Chelatory metali w terapiach przeciwnowotworowych

WSZCZĘCIE PRZEWODU DOKTORSKIEGO Proponowany tytuł pracy Chelatory metali w terapiach przeciwnowotworowych Katarzyna Malarz Opiekun pracy: dr hab. Robert Musioł Opiekun pomocniczy: dr Anna Mrozek-Wilczkiewicz Instytut Chemii Wydział Matematyki, Fizyki i Chemii Uniwersytet Śląski Katowice, 2016

Spis treści I. Wstęp 3 II. Przegląd literatury 4 1. Charakterystyka i metabolizm reaktywnych form tlenu 4 2. System komórkowej regulacji redoks 5 3. Stres oksydacyjny w terapiach przeciwnowotworowych 7 4. Rola jonów żelaza i miedzi w utrzymaniu homeostazy komórkowej 9 5. Chelatory metali w terapiach przeciwnowotworowych 9 III. Cel i zakres pracy 14 IV. Badania własne 15 1. Tiosemikarbazony 15 1.1. Oznaczenia cytotoksyczności in vitro 15 1.2. Generowanie reaktywnych form tlenu i wpływ na poziom glutationu 21 1.3. Peroksydacja lipidów 24 2. Glikokoniugaty 25 2.1. Cytotoksyczność in vitro 25 2.2. Wpływ jonów metali na proliferację komórek 27 2.3. Generowanie reaktywnych form tlenu przez glikokoniugaty 29 2.4. Wpływ reaktywnych form tlenu na glutation oraz indukcję apoptozy 30 2.5. Interkalacja DNA 31 V. Podsumowanie 33 VI. Dalsze plany 35 VII. Bibliografia 35 VIII. Dorobek naukowy 39 2

I. Wstęp Choroby nowotworowe to jeden z najpoważniejszych problemów zdrowotnych na świecie. Zgodnie z raportami Światowej Organizacji Zdrowia, odpowiadają one za ponad 13% wszystkich zgonów na całym świecie, co plasuje je na drugim miejscu, zaraz po chorobach układu krążenia [1]. W związku z tym, konieczne jest poszukiwanie nowych, skutecznych leków, a także rozwiązań w walce z nowotworami. Istotnym elementem tych poszukiwań jest coraz lepsze poznanie mechanizmów działania potencjalnych leków, co jest kluczowe dla stałego ich doskonalenia i stanowi jedno z najważniejszych wyzwań dla współczesnej nauki. Rozwój chemii medycznej oraz racjonalnego projektowania leków tworzy podstawy nowoczesnych metod leczenia. Obecnie wiele badań w tej dziedzinie skupia się na mechanizmach nowotworzenia, wskazując szczególną rolę cząsteczek zaangażowanych w progresję cyklu komórkowego oraz transdukcje sygnałów [2]. Z uwagi na stopień skomplikowania procesu, leki skupione wyłącznie na jednym celu molekularnym, jak inhibitory docelowych białek, nie spełniają wszystkich wymagań. Kluczowym problemem jest bowiem szybki rozwój i transformacja nowotworów, które poprzez specyficzne mutacje mogą zmieniać strukturę celów. W związku z tym coraz więcej uwagi zyskuje dynamicznie rozwijane podejście polifarmakologiczne jako właściwsze wobec złożonych i wieloaspektowych chorób nowotworowych [3]. Głównym jego założeniem jest projektowanie leków, które oddziałują z wieloma celami, przez co posiadają lepszy profil selektywności i skuteczności, w odniesieniu do leków jednocelowych. Zaletą wielokierunkowych terapii celowanych jest również przezwyciężenie problemu oporności na lek [4]. Co ciekawe, w ostatnim czasie rozwijany jest nurt terapii oksydacyjnej, która wpisuje się w założenia polifarmakologii, a której podstawą jest zaburzenie komórkowej homeostazy redoks [5]. Terapia ta może być skutecznie wykorzystywana, bowiem łączy dwa ważne aspekty, takie jak selektywność terapeutyczną oraz mniejszą wrażliwość na lekooporność [6,7]. Podstawowym celem takiej terapii są zjawiska związane ze zwiększonymi stężeniami reaktywnych form tlenu (ang. reactive oxygen species, ROS) w komórkach nowotworowych w porównaniu z komórkami normalnymi [8,9]. W efekcie, komórki nowotworowe są jeszcze bardziej wrażliwe na stres oksydacyjny wywołany przez związki cytotoksyczne, zdolne zwiększać poziom ROS lub zmniejszać skuteczność obrony antyoksydacyjnej. Ponadto w komórkach nowotworowych obserwowane są wyższe poziomy wewnątrzkomórkowego glutationu, co jest związane ze zjawiskiem oporności na leki [10 12]. Interesującymi grupami potencjalnych leków, które wpisują się w powyższe strategie, a także nurt wielokierunkowych terapii celowanych mogą być związki chelatujące metale, takie jak tiosemikarbazony (TSC) [13] oraz pochodne chinoliny [14]. Szczególnie na uwagę zasługują związki oparte o motyw strukturalny 8-hydroksychinoliny (8-HQ), który może wywołać określone efekty biologiczne [15]. Co więcej, połączenie 8-HQ z fragmentami cukrowymi, prowadzi do powstania glikokoniugatów (GC), które charakteryzują się lepszymi parametrami farmakokinetycznymi, właściwościami biologicznymi, a także większą biodostępnością niż związki macierzyste [16]. 3

II. Przegląd literatury 1. Charakterystyka i metabolizm reaktywnych form tlenu Reaktywne formy tlenu charakteryzują się dwoistą naturą, wywierając w układach biologicznych, zarówno korzystne, jak i szkodliwe efekty [17]. Początkowo ROS uważano za produkty uboczne metabolizmu komórkowego, szczególnie oddychania komórkowego [18]. Jednakże, obecnie uznawane są również za cząsteczki sygnałowe, odpowiedzialne za aktywację i regulację wielu ważnych procesów komórkowych, takich jak transdukcja sygnałów, metabolizm, proliferacja oraz apoptoza [8,19]. Mianem reaktywnych form tlenu określana jest heterogenna grupa związków tlenu, które charakteryzują się większą reaktywnością od tlenu cząsteczkowego O2 [20]. Do tej grupy zaliczamy wolne rodniki, m.in. anionorodnik ponadtlenkowy (O2 - ), rodnik hydroksylowy ( OH), a także formy o charakterze nie rodnikowym, jak nadtlenek wodoru (H2O2). Większość wewnątrzkomórkowych ROS powstaje wskutek jednoelektronowej redukcji tlenu cząsteczkowego do anionorodnika ponadtlenkowego (Rys. 1) [21,22]. Rys. 1 Etapy powstawania reaktywnych form tlenu podczas redukcji tlenu cząsteczkowego. SOD dysmutaza ponadtlenkowa; CAT katalaza; GPx peroksydaza glutationu [21,22]. Anionorodnik ponadtlenkowy nie jest zbyt reaktywny wobec aminokwasów i kwasów nukleinowych. Jednakże może szybko reagować z enzymami, jonami metali zwłaszcza miedzi oraz związkami zawierającymi grupy tiolowe. W ten sposób przyczynia się do powstawania następczych form ROS [23]. W kolejnym etapie redukcji O2, anionorodnik ponadtlenkowy ulega przekształceniu do nadtlenku wodoru pod wpływem dysmutazy ponadtlenkowej (SOD) [21]. Nadtlenek wodoru może być bardzo reaktywny w obecności jonów metali Fe i Cu, wytwarzając rodnik hydroksylowy w reakcjach Fentona i Habera- Weissa (Rys. 2) [24]. Rys. 2 Reakcje Fentona (1) i Habera-Weissa (2) [24]. 4

Silnie elektrofilowy charakter OH powoduje, iż jest on odpowiedzialny za powstawanie większości oksydacyjnych uszkodzeń cząsteczek DNA oraz może indukować uszkodzenia białek oraz lipidów [24,25]. Oksydacyjne uszkodzenia DNA obejmują utlenianie puryn i pirymidyn, co w konsekwencji prowadzi do pojedynczych modyfikacji zasad, całych nukleotydów oraz jedno- i dwuniciowych pęknięć DNA [26,27]. Najczęściej modyfikowana przez rodnik hydroksylowy jest guanina, tworząc 8-hydroksyguaninę (8-OH-G) [27,28]. Wiele danych literaturowych wskazuje na bezpośredni związek poziomu 8-OH-G z transformacją nowotworową guzów, a także silne zaangażowanie tego produktu utleniania w proces kancerogenezy [29,30]. Reaktywne formy tlenu mogą być generowane w wyniku wewnętrznych przemian, jak i przy pomocy zewnętrznych czynników. Głównymi źródłami wewnątrzkomórkowych ROS jest mitochondrialny łańcuch oddechowy, cytochrom P-450, peroksysomy oraz aktywne komórki zapalne [24,29]. Natomiast zewnątrzkomórkowe źródła ROS to czynniki fizyczne, np. promieniowanie jonizujące i ultrafioletowe, ultradźwięki, a także ksenobiotyki, takie, jak chinony, kompleksy metali, związki nitroaromatyczne, fotosensybilizatory, itp. [24,26,31]. Ze względu na wysoce reaktywny charakter, poziom ROS jest ściśle kontrolowany przez system obrony antyoksydacyjnej, który utrzymuje komórki w stanie równowagi redoks [29]. 2. System komórkowej regulacji redoks System kontroli wewnątrzkomórkowego potencjału redoks jest niezbędnym elementem zapewniającym utrzymanie homeostazy komórkowej, a także regulatorem wielu funkcji metabolicznych komórek [32]. Centralną rolę w systemie pełnią mitochondria, które nie tylko są głównym źródłem produkcji reaktywnych form tlenu, ale również posiadają rozbudowany system antyoksydacyjny (Rys. 3) [33,34]. System antyoksydacyjny składa się z białek enzymatycznych, takich jak dysmutaza ponadtlenkowa (Mn-SOD), katalaza (CAT), peroksydaza (GPx) i reduktaza glutationowa (GR), peroksydaza tioredoksyny i peroksyredoksyna (PRX), a także białek nieenzymatycznych - glutationu (GSH), tioredoksyny (Trx) oraz witaminy C i E [8,31,34,35]. Obecnie za główne układy redukujące i chroniące przed stresem oksydacyjnym w komórkach uważane są systemy oparte na glutationie i tioredoksynie [32]. 5

Rys. 3 System komórkowej regulacji redoks. Skróty: PM (ang. plasma membrane) błona komórkowa; OMM (ang. outer mitochondrial membrane) zewnętrzna błona mitochondrialna; IMM (ang. inner mitochondrial membrane) wewnętrzna błona mitochondrialna; MPTP - por zmiany przepuszczalności mitochondrialnej [8]. Glutation jest najbardziej rozpowszechnionym małocząsteczkowym tiolem w komórkach zwierzęcych, składającym się z trzech reszt aminokwasowych: cysteiny, glutaminy i glicyny, posiadającym grupę tiolową (SH), która jest potencjalnym reduktorem. W zdrowych komórkach i tkankach przeważającą część zasobów glutationu stanowi jego forma zredukowana, pozostałe 10% to forma utleniona [25]. GSH pełni kluczową rolę w utrzymaniu równowagi stosunków form utlenionych do zredukowanych dinukleotydu nikotynoadeninowego (NADP/NADPH) oraz glutationu utlenionego (GSSG) do formy zredukowanej - GSH poprzez regulację wewnątrzkomórkowego poziomu NADPH [8]. Jednakże, układ ten oprócz swoich własności przeciwutleniających i zaangażowania w utrzymaniu komórkowej równowagi redoks, odgrywa istotną rolę w regulacji śmierci komórkowej w wyniku zubożenia GSH [36]. W wyniku nadmiernej produkcji ROS, na przykład indukowanej chemioterapeutykami i metalami, a w konsekwencji nagromadzenia wolnych rodników dochodzi do obniżenia poziomu zredukowanego glutationu oraz zmiany stosunku form GSH/GSSG w stronę form utlenionych. W związku z następującym przejściem dochodzi do zwiększonej wrażliwości komórek na stres oksydacyjny, co w konsekwencji prowadzi do wyzwolenia apoptozy [37 39]. Interesującym faktem, jest udział GSH 6

w procesie oporności na leki. Zjawisko to jest związane ze wzrostem poziomu GSH, a także aktywności S-transferazy glutationu (GST) i ligazy γ-glutamylocysteiny (GLC) [40]. Bowiem podwyższona ekspresja GST, w połączeniu z wysokimi poziomami GSH, może zwiększyć szybkość sprzęgania i detoksykacji chemioterapeutyków, zmniejszając ich efektywność [10,35]. Z kolei tioredoksyna jest białkiem o masie cząsteczkowej 12kDa, które zawiera 5 reszt cysteiny. Cząsteczki Trx mogą katalizować odwracalną redukcję wiązań disiarczkowych białek powstałych w wyniku stresu oksydacyjnego, po czym same mogą ulegać utlenieniu w wyniku redukcji wiązań. Z Trx współdziała reduktaza tioredoksyny, która redukuje formy utlenione Trx wykorzystując NADPH jako donor elektronów [41]. Ponadto podobnie jak GSH, układ Trx reguluje wiele innych procesów biologicznych. Układ Trx współpracuje nie tylko z reduktazą glutationu (Grx) przy redukcji mostków disiarczkowych białek, ale również dostarcza elektrony dla reduktazy rybonukleotydowej (RR) [36]. Enzym ten, katalizuje reakcje redukcji rybonukleotydów do odpowiadających im deoksyrybonukleotydów (dntp) niezbędnych składników DNA [42]. Zatem blokowanie aktywności RR może hamować syntezę i naprawę DNA, co w konsekwencji może prowadzić do aktywacji apoptozy. Ponadto, dalszy rozwój badań nad wpływem Trx i Grx w regulacji aktywności RR może przyczyniać się do projektowania i rozwoju nowych inhibitorów RR, które mogą charakteryzować się złożonym mechanizmem działania, opierającym się na zatrzymaniu syntezy DNA, a także indukcji stresu oksydacyjnego [43]. 3. Stres oksydacyjny w terapiach przeciwnowotworowych Stres oksydacyjny jest definiowany jako zaburzenie równowagi pomiędzy wytwarzaniem reaktywnych form tlenu, a systemem ich eliminacji poprzez mechanizmy obronne komórki [44]. Wzmożona produkcja i akumulacja ROS w wyniku działania czynników zewnętrznych, może indukować odpowiedź komórkową. W konsekwencji dochodzi do zmiany ekspresji wielu genów, zatrzymania cyklu komórkowego, aktywacji czynników transkrypcyjnych, a w ostateczności do wyzwolenia śmierci komórkowej [45]. Zwiększony stres oksydacyjny odgrywa kluczową rolę w różnych stanach patologicznych, szczególnie w chorobach neurodegeneracyjnych, nowotworowych oraz starzeniu [34]. Poprawa aktywności terapeutycznej i selektywności jest głównym celem rozwoju strategii przeciwnowotworowych. Wykorzystanie i zastosowanie terapii opartych na wywołaniu stresu oksydacyjnego, jest obiecującym podejściem ze względu na różnice genetyczne między komórkami normalnymi, a nowotworowymi [46]. Komórki nowotworowe charakteryzują się podwyższonym podstawowym poziomem ROS ze względu na zmiany aktywności metabolicznej, a przede wszystkim wzmożoną glikolizą tlenową (efekt Warburga) [9]. Tym samym, znajdując się w stanie stałego stresu oksydacyjnego posiadają zmodyfikowany system obrony antyoksydacyjnej, który pozwala zaadaptować się do tych warunków i uniknąć negatywnych skutków oddziaływania ROS (Rys. 4) [46,47]. Wysoki poziom reaktywnych form tlenu w komórkach nowotworowych może wywołać dwojaki efekt 7

[41,48]. Z jednej strony może wpływać na progresję cyklu komórkowego, wzmożoną proliferację i indukcję dalszych zmian prowadzących do transformacji komórek. Z drugiej strony, może powodować zmiany wrażliwości komórek na czynniki zewnętrzne, takie jak związki cytotoksyczne i kompleksy metali, w związku z tym, że podczas długotrwałego stresu oksydacyjnego następuje zużycie mechanizmów adaptacyjnych [5,9,46]. Co więcej, zastosowanie chemioterapeutyków charakteryzujących się zwiększonym generowaniem ROS, a nawet hamowaniem wydajności systemu antyoksydacyjnego prowadzi do przekroczenia poziomu granicznego, powyżej którego dochodzi do aktywacji szlaków sygnałowych związanych ze stresem oksydacyjnym. Ich uruchomienie w ostateczności kieruje komórki na szlak programowanej śmierci [9,46]. Rys. 4 Podstawy strategii wykorzystującej stres oksydacyjny w terapiach przeciwnowotworowych [9,46]. Zgodnie z danymi literaturowymi, w odpowiedzi na wytwarzanie ROS i indukcję stresu oksydacyjnego aktywowanych jest wiele szlaków sygnałowych. Najważniejszym z nich jest proapoptotyczna ścieżka sygnalizacyjna zależna od kinaz. Aktywacja kaskady sygnałowej związanej z kinazami białkowymi ma kluczowe znaczenie w wykryciu stresu oksydacyjnego, a następnie uruchomieniu procesu transdukcji sygnałów, inicjujących reakcję komórkową. Kluczowe regulatory, które są aktywowane przez ROS obejmują kinazy białkowe aktywowane mitogenami (MAPK), kinazę 1 sygnalizującą apoptozę (ASK1), p38 i kinazy JNK [27]. Aktywowane kinazy przeważnie indukują apoptozę poprzez mechanizmy, które zachodzą w mitochondriach i związane są z uwolnieniem cytochromu C, a następnie aktywację kaspaz -3, -7 i -9 [49]. Alternatywnie, z mitochondriów do cytozolu mogą być uwalniane inne czynniki takie jak, czynnik wywołujący apoptozę AIF i endonukleaza - Endo G, które wywołują apoptozę niezależnie od aktywacji kaskady kaspaz [50]. Białka uwolnione do cytozolu ulegają translokacji do jądra komórkowego, gdzie zaangażowane są 8

w procesy fragmentacji DNA (duże fragmenty - 50 tysięcy par zasad) i kondensacji chromatyny [51]. 4. Rola jonów żelaza i miedzi w utrzymaniu homeostazy komórkowej Metale przejściowe, takie jak żelazo i miedź odgrywają kluczową rolę w regulacji komórkowego metabolizmu. Żelazo jest niezbędne do prawidłowego przebiegu procesów wzrostu i proliferacji komórkowej, bowiem zaangażowane jest w szereg istotnych procesów, takich jak oddychanie komórkowe, transport tlenu, syntezę hemu i DNA oraz produkcję energii ATP [52]. W układach biologicznych żelazo może występować na dwóch stopniach utleniania Fe 2+ i Fe 3+. Dzięki temu posiada zdolność do przyjmowania i oddawania elektronów, co warunkuje jego dużą reaktywność, a zarazem tłumaczy funkcje jako kofaktora dla wielu enzymów redoks [53]. Istotnym faktem jest również możliwość tworzenia z tym metalem, redoks-aktywnych kompleksów, które mogą generować reaktywne formy tlenu, co w konsekwencji przyczynia się do powstawania stresu oksydacyjnego [54][55]. Zaburzenie homeostazy żelaza w komórce wywołuje wiele efektów, między innymi zatrzymanie cyklu komórkowego czy hamowanie aktywności enzymu RR. Enzym ten składa się z dwóch podjednostek białkowych - R1 i R2, przy czym aktywność katalityczną RR warunkuje podjednostka R2, która jest zależna od jonów Fe 2+ [42]. Ponadto, wiązanie żelaza występującego w puli labilnego żelaza (LIP, ang. labile iron pool), pozbawia komórki składnika niezbędnego do proliferacji. Jest to szczególnie ważne w przypadku komórek nowotworowych, które w wyniku szybkiego wzrostu i namnażania, wykazują zwiększone zapotrzebowanie na ten pierwiastek [56]. Komórki nowotworowe są też bardziej wrażliwe na zmiany poziomu żelaza, realizując zwiększoną podaż pierwiastka poprzez wysoką ekspresję transferyny (TfR), a także większą liczbę receptorów transferyny na powierzchni komórek [57][58]. Miedź natomiast, odgrywa kluczową rolę przy detoksykacji reaktywnych form tlenu przez dysmutazę ponadtlenkową [59]. W układach biologicznych miedź, podobnie jak żelazo, może występować na dwóch stopniach utlenienia Cu + i Cu 2+ [36,59]. Nadmiar miedzi może sprzyjać uszkodzeniu molekuł i struktur komórkowych, głównie przez powstawanie anionorodnika ponadtlenkowego. Zgodnie z danymi literaturowymi, pierwiastek ten może wywoływać stres oksydacyjny na podstawie dwóch mechanizmów [60]. Pierwszy z nich polega na reakcji Fentona, a drugi na redukcji puli komórkowego glutationu [60,61]. Bowiem tiol ten może hamować aktywność katalityczną miedzi poprzez jej chelatację, utrzymując ją w stanie stabilnym, wykluczającym udział w reakcjach redoks [60]. 5. Chelatory metali w terapiach przeciwnowotworowych Rozwój badań nad chelatorami żelaza jako środkami terapeutycznymi dotychczas skupiał się głównie na ich zastosowaniu w leczeniu zaburzeń gospodarki żelazem. Jednakże związki te, 9

ze względu na swoje interesujące właściwości mogą być niezwykle skutecznymi chemioterapeutykami w leczeniu chorób nowotworowych [62,63]. Związki te posiadają zdolność do wiązania i wychwytywania jonów metali z komórki zaburzając jej metabolizm i prowadząc do zatrzymania procesów proliferacji i wzrostu guza. Z drugiej strony, kompleksy tworzące się z żelazem, również mogą brać udział w reakcjach redoks. Tym samym warunkują właściwości cytotoksyczne i wywołanie stresu oksydacyjnego, który prowadzi do uszkodzeń struktur komórkowych i śmierci komórek [55,62]. Dla wystąpienia takiej aktywności, w strukturze chelatorów szczególnie istotne jest występowanie miękkich atomów donorowych, takich jak azot czy siarka, które pełnią kluczową rolę w tworzeniu redoks-aktywnych kompleksów [64]. W przeciwieństwie do chelatorów, które w swojej strukturze posiadają twarde atomy, jak tlen, który gwarantuje zwiększenie powinowactwa do żelaza, jednak tym samym zmniejszenie ich aktywności biologicznej [64,65]. Jednym z najważniejszych środków chelatujących jony metali jest 8-hydroksychinolina (8-HQ). Fragment ten jest również najczęściej występującym heterocyklicznym farmakoforem, który stanowi doskonałe rusztowanie dla związków o szerokim spektrum działania i zastosowań farmaceutycznych [15,66]. 8-HQ z powodzeniem może być wykorzystywana do projektowania chemioterapeutyków wykorzystywanych w leczeniu zakażeń grzybiczych, pasożytniczych, a także chorób neurodegeneracyjnych i nowotworowych [15]. Dane literaturowe wskazują na kilka możliwych mechanizmów działania 8-HQ w komórkach nowotworowych. Związki oparte o fragment 8-HQ mogą oddziaływać z tiolami i białkami, wywołując zmiany ekspresji różnych genów związanych ze stresem oksydacyjnym, indukując odpowiedź cytotoksyczną [67]. Ponadto, 8-HQ podobnie jak wiele związków aromatycznych może interkalować pomiędzy zasady DNA, co powoduje zmiany konformacyjne, które ostatecznie prowadzą do pęknięć nici DNA [15]. Z uwagi na takie możliwości, 8-hydroksychinolina jest obecnie uznawana za uprzywilejowany fragment molekularny (ang. privileged structure), a więc taki, który z definicji, może wywoływać skutki biologiczne częściej niż inne struktury [68]. Projektowanie nowych leków w oparciu o koncepcję uprzywilejowanych fragmentów wydaje się skutecznym narzędziem w poszukiwaniu nowych aktywnych bioefektorów. W Zakładzie Chemii Organicznej Uniwersytetu Śląskiego od lat syntezowane są związki w oparciu o fragment 8-hydroksychinoliny, należą do nich m.in. tiosemikarbazony. Tiosemikarbazony (TSC) są klasą związków znaną od 1950 roku. Charakteryzują się one szerokim spektrum aktywności biologicznej, włączając w to działanie przeciwwirusowe, przeciwbakteryjne oraz przeciwnowotworowe [13]. TSC swoje doskonałe właściwości antyproliferacyjne najprawdopodobniej zawdzięczają zdolności do chelatowania jonów metali i generowania ROS [13]. Jednakże dokładny mechanizm ich działania nie jest jeszcze w pełni wyjaśniony. Postulowanych jest kilka innych mechanizmów, do których należą: eliminacja żelaza z wnętrza komórki lub blokowanie jego wychwytu z przestrzeni międzykomórkowej, hamowanie aktywności RR oraz wywołanie nadekspresji genu Ndrg1 (ang. N-myc downstream regulated gene 1) [69][70]. 10

Dotychczas zsyntezowane pochodne tiosemikarbazonu w Zakładzie Chemii Organicznej Uniwersytetu Śląskiego, charakteryzują się wysoką aktywnością antyproliferacyjną wobec komórek raka jelita grubego. Wiele z nich hamuje wzrost komórek nowotworowych w stężeniach nanomolowych (Tabela 1). Na szczególne uznanie zasługuje pochodna ketonu dipirydylowego (MS154), która wykazuje najwyższą dotychczas opisaną w literaturze aktywność antyproliferacyjną wobec tej linii komórkowej [64]. Tabela 1. Przykłady aktywności antyproliferacyjnej wybranych pochodnych tiosemikarbazonu wobec linii ludzkiego raka jelita grubego (HCT116 +/+ - typ dziki) oraz komórek prawidłowych; ludzkich fibroblastów (NHDF). Nazwa Struktura Aktywność IC 50 [µm] HCT116 p53 +/+ NHDF MS154 0,00081± 0,00013 0, 00173± 0,00071 MS199 0,00206± 0,00088 0,16±0,04 MS1 0,00298± 0,00018 11,07±4,31 MS168 0,00384± 0,00146 10,64±3,48 MS2 0,01069± 0,00112 10,58±4,07 MS200 0,0378± 0,00305 0,01385± 0,00003 MS181 0,0505± 0,0281 12,14± 3,58 11

Reasumując, różnorodny mechanizm działania TSC oraz wysoka aktywność czyni je szczególnie interesującymi związkami do dalszych badań i wykorzystania w rozmaitych terapiach przeciwnowotworowych. Kolejną klasą związków o ciekawych właściwościach są glikokoniugaty prostych pochodnych chinoliny. Wyniki dotychczasowych badań nad tymi związkami wskazują na ich znaczący potencjał jako leków przeciwnowotworowych, ze względu na wykorzystanie specyficznych cech charakteryzujących te komórki, m. in. zwiększonej ekspresji β-glukozydaz, transporterów glukozy (GLUT), a także zwiększonego zapotrzebowania na jony metali [71,72]. Ponadto wprowadzenie ugrupowania cukrowego ma za zadanie poprawić biodostępność związków, a także ich parametrów farmakokinetycznych, które pozwalają na lepsze przenikanie związków do wnętrza komórki [72]. Przykładem może być glikokoniugacja z hydroksypirydonem, która prowadzi do powstania aktywnego proleku przeciwko chorobie Alzheimera, który dodatkowo charakteryzuje się dobrą przenikalnością przez barierę krew-mózg [73]. Ponadto połączenie pierścienia cukrowego z pochodną 8-hydroksychinoliny może prowadzić do otrzymania nowych wysoce specyficznych, a zarazem selektywnych związków względem komórek nowotworowych (Rys. 5) [74]. Rys. 5 Glikokoniugaty oparte o fragment 8-hydroksychinoliny [71]. Co ciekawe, zastosowanie strategii opartych na glikokoniugacji, może skutkować polepszeniem właściwości biologicznych związków. Przykładem może być połączenie dwóch 12

nieaktywnych fragmentów ugrupowaniem cukrowym, które prowadzi do otrzymania związków o dobrych właściwościach przeciwnowotworowych [16]. Do pełnego zrozumienia tych efektów konieczne są jednak dalsze intensywne badania, w tym określenie możliwych mechanizmów działania tej klasy związków. Wyniki tych prac są kluczowe zarówno z punktu widzenia projektowania nowych struktur, jak i poznania możliwych skutków ubocznych czy, interakcji z innymi lekami. 13

III. Cel i zakres pracy Celem niniejszej pracy jest poszukiwanie nowych chelatorów metali o potencjalnych właściwościach antyproliferacyjnych. Ponadto dla aktywnych pochodnych wyjaśnienie molekularnego mechanizmu działania. Obiektem zainteresowania są nowe pochodne tiosemikarbazonu, a także glikokoniugaty oparte na fragmencie 8-hydroksychinoliny. W ramach pracy zostaną przeprowadzone oznaczenia cytotoksyczności in vitro na nowotworowych liniach komórkowych, m.in. ludzkiego raka jelita grubego, raka piersi i glejaków. W przypadku aktywnych związków przewiduje się przeprowadzenie oznaczeń cytotoksyczności względem komórek prawidłowych fibroblastów, celem charakterystyki selektywności badanych pochodnych. Ocena zaangażowania wybranych pochodnych TSC i glikokoniugatów w indukcję stresu oksydacyjnego będzie się opierać na oznaczeniu poziomu generowania reaktywnych form tlenu, a także wpływać na stężenie wewnątrzkomórkowego glutationu. Ponadto dla aktywnych pochodnych przewiduje się przeprowadzenie badań mających na celu wyjaśnienie mechanizmów działania związanych z zatrzymaniem cyklu komórkowego oraz wywołaniem apoptozy. Określenie zmian ekspresji wybranych genów i białek związanych z tymi szlakami sygnalizacyjnymi zostanie przeprowadzone przy pomocy metod Real-Time PCR oraz Western Blot. Ponadto, aktywne pochodne tiosemikarbazonu zostaną zbadane pod kątem użyteczności w terapiach kombinowanych z innymi chemioterapeutykami, a także fotouczulaczami z grupy chloryn w terapii fotodynamicznej (PDT). 14

IV. Badania własne 1. Tiosemikarbazony 1.1. Oznaczenia cytotoksyczności in vitro Obiektem badań w niniejszej pracy były nowe pochodne tiosemikarbazonu zsyntezowane przez mgr Martę Rejmund w ramach prowadzonych badań do rozprawy doktorskiej w Zakładzie Chemii Organicznej Uniwersytetu Śląskiego. Ponadto do analizy mechanizmów działania wymienionej klasy związków, wytypowano szereg najaktywniejszych pochodnych tiosemikarbazonu, które zostały zsyntezowane przez dr inż. Macieja Serdę (Tabela 1) w ramach pracy doktorskiej [75]. Oznaczenia cytotoksyczności wykonano testem MTS względem komórek raka jelita grubego linii HCT116 typu dzikiego (HCT 116 p53 +/+ ), a także komórek HCT116 z nokautem genu TP53 (HCT116 p53 -/- ). Wybór tych linii jest uwarunkowany różnymi poziomami ekspresji ferrytyny białka kompleksującego jony żelaza Fe 3+, zależnego od obecności białka p53 [76]. Ponadto selektywność wybranych aktywnych pochodnych TSC badano względem prawidłowych komórek ludzkich fibroblastów linii NHDF. Test MTS jest kalorymetryczną metodą detekcji proliferujących komórek. Opiera się on na zdolności enzymu dehydrogenazy mitochondrialnej do przekształcania pomarańczowej soli tetrazolowej (MTS) do formazanu. Ilość powstającego w reakcji produktu jest oznaczana spektrofotometrycznie oraz proporcjonalna do ilości żywych komórek. Na tej podstawie, możliwe jest wyliczenie wartości IC50, czyli stężenia które powoduje 50% zahamowanie wzrostu populacji komórek. Rys. 7 Reakcji przekształcenia pomarańczowej soli tetrazolowej (MTS) do barwnego formazanu. Dotychczas w ramach niniejszej pracy przebadano 130 nowych pochodnych tiosemikarbazonu. W poniższej tabeli 2 przedstawiono aktywność biologiczną dla wybranych 50 pochodnych. Na szczególną uwagę zasługują związki aktywne, oparte o fragmenty chinoliny, chinoksaliny, ketonu di-2-pirydylowego, pirydyno-2-karboksyaldehydu, 3-aminopirydyno-karboksyaldehydu oraz 6-bromo-3-hydroksypirydyno-karboksyaldehydu. Tabela 2 przedstawiają aktywność biologiczną poszczególnych grup pochodnych tiosemikarbazonu. 15

Tabela 2. Aktywność biologiczna szeregu pochodnych TSC. Nazwa Struktura Aktywność IC 50 [µm] HCT116 HCT116 p53 +/+ p53 -/- NHDF MR12K 0,1068 ± 0,0427 0,0967± 0,0048 0,2128± 0,0173 MR29 21,97± 3,96 MR34 18,31± 0,92 0,4258± 0,0337 5,848± 0,4505 >25 13,06± 1,9 MR3K3 1,100 ± 0,3345 0,0650± 0,0041 0,2825± 0,0502 MR5K3 0,2816 ± 0,0542 0,0696± 0,0015 0,1144± 0,0103 MR95 0,1393 ± 0,0131 0,0663± 0,0186 12,09± 0,61 MR96 0,1876± 0,0558 0,1377± 0,0499 16,66± 5,57 MR97 0,1596 ± 0,0535 0,1541± 0,0631 14,74± 0,79 MR9K2 0,1783± 0,0151 0,2221± 0,0185 17,13± 0,76 MR4K4 1,064 ± 0,1442 0,2934± 0,0790 - MR6K2 5,468± 1,192 6,267± 1,95 - MR18 0,3105 ± 0,0560 0,01538± 0,0040 12,87± 0,99 MR19 0,3086± 0,0579 0,1440± 0,0183 >25 16

MR21 0,8447 ± 0,1944 0,1818± 0,0263 10,3 ± 1,074 MR31 0,4432± 0,1388 0,0185± 0,00304 12,32± 0,37 MR48 7,210 ± 1,9985 0,2292± 0,0788 >25 MR49 0,1718 ± 0,0542 0,0138± 0,0038 >25 MR50 0,3777 ± 0,1197 0,01017± 0,0031 13,28± 0,56 MR160 0,1628 ± 0,0494 0,1518 ± 0,07441 >25 MR166 1,328 ± 0,209 0,1847 ± 0,0881 >25 MR167 0,252 ±0,0928 0,1277 ±0,0115 >25 MR169 1,139± 0,5336 0,7461± 0,354 >25 MR170 1,457 ± 0,195 0,5294± 0,03895 >25 MR171 0,6439 ± 0,1366 1,106± 0,4404 >25 MR172 1,856 ±0,73 2,121 ±0,9185 >25 MR174 0,1052 ±0,0097 0,1234 ±0,0612 25,23± 2,57 MR193 0,5423 ± 0,0427 0,1388 ± 0,0196-17

MR203 0,2266 ± 0,0147 0,4778 ± 0,0325 - MR36 7,986± 1,724 2,598± 0,334 15,62± 0,92 MR37 4,380± 1,971 1,726± 0,6265 12,07 ± 2,834 MR38 13,16± 1,535 6,00± 0,395 21,51± 3,02 MR39 6,568± 4,56 2,973 ±1,414 17,03 ± 3,755 MR45 5,298± 1,333 1,405± 0,4225 >25 MR46 19,24± 2,94 7,756± 1,568 >25 MR47 8,032± 1,227 2,253± 0,8715 19,93± 2,81 MR90 4,76± 0,78 1,92± 0,31 14,48± 0,79 MR91 4,00± 0,62 3,37± 0,60 >25 MR92 4,58± 0,45 2,26± 0,49 18,53 ± 5,2 MR93 5,38± 0,63 3,25± 0,53 >25 MR94 9,56± 1,09 3,56± 0,17 >25 MR99 >25 11,69± 3,71 >25 18

MR100 20,96± 2,95 19,35± 3,15 >25 MR104 24,79± 0,203 8,953± 4,964 >25 MR71 >25 >25 - MR83 >25 >25 - MR103 >25 >25 - MR114 >25 15,83± 7,6205 - MR121 >25 >25 - MR130 >25 >25 - MR122 >25 >25 - Analiza wyników dla poszczególnych grup TSC, ujawniła, że pochodne zbudowane na fragmencie chinoliny czy ketonów pirydynowych, charakteryzują się wysoką aktywnością biologiczną. Spośród badanych pochodnych tiosemikarbazonu najbardziej aktywnym związkiem okazał się MR12K, którego struktura oparta jest na fragmencie chinoliny. Wyliczona wartość IC50, to jest wartość przy jakiej następuje 50% zahamowanie wzrostu komórek HCT116 p53 +/+ wynosiła 0,10 μm. Podobnie, kolejne dwie pochodne MR95 oraz MR96 oparte na fragmencie chinoliny wraz z grupą trifluorometylową dołączoną do pierścienia fenylowego charakteryzowały się bardzo dobrą aktywnością antyproliferacyjną wobec komórek HCT116 p53 +/+. Wyliczone wartości IC50 wynosiły odpowiednio 0,13 μm i 0,18 μm. Ponadto, dla obu pochodnych obserwowano swoistość względem linii HCT116 p53 -/- oraz wysoką selektywność wobec komórek rakowych. Szczególnie, dla analogu MR95 aktywność wobec linii z unieczynnionym genem TP53 była 2-krotnie wyższa i wynosiła 0,06 μm. Odmienną sytuację obserwowano w przypadku pochodnej MR12K. Istotny na to wpływ może mieć podstawienie pierścienia fenylowego atomem chloru, co prowadzi do utraty swoistości wobec linii komórkowej z nokautem genu TP53, a także 19

skutkuje brakiem toksyczności wobec komórek prawidłowych fibroblastów. Dodatkowo, w przypadku analogu MR97 zastąpienie grupy trifluorometylowej poprzez podstawienie pierścienia fenylowego dwoma atomami chloru skutkowało brakiem swoistości wobec komórek HCT116 p53 -/-. Z kolei, podstawnik benzonitrylowy lub 4-metylo-tiomorfolinowy wyraźnie zmniejsza aktywność wobec komórek HCT116 p53 +/+. Szczególnie, ciekawym związkiem wydaje się MR29, który wykazuje słabą aktywność wobec linii HCT116 typu dzikiego, wartość IC50 wynosiła 22 μm. Ponadto, pochodna ta nie wykazuje aktywności względem prawidłowych fibroblastów. Jednakże, wobec linii z unieczynnionym białkiem p53, aktywność MR29 była 58-krotnie wyższa i wynosiła 0,43 μm. Odmienną sytuację obserwowano w grupie pochodnych TSC opartych na ketonie di-2-pirydylowym, pochodna MR31 z dołączonym fragmentem benzonitrylu charakteryzowała się dobrą aktywnością antyproliferacyjną wobec komórek nowotworowych linii HCT116 p53 +/+, a wartość IC50 wynosiła 0,4 μm. Ponadto, pochodna ta wobec linii HCT116 p53 -/- wykazywała wysoką swoistość, wartość IC50 wynosiła 0,02 μm. Natomiast wśród pochodnych, których struktura oparta jest na fragmencie ketonu di-2-pirydylowego, najbardziej aktywnym analogiem okazał się MR18, zawierający dołączone dwa atomy chloru do pierścienia fenylowego. Potwierdziło to wcześniejsze obserwacje, iż obecność atomów halogenu powoduje zwiększenie aktywności biologicznej. Związek ten wykazuje interesujące właściwości względem komórek zmutowanych, bowiem wartość IC50 dla linii HCT116 p53 +/+ wynosiła 0,31 μm, natomiast dla linii z nieaktywnym białkiem p53 aktywność była 20-krotnie wyższa. Z kolei, dla dużej grupy pochodnych opartych na fragmencie 3-aminopirydynokarboksyaldehydu, najbardziej aktywnym związkiem okazał się MR174, który w swojej strukturze zawierał grupę 3-fluorometylową. Co ciekawe, drugim najaktywniejszym związkiem, okazał się MR203, który do pierścienia piperazynowego miał dołączony difenyloetan. Dodatkowo pochodna ta nie wykazała swoistości wobec linii HCT116 p53 -/-. Wśród grupy pochodnych opartych o pirydyno-2-karboksyaldehyd, związkami o interesujących właściwościach okazały się MR49 oraz MR50. Pierwszy z nich, zawierał atom fluoru, który warunkował wysoką aktywność biologiczną wobec komórek HCT116 p53 +/+, a także wysoką swoistość (aktywność 13-krotnie wyższa) wobec komórek zmutowanych. Pochodna MR49 charakteryzowała się także brakiem toksyczności wobec komórek prawidłowych. Natomiast pochodna MR50 z dołączoną grupą nitrową do pierścienia fenolowego wykazywała wyższą swoistość (aktywność 37-krotnie wyższa) od MR49. Dalsza analiza poszczególnych grup pochodnych TSC, ujawniła, że wprowadzenie do pierścienia chinolinowego atomu azotu w pozycji 4 skutkuje spadkiem aktywności biologicznej (np. MR4K4 oraz MR6K2). Podobnie, dołączenie atomów bromu lub grupy hydroksylowej do pierścienia pirydylowego powoduje znaczne zmniejszenie aktywności. Przykładem mogą być pochodne posiadające w swojej strukturze atomy halogenów lub grupę 3-fluorometylową, jak MR90 i MR93, wykazujące aktywność rzędu 5 μm. 20

Ponadto przebadano szereg pochodnych TSC opartych na fragmentach: fenolu, 2-fluorobenzaldehydu, 3,5-difluorobenzaldehydu oraz 3,6-difluorobenzaldehydu. Jednakże, żadna z powyższych pochodnych nie wykazywała aktywności biologicznej wobec komórek nowotworowych raka jelita grubego. Analiza selektywności przebadanych pochodnych TSC wykazała, że większość związków, za wyjątkiem MR12K, MR3K3, MR5K3 wykazuje słabą bądź umiarkowaną aktywność wobec linii prawidłowych komórek typu fibroblastów. Podsumowując, pochodne TSC zawierające grupę trifluorometylową dołączoną do pierścienia fenylowego charakteryzują się najwyższą aktywnością biologiczną wobec komórek nowotworowych HCT116. Zgodnie z danymi literaturowymi, zależność ta może być podyktowana obecnością atomu fluoru, który ulepszając parametry fizykochemiczne związku, zwiększa aktywność antyproliferacyjną, a także powinowactwo do docelowych cząsteczek. Fluor może także wpływać na przepuszczalność błony komórkowej [77]. Dodatkowo, związki zawierające atomy halogenowe w pierścieniu fenylowym charakteryzują się większą aktywnością antyproliferacyjną wobec komórek nowotworowych z nokautem genu TP53. Możliwym wyjaśnieniem tego zjawiska, może być indukcja kaskady kaspaz i śmierci komórkowej niezależnej od białka p53, tak jak w przypadku styrylochinolin [78] 1.2. Generowanie reaktywnych form tlenu i wpływ na poziom glutationu W celu zbadania możliwości generowania ROS przez pochodne tiosemikarbazonu przeprowadzono test fluorescencyjny. W teście wykorzystano odczynnik CellROX Green, który pod wpływem reaktywnych form tlenu utlenia się do fotostabilnego produktu, emitującego jasno-zieloną fluorescencję. Maksimum absorpcji barwnika wynosi 485 nm, podczas gdy emisja jest obserwowana przy długości fali 520 nm. Test ten został przeprowadzony dla najbardziej aktywnych pochodnych zsyntezowanych przez dr inż. M. Serdę (Tabela 1.). Obserwacja mikroskopowa, potwierdziła znaczące generowanie ilości ROS po traktowaniu aktywnymi pochodnymi, o czym świadczy intensywna zielona fluorescencja (Fig. 1). Obserwowany sygnał punktowy skupiał się przede wszystkim wokół mitochondriów żywych komórek. Co więcej, dla grupy kontrolnej - komórek nietraktowanych TSC obserwowano niewielki sygnał fluorescencyjny wynikający z autofluorescencji struktur komórkowych, a nie produkcji ROS. 21

Fig. 1 Powstawanie ROS w komórkach HCT116 p53 +/+ po 24h inkubacji z TSC oraz 15 minutowej inkubacji z nadtlenkiem wodoru (kontrola pozytywna). Negatywną kontrolę stanowiły komórki nietraktowane. Skala = 50μm. Dodatkowo, przeprowadzono eksperymenty opierające się na ilościowej analizie poziomu generowanych reaktywnych form tlenu oraz glutationu w czasie pomiaru kinetycznego. Określenie poziomu stężenia zredukowanego GSH było możliwe, dzięki wykorzystaniu luminescencyjnego testu GSH-Glo Glutathione Assay. Pojawienie się sygnału luminescencyjnego odpowiadającego ilości GSH w próbce było wynikiem sprzężonej reakcji konwersji pochodnych lucyferyny do lucyferyny, katalizowanej przez S-transferazy glutationu (GST), gdzie produkt był utleniany przez tlen cząsteczkowy oraz enzym lucyferazę (Rys. 7). Powyższe analizy prowadzono w czytniku płytek wielodołkowych. LUMINESCENCJA Rys. 7 Reakcja konwersji pochodnych lucyferyny do lucyferyny katalizowanej przez S-transferazy glutationu. W ten sposób możliwe było określenie wpływu ROS na poziom jednego z głównych przeciwutleniaczy w komórce. Wyniki dla wybranych pochodnych o kodowaniu MS przedstawiono na wykresach 1 oraz 2. Związkiem referencyjnym w tych oznaczeniach była doksorubicyna (DOX), która zgodnie z danymi literaturowymi może indukować apoptozę poprzez generowanie reaktywnych form tlenu oraz oddziaływanie z endogennymi przeciwutleniaczami [79]. Szczegółowa analiza danych wykazała, iż pierwszy silny wzrost ilości produkcji ROS odnotowano w 6h od podania badanych pochodnych tiosemikarbazonu 22

oraz związku referencyjnego. Podobnie, zwiększenie stężenia ilości ROS odnotowano w 24h od aplikacji MS168, MS181, MS200, DOX oraz w 24h i 30h dla MS154 (Wykres 1). Wykres 1. Wpływ TSC i DOX na poziom generowanych reaktywnych form tlenu w komórkach HCT116 p53 +/+. Dane znormalizowano wobec nietraktowanych komórek (kontrola). Zmniejszenie poziomu zredukowanego glutationu obserwowano już po 3 godzinach od podania badanych chelatorów. Wyniki, te mogą sugerować, iż tiosemikarbazony mogą wpływać na spadek stężenia GSH niezależnie od poziomu stężenia reaktywnych form tlenu. Wyniki takie zgodne są z danymi literaturowymi wskazującymi że zubożenie glutationu może prowadzić do indukcji apoptozy komórek nowotworowych, niezależnie od generowania ROS [80]. Z drugiej strony, największy spadek ilości GSH obserwowano po 9h, 24h i 30h inkubacji od zaaplikowania pochodnych MS154 i MS168 oraz po 9 godzinnej inkubacji z MS200 (Wykres 2). Można, więc wnioskować iż, zjawisko to, może być dodatkowym wynikiem oddziaływania generowanych ROS z glutationem. W związku z tym, postępujący 23

wypływ glutationu z komórki oraz nasilenie stresu oksydacyjnego, może prowadzić do indukcji wielu uszkodzeń, w tym mitochondrium, a w ostateczności całej komórki. Wykres 2. Wpływ TSC i DOX na poziom wewnątrzkomórkowego GSH w komórkach HCT116 p53 +/+. Dane znormalizowano wobec nietraktowanych komórek (kontrola). 1.3. Peroksydacja lipidów Jednymi z uszkodzeń komórkowych wywołanych działaniem ROS są produkty peroksydacji lipidów. Utworzone wielonienasycone kwasy tłuszczowe (PUFA) po ataku ROS, mogą prowadzić do uszkodzeń strukturalnych i funkcjonalnych błon komórkowych, w tym mitochondrialnych [81]. W celu zbadania wpływu TSC na procesy utleniania przeprowadzono pomiary intensywności powstającego produktu reakcji malonylodialdehydu (MDA) z kwasem 2-tiobarbiturowym (TBARS). Analiza wyników 24

wykazała, że pochodne TSC mogą inicjować proces peroksydacji lipidów błonowych (Wykres 3). Szczególnie, w przypadku pochodnej MS154 widoczny jest ok. 1,5 krotny wzrost malonylodialdehydu w porównaniu z komórkami nietraktowanymi. Co ciekawe, powstające addukty MDA mogą odgrywać dalszą rolę w progresji śmierci komórkowej. Albowiem malonylodialdehyd może wchodzić w reakcje z białkami wytwarzając pochodne karbonylowe białek, a także z DNA prowadząc do wielu uszkodzeń helisy, a w konsekwencji do hamowania procesów replikacji oraz transkrypcji DNA [81]. Wykres 3. Wpływ tiosemikarbazonów na proces peroksydacji lipidów w komórkach HCT116 p53 +/+. Dane znormalizowano wobec nietraktowanych komórek (kontrola). 2. Glikokoniugaty 2.1. Cytotoksyczność in vitro W niniejszej pracy badania przeprowadzono także na szeregu glikokoniugatów, które zostały zaprojektowane i zsyntezowane w ramach współpracy z zespołem dr Gabrieli Pastuch- Gawołek z Politechniki Śląskiej w Gliwicach. Główną ideą glikokoniugacji było połączenie pochodnych chinoliny o dobrych parametrach do chelatowania metali, ale słabej farmakokinetyce z fragmentem cukrowym: D-glukozy lub D-galaktozy. Takie połączenia stosowane są często dla poprawy biodostępności substancji ksenobiotycznych, w szczególności w projektowaniu proleków. W rezultacie połączenie dwóch nieaktywnych fragmentów, doprowadziło do otrzymania związków o umiarkowanej lub dobrej aktywności antyproliferacyjnej. Do oznaczeń cytotoksyczności wybrano komórki raka jelita grubego, ze względu na podwyższoną ekspresję transporterów glukozy GLUT [82]. Podobnie, jak w przypadku poprzedniej klasy związków, w celu określenia aktywności biologicznej glikokoniugatów przeprowadzono testy cytotoksyczności - MTS na liniach komórkowych HCT116 p53 +/+ (typ dziki) oraz HCT116 p53 -/- z nokautem genu TP53. Ponadto selektywność wybranych pochodnych badano na liniach prawidłowych komórek ludzkich fibroblastów NHDF. Tabela 3 przedstawia aktywność biologiczną zsyntezowanych nowych pochodnych GC. 25

Tabela 3. Aktywność biologiczna substratów (1-13) i szeregu glikokoniugatów (17-25). *Najwyższe możliwe zbadane stężenie. Nazwa 1 Struktura OH HOOC N HCT116 p53 +/+ Aktywność IC 50 [µm] HCT116 p53 -/- NHDF >750* >750* - 2 N HOOC >750* >750* - OH 3 >450* >300* - 6 >750* >500* - 10 >150* >150* - 11 >150* >150* - 12 >150* >150* - 13 >150* >150* - OAc 14 AcO AcO O H N OAc O OH N CH 3 13.59 1.43 15.09 2.92 23.61±0.68 15 11.59 1.27 11.68 1.61 18.59±0.28 16 >750* >750* - OAc 17 AcO AcO O S OAc O OH N CH 3 >25 >25 - AcO OAc 18 AcO O S OAc O OH N CH 3 >25 >25-19 >25 >25-26

20 >25 >25-21 >25 >25-22 12.04 4.14 10.65 1.90 12.39±0.61 AcO OAc 23 AcO O S OAc H N O OH N CH 3 12.59 4.03 8.94 0.89 13.27±1.09 AcO OAc 24 AcO O S OAc H N N N CH 3 O OH 7.86 1.04 7.05 1.19 9.32±0.74 25 4.88 0.98 4.42 0.67 11.48±0.14 Zarówno substraty pochodnych kwasu hydroksy-metylochinolino-karboksylowego, fragmenty cukrowe oraz pochodne tetra-o-acetylo-d-glukozy okazały się nieaktywne wobec komórek nowotworowych. Podobny efekt, obserwowano dla związków zawierających fragment tetra-o-acetylo-d-glukozy. Jednakże, wyjątek stanowiły amidy 14 i 15, które wykazywały umiarkowaną aktywnością biologiczną. Ponadto, wprowadzenie łącznika aromatycznego grupy fenylowej lub pirydynowej pomiędzy fragment cukrowy, a pochodną chinoliny prowadziło do znacznego zwiększenia aktywności. Najbardziej aktywnymi glikokoniugatami z całej przebadanej grupy okazały się pochodne 24 i 25, które w swojej strukturze zawierały łącznik pirydynowy. Można, więc wnioskować iż, zastosowanie łącznika pirydynowego w stosunku do fenylowego, ma istotny wpływ na zwiększenie aktywności antyproliferacyjnej. Co więcej, nie stwierdzono różnic aktywności pochodnych, pomiędzy komórkami linii HCT116 p53 +/+ i p53 -/-, co sugeruje, że mechanizm śmierci wywołany działaniem tych związków nie koncentruje się na szlaku apoptotycznym zależnym od białka p53. W związku z tym, w celu wyjaśnienia możliwego mechanizmu działania przeprowadzono dalsze analizy dla aktywnych glikokoniugatów. 2.2. Wpływ jonów metali na proliferację komórek Ze względu na zdolność 8-hydroksychinoliny do chelatowania jonów metali, przeprowadzono analizy określające wpływ jonów miedzi oraz cynku na proliferację komórek linii HCT116 p53 +/+ i p53 -/-. Oznaczenie wykonano przy pomocy testu MTS po traktowaniu komórek aktywnymi pochodnymi w stężeniu IC50, dodatkowo dodając do pożywki sole CuCl2 lub ZnCl2. Otrzymane wyniki, dowodzą, iż badane związki mogą tworzyć kompleksy 27

