Załącznik 2 Autoreferat Dr Katarzