymalnej wizualizacji, wykonywano również badanie sondą przezpochwową. Badania USG wykonywano aparatem General Electric Voluson 730, z sondami wieloczęstotliwościowymi typu convex. W ramach niniejszego projektu badano płody z nieprawidłowościami fenotypowymi, które klasyfikowano jako mnogie wady rozwojowe, zespoły malformacyjne lub wczesny defekt morfogenezy. Odrębną grupę stanowiły płody z przeziernością karkową (NT Nuchal Translucency) powyżej 99 centyla, bez innych nieprawidłowości fenotypowych. Wartość 99 centyla wybrano ze względu na niewielki odsetek w stosunku do całej grupy płodów z pogrubieniem NT i wysokie prawdopodobieństwo występowania znaczących zaburzeń przy tej wartości przezierności karkowej 5. W grupie płodów ze zwiększoną przeziernością karkową mediana wynosiła 5.1 mm, a zakres wahał się od 3.5 do 11 mm. Wiek ciążowy w grupie badanej w chwili pobrania płynu owodniowego wahał się od 15 do 31 tygodni, a w chwili pobrania kosmków trofoblastu wahał się od 11 do 14 tygodni. Wartość mediany wieku ciążowego wynosiła 18 tygodni. rearanżacji subtelomerowych przeprowadzono w grupie kontrolnej 85 płodów z prawidłowym fenotypem w USG, kariotypowanych z powodu wieku matki. Metodyka DNA z płynu owodniowego lub kosmków trofoblastu ekstrahowano zestawem QIAamp DNA mini (Qiagen, USA). Reakcję MLPA przeprowadzano zgodnie z protokołem producenta. Po 40 cyklach amplifikacji PCR, dokonywano rozdziału produktów za pomocą analizatora genetycznego ABI 3100 (Applied Biosystems, USA). Założenia techniki MLPA wyjaśnia ryc. 1. Reakcję MLPA przeprowadzano zgodnie z protokołem producenta z wykorzystaniem zestawów P036 i P070 do diagnostyki rearanżacji subtelomerowych. Każdy źródło: www.mlpa.com Kryteria włączenia spełniło 137 płodów z nieprawidłowościami fenotypowymi opisanymi w tabeli I. U 119 płodów uzyskano informatywny wynik badania MLPA. Dodatkowo badania techniką MLPA w kierunku Typ anomalii Trymestr Type of the anomaly I II/III Wady w 3 układach narządów* Malformations in > 3 organ systems * 5 12 Wady w 2 układach narządów * Malformations in 2 organ systems 7 37 Wada serca/układu krążenia z cechami dysmorfii Cardiovascular malformations combined with 8 22 dysmorphism Wada ścian jamy brzusznej z cechami dysmorfii ** Abdominal wall defects combined with dysmorphism** 6 10 Wada układu nerwowego z cechami dysmorfii *** CNS defects combined with dysmorphism*** 5 11 Wada twarzy/czaszki z pozaczaszkowymi cechami dysmorfii Craniofacial defects combined with extrafacial 3 11 dysmorphism NT 99 centyla NT 99 centile 96 - Rycina 1 MLPA zasada Fig. 1. MLPA The principle * - po wykluczeniu pogrubienia NT (After exclusion of NT thickening) ** - po wykluczeniu rozszczepu powłok brzusznych (gastroschisis) (After exclusion of gastroschisis) *** - po wykluczeniu izolowanych wad cewy nerwowej łącznie z objawami dysmorfii z nimi związanych (After exclusion of isolated dysrafic defects and their associated findings) Tabela I: Rozkład liczby płodów w zależności od trymestru ciąży oraz rodzaju anomalii Table I: Distribution of fetuses according to the gestational age and number of anomalies 17
Polska Kardiologia Prenatalna Echo Płodu, 2013, 1 (8) z tych zestawów zawiera po jednej sondzie dla każdego z regionów subtelomerowych. Zestawy te zostały zaprojektowane do wykrywania delecji/duplikacji regionów subtelomerowych. Większość sond jest komplementarnych do dobrze scharakteryzowanych genów położonych w pobliżu telomeru. Chromosomy 13, 14, 15, 21 oraz 22 posiadają ponad 10 Mb sekwencji repetytywnych, które pokrywają większość ramion p. Dla tych chromosomów wykorzystano sekwencje jedynie z ramion q. Dla potwierdzenia wyników próbki od wszystkich pacjentów były przebadane z wykorzystaniem obu zestawów, z których każdy jest ukierunkowany na wykrywanie innych sekwencji, ze zbliżonego regionu. Wszystkie sondy w zestawie P070 różnią się od sond z zestawu P036, tak więc zbadano obecność dwóch różnych sekwencji na każdy region subtelomerowy. Analiza próbek Dane zostały przeanalizowane za pomocą oprogramowania GeneMarker (SoftGenetics, USA) po dokonaniu normalizacji danych wewnątrz próbki i pomiędzy różnymi próbkami. Normalizacja danych została przeprowadzona zgodnie z protokołem opracowanym przez producenta zestawów MLPA, z przestrzeganiem zasady, aby porównywać jedynie próbki DNA ekstrahowanego przy użyciu tej samej metody, uzyskanej podczas jednego eksperymentu i jednej serii odczynnika (mieszaniny sond). Iloraz dawek dla każdej próbki obliczano dzieląc wysokości pików próbki badanej po normalizacji przez średnią wysokość pików z próbek kontrolnych i wyrażano jako MLPA ratio. Kryteria rozpoznawania nieprawidłowości Wartości MLPA ratio ustalono na około 1,0 dla pików typu dzikiego, poniżej 0,75 dla delecji oraz ponad 1,32 dla duplikacji. Wyniki nieprawidłowe potwierdzano za pomocą techniki FISH (Fluorescent In Situ Hybridization) z wykorzystaniem systemu Chromoprobe Mulitiprobe-T (Cytocell). WYNIKI Reakcję MLPA z wykorzystaniem zestawów P036 i P070 do diagnostyki rearanżacji subtelomerowych przeprowadzono pomiędzy 11 a 31 tygodniem ciąży u 137 płodów z prawidłowym kariotypem (GTG, >400 prążków) i nieprawidłowym fenotypem w USG, oraz u 96 płodów z wartością NT powyżej 99 centyla, jak również w grupie kontrolnej 85 płodów z prawidłowym fenotypem w USG, kariotypowanych z powodu wieku matki. Próbki od wszystkich pacjentów były przebadane z wykorzystaniem obu zestawów, z których każdy jest ukierunkowany na wykrywanie innych blisko leżących sekwencji, tak więc zbadano obecność dwóch różnych sekwencji na każdy region subtelomerowy. Wyniki nieprawidłowe potwierdzano za pomocą techniki FISH (Fluorescent In Situ Hybridization) z wykorzystaniem systemu Chromoprobe Mulitiprobe-T (Cytocell). Po MLPA stwierdzono zmiany liczby sekwencji u 29 płodów z grupy badanej i u 16 płodów z grupy kontrolnej. U 25 płodów z grupy badanej oraz u 16 płodów z grupy kontrolnej stwierdzono zmiany liczby kopii sekwencji, które nie zostały potwierdzone przy użyciu alternatywnego zestawu, można więc sądzić, że mogły mieć charakter artefaktu. Trzy próbki nie były dostępne do weryfikacji. W tych przypadkach nie była możliwa weryfikacja po porodzie, ze względu na obumarcie/terminację ciąży. W ostatecznej analizie u jednego płodu wykryto i potwierdzono zmianę liczby kopii sekwencji subtelomerowej zlokalizowaną w krótkim ramieniu chromosomu 1. Zmiana ta była delecją de novo (del1p36). Wykryta została za pomocą MLPA i potwierdzona przy użyciu techniki FISH. Z powyższych względów, oraz ze względu na fakt, iż fenotyp płodu korespondował z charakterystycznym obrazem klinicznym znanym z literatury, zmiana ta została uznana za istotną klinicznie, pozostającą w związku przyczynowo-skutkowym z chorobą płodu. Opisywana delecja 1p36 została stwierdzona u płodu z wadami serca i twarzoczaszki. Oboje rodzice chorego płodu byli klinicznie zdrowi i mieli prawidłowe wyniki testu subtelomerowego. Tym samym częstość występowania rearanżacji subtelomerowych w grupie mnogich nieprawidłowości fenotypowych za pomocą użytej metody można określić na 1/119 a wśród płodów z NT powyżej 99 centyla na 0/96. Przykład prawidłowego wyniku testu subtelomerowego z wykorzystaniem techniki MLPA przedstawia rycina 2. Dla porównania jedyny potwierdzony nieprawidłowy wynik testu subtelomerowego z wykorzystaniem techniki MLPA przedstawia rycina 3. OMÓWIENIE WYNIKÓW MLPA jest wszechstronną techniką umożliwiającą jednoczesne badanie dowolnych kilkudziesięciu sekwencji, wykorzystywaną w wielu zastosowaniach badawczych. Zasadą tej techniki (schemat wyjaśniający zasadę na ryc. 1) jest powielanie w PCR nie cząsteczki DNA badanego lecz sond komplementarnych do określonych sekwencji badanego DNA. Są one powielane w liczbie wprost proporcjonalnej do początkowej liczby wybranych sekwencji w materiale badanym. Liczbę powielonych cząsteczek poszczególnych sond oblicza się za pomocą urządzenia do elektroforezy kapilarnej. Istnieją zestawy MLPA dobrane dla celów diagnostyki najczęstszych aneuploidii, zespołów mikrodelecyjnych i rearanżacji subtelomerowych (oraz poza diagnostyką prenatalną do wielu innych zastosowań). Zalety metody to krótki czas do uzyskania wyniku, możliwość potwierdzenia aberracji (monosomii, tri- lub tetrasomii) za pomocą innego zestawu sond, z użyciem innych sekwencji z danego regionu chromosomowego, możliwość badania wielu (około 40) sekwencji w jednej reakcji, niski koszt jednostkowy i duże możliwości automatyzacji oraz przeanalizowania 18
Rycina 2 - Przykład prawidłowego wyniku testu subtelomerowego z wykorzystaniem techniki MLPA Fig. 2 - An example of normal result of subtelomer test with MLPA technique w jednym eksperymencie próbek od dużej liczby pacjentów. Wadą jest konieczność zastosowania DNA o wysokiej jakości oraz względnie dużej ilości (co ma znaczenie w diagnostyce przedurodzeniowej), często występujące trudności interpretacyjne oraz trudności w wykryciu ewentualnego zanieczyszczenia materiałem matczynym 6. Metoda stosowana do badań sekwencji subtelomerowych w okresie przedurodzeniowym ma kilka wad: Ze względu na fakt, że tylko jedna sekwencja jest badana w danym eksperymencie na jeden telomer, metoda jest podatna na błędy. Ze względu na częste występowanie wyników fałszywych, wskazane jest wykonanie badania dwoma zestawami i konieczne dokonanie weryfikacji wyników prawidłowych za pomocą innej metody - w naszym przypadku była to technika fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ. Na podstawie badań własnych nie jest możliwe udzielenie odpowiedzi na pytanie, jaka była przyczyna wyników fałszywie dodatnich, można jedynie domniemywać, że ich część mogła być spowodowana przez obecność sekwencji polimorficznych, jak również przez zanieczyszczenie próbki krwią matki. Technika MLPA jest bardzo wrażliwa nie tylko na zanieczyszczenia próbki badanej, ale również na małe zmiany w warunkach eksperymentu. W znacznym odsetku próbek archiwalnych, zebranych w latach poprzedzających niniejsze badania, okazało się, że DNA było zbyt pofragmentowane wskutek zamrożenia lub było go zbyt mało, aby możliwe było uzyskanie miarodajnego wyniku. Konieczność weryfikowania wyników inną metodą również jest poważną wadą, eliminującą tę metodę w znacznym stopniu z zastosowań klinicznych w badaniach przedurodzeniowych. W niniejszych badaniach wykorzystano testy subtelomerowe MLPA dla poszukiwania rearanżacji regionów subtelomerowych wszystkich chromosomów, jako możliwej przyczyny zaburzeń fenotypowych. Rearanżacja subtelomerowa jako przyczyna nieprawidłowego fenotypu płodu została wykryta i potwierdzona zaledwie w jednym przypadku na 119 przypadków mnogich nieprawidłowości fenotypowych oraz u żadnego płodu z izolowanym pogrubieniem NT 19
Polska Kardiologia Prenatalna Echo Płodu, 2013, 1 (8) Rycina 3 - Nieprawidłowy wynik testu subtelomerowego z wykorzystaniem techniki MLPA Fig. 3 - An abnormal result of suntelomer test of MLPA technique i u żadnego płodu z grupy kontrolnej. W przypadku potwierdzonej techniką FISH delecji 1p36 związek pomiędzy nieprawidłowym fenotypem a obserwowaną delecją wydaje się udowodniony, gdyż była to delecja de novo o obrazie pokrywającym się z opisami literaturowymi 7. Porównanie uzyskanych przez nas wyników z wynikami innych autorów jest ograniczone niewielką liczbą doniesień istniejących w piśmiennictwie światowym oraz niewielką liczbą badanych płodów, niemniej można stwierdzić, że opisana niska częstość rearanżacji subtelomerowych u płodów z nieprawidłowościami fenotypowymi mieści się w granicach opisywanych w piśmiennictwie 1,2,3,4,5. Warto nadmienić, że wiele czynników (wspomniany wcześniej polimorfizm lub mutacja leżąca w obrębie sekwencji wykrywanej przez sondę MLPA, jak również nieznaczna zmiana warunków reakcji) może prowadzić do zmiany pola powierzchni pików i tym samym do wyniku fałszywego. Przy zastosowaniu zaledwie jednej lub dwóch (przy weryfikacji wyniku drugim zestawem) sond na telomer pewność wnioskowania na temat rzeczywistej rearanżacji nie jest wysoka i niekorzystnie odbiega od nowszych metod, jak mikromacierze lub sekwencjonowanie nowej generacji, gdzie analizowane są jednocześnie liczne sekwencje z danego regionu chromosomowego. WNIOSKI Wyniki niniejszych badań trzeba traktować z ostrożnością, ze względu na: ograniczoną liczbę badanych przypadków, występowanie wyników nieinformatywnych, niemożliwych do weryfikacji, pochodzenie pacjentów z jednego ośrodka z możliwą selekcją przypadków. Testy subtelomerowe MLPA są trudniejsze w wykonaniu i interpretacji nawet od innych badań przeprowadzanych tą samą techniką ze względu na trudności techniczne oraz niższą wiarygodność, związaną z małą liczbą sekwencji badanych na telomer, niemożliwe jest w praktyce analizowanie próbek zarchiwizowanych. W naszej opinii opisane powyżej ograniczenia testów subtelomerowych MLPA, w połączeniu z niskim odsetkiem wykrytych patologii nie uzasadniają wprowadzenia tej metody do rutynowej diagnostyki klinicznej w zakresie diagnostyki przedurodzeniowej. 20
Badana grupa nie zawierała dostatecznej liczby płodów z rearanżacjami subtelomerowymi, aby możliwa była analiza korelacji fenotypowo-genotypowej. Adres do korespondencji: lechdudarewicz@wp.pl Piśmiennictwo 1. Multiplex ligation-dependent probe amplification (MLPA) and prenatal diagnosis. Willis AS, van den Veyver I, Eng CM. Prenat Diagn. 2012 Apr;32(4):315-20 2. Subtelomeric MLPA: is it really useful in prenatal diagnosis? Mademont-Soler I, Morales C, Bruguera J, Madrigal I, Clusellas N, Margarit E, Sánchez A, Soler A: Prenat Diagn. 2010 Dec;30(12-13):1165-9. doi: 10.1002/pd.2635 4. Detection of cryptic subtelomeric imbalances in fetuses with ultrasound abnormalities. Faas BH, Nillesen W, Vermeer S, Weghuis DO, de Leeuw N, Smits AP, van Ravenswaaij- Arts CM: Eur J Med Genet. 2008 Nov-Dec;51(6):511-9 Increased nuchal translucency with normal karyotype: a follow-up study of 100 cases supplemented with CGH and MLPA analyses. Schou KV, Kirchhoff M, Nygaard U, Jørgensen C, Sundberg K. Ultrasound Obstet Gynecol. 2009 Dec;34(6):618-22 5. Increased nuchal translucency with normal karyotype: a follow-up study of 100 cases supplemented with CGH and MLPA analyses. Schou KV, Kirchhoff M, Nygaard U, Jørgensen C, Sundberg K: Ultrasound Obstet Gynecol. 2009 Dec;34(6):618-22 6. Evaluation of MLPA for the detection of cryptic subtelomeric rearrangements. Monfort S, Orellana C, Oltra S, Roselló M, Guitart M, Martínez F: J Lab Clin Med. 2006 Jun;147(6):295-300 7. Del 1p36 syndrome: a newly emerging clinical entity. Battaglia A: Brain Dev. 2005;27:358 61 3. Prenatal study of common submicroscopic genomic disorders using MLPA with subtelomeric/microdeletion syndrome probe mixes, among gestations with ultrasound abnormalities in the first trimester. Roselló M, Ferrer-Bolufer I, Monfort S, Oltra S, Quiroga R, Martínez F, Gonzalvo M, Benac A, Perales A, Orellana C: Eur J Med Genet. 2010 Mar-Apr;53(2):76-9 21 21