z aktywnymi metalami. Dla wszystkich pochodnych zaobserwowano wzrost procentu przeżywalności komórek, w obecności jonów cynku, w przeciwieństwie do jonów miedzi, które zwiększały toksyczny efekt związków (Wykres 4). Wykres 4. Wpływ jonów metali na proliferację komórkową po traktowaniu aktywnymi glikokoniugatami. Można, więc wnioskować, iż dodanie jonów cynku może powodować powstawanie nieaktywnych kompleksów z glikokoniugatami. Dodatkowym wyjaśnieniem, może być fakt, iż cynk należy do grupy metali redoks nieaktywnych. Podobną zależność po dodaniu Zn lub Cu, zaobserwowała grupa badaczy pod kierunkiem WQ Dinga dla innych prostych pochodnych chinoliny [83]. Z drugiej strony, dodanie miedzi powinno skutkować utworzeniem redoks-aktywnych kompleksów. Porównując dane dla wszystkich aktywnych glikokoniugatów, dla pochodnej 14 zanotowano największy spadek przeżywalności (50%) komórek dla linii HCT116 p53 +/+. Podobnie, dla pochodnej 25 odnotowano 75% zmniejszenie proliferacji komórek nowotworowych linii HCT116 p53 -/-. Zmiany te, dają się wyjaśnić wysokim powinowactwem pochodnych 8-hydroksychinoliny oraz ich glikokoniugatów do jonów miedzi i tworzeniem aktywnych kompleksów z tymi jonami. W celu potwierdzenia tej hipotezy przeprowadzono pomiary spektrofotometryczne procesu kompleksowania miedzi dla aktywnych związków, uzyskując krzywe izozbestyczne przedstawione na wykresie 5. Absorbancję związku 14 mierzono w obecności jonów Cu w stosunkach 1:1; 2:1; 3:1; 4:1; 5:1 w porównaniu do czystego związku. Analiza uzyskanych widm wykazuje zmiany intensywności absorpcji oraz utworzenie charakterystycznych punktów izozbestycznych. Dla kompleksu miedzi (II) z pochodną 14 obserwowano maksimum absorpcji przy 276 nm oraz trzy punkty izozbestyczne, przy 268, 288 oraz 312 nm. 28

Wykres 5. Krzywe izozbestyczne procesu kompleksowania pochodnej 14 za pomocą CuCl 2. 2.3. Generowanie reaktywnych form tlenu przez glikokoniugaty Jak wspomniano we wstępie, związki chelatujące jony metali, mogą tworzyć z nimi aktywne kompleksy, tworzące w reakcjach Fentona i Habera-Weissa, toksyczne reaktywne formy tlenu. W celu zbadania możliwości generowania ROS przez glikokoniugaty przeprowadzono fluorescencyjny test opierający się na ilościowo-jakościowej analizie. Obserwacja mikroskopowa, potwierdziła znaczne generowanie ilości ROS po traktowaniu aktywnymi pochodnymi, o czym świadczy intensywnie emitowana zielona fluorescencja (Fig. 2). Ponadto, dla pochodnych 14, 15 i 25 obserwowano większą intensywność świecenia, niż w przypadku pochodnych 22, 23, 24 a więc trend zgodny ze względną aktywnością antyproliferacyjną badanych związków. Dokładna analiza zebranych obrazów, pozwala stwierdzić, iż silny sygnał fluorescencyjny skupia się wokół wybranych organelli, prawdopodobnie jąder i mitochondriów. Można, więc wnioskować iż, wytwarzanie reaktywnych form tlenu następuje głównie w mitochondriach, co może korelować ze zmianami poziomu zredukowanego glutationu w komórkach, a także postępującym upośledzeniem funkcji mitochondriów. Fig. 2 Powstawanie ROS w komórkach HCT116 p53 +/+ po 24h inkubacji z glikokoniugatami oraz 15 minutowej inkubacji z nadtlenkiem wodoru (kontrola pozytywna). Negatywną kontrolę stanowiły komórki nietraktowane. Skala = 50μm. 29

2.4. Wpływ reaktywnych form tlenu na glutation oraz indukcję apoptozy W celu określenia wpływu ROS na glutation, przeprowadzono dodatkowo eksperymenty opierające się na kinetycznym pomiarze ilościowym generowanych rodników. Wyniki dla wszystkich pochodnych GC przedstawiono na wykresie 6. Analiza danych, potwierdziła produkcję ROS przez glikokoniugaty 14, 15 i 25. Najwyższy wzrost ROS odnotowano w 6h i 12h od aplikacji pochodnych 14 i 15 oraz w 12h dla pochodnej 25. Wyniki te korelują z najwyższym spadkiem poziomu zredukowanego glutationu (GSH) w komórkach HCT116 p53 +/+ po 12h traktowaniu powyższymi pochodnymi. Otrzymana zależność wskazuje na wystąpienie odpowiedzi komórkowej na powstały stres oksydacyjny. Ponadto, dla pozostałych badanych pochodnych nie obserwowano znaczących różnic w generowaniu reaktywnych form tlenu. Z drugiej strony, pomiary zredukowanego GSH wykazały spadki poziomu tego tripeptydu, po 12 godzinnej inkubacji z badanymi związkami. Uzyskane wyniki dla pochodnych GC wskazują, że zmiany poziomu GSH mogą być wywołane niezależnie od generowania reaktywnych form tlenu, tak jak w przypadku TSC. Ponadto, GSH może indukować apoptozę poprzez aktywację zewnętrznych lub wewnętrznych ścieżek sygnalizacyjnych, w których rolę wykonawczą pełni kaspaza -3 [84]. Wykres 6. Wpływ glikokoniugatów na poziom ROS i wewnątrzkomórkowego GSH w komórkach HCT116 p53 +/+. Dane znormalizowano wobec nietraktowanych komórek (kontrola). 30

W celu zbadania, wpływu glikokoniugatów na stopień aktywacji ścieżki apoptotycznej na drodze kaspazy 3/7 w komórkach HCT116 p53 +/+ i p53 -/- przeprowadzono luminescencyjny test. Na podstawie otrzymanych wyników (Wykres 7), można wnioskować, że kaspazy są aktywowane w komórkach HCT116 p53 +/+ po inkubacji z pochodnymi 14 i 23, a także przez pochodną 15 w komórkach obu linii nowotworowych. Otrzymane zależności pozwalają przypuszczać, iż glikokoniugaty indukują apoptozę na drodze zależnej i niezależnej od kaspaz. Podobna zależność, może być obserwowana dla kompleksów 8-HQ z miedzią, które mogą hamować aktywność kaspazy -3 w retikulum endoplazmatycznym, tym samym wymuszając przejście na drogę niezależną od aktywności kaspaz [85,86]. Wykres 7. Aktywność kaspazy 3/7 w komórkach HCT116 p53 +/+ i p53 -/- po 30h i 48h godzinnej inkubacji z aktywnymi glikokoniugatami. Dane znormalizowano wobec nietraktowanych komórek (kontrola). 2.5. Interkalacja DNA Z doniesień literaturowych wynika, że kompleksy metali przejściowych, a także pochodne chinoliny posiadają zdolność do interkalacji DNA, a tym samym powodują uszkodzenie kwasów nukleinowych. Ponadto, zjawisko to może być związane z mechanizmem działania niezależnym od białka p53, jak wykazano dla styrylochinolin [78]. W celu określenia zdolności GC do interkalacji DNA przeprowadzono pomiary spektrofotometryczne, w obecności standardowego DNA pochodzącego z grasicy cielęcej (ang. calf-thymus DNA; CT-DNA), a także samych pochodnych w buforze PBS. Analizując zarejestrowane widma absorpcji związków 14 i 15 oraz 22-25 wykazano zdolność interkalacji do DNA, a wiązało się to ze spadkiem intensywności absorbancji oraz przesunięciem maksimum w kierunku fal dłuższych (przesunięcie ku czerwieni) (Fig. 3). Największe zmiany widm absorpcji obserwowano dla najaktywniejszej pochodnej 25. Inkubacja z CT-DNA ujawniła spadek intensywności absorpcji (efekt hipochromowy) o 41,5%, a także przesunięcie Stokesa wynoszące 5nm (Tabela 4). Ponadto, dobre właściwości interkalacyjne obserwowano dla pochodnych 14, 23 i 24 (spadki intensywności o 16,2%, 17,2% i 26,1%). 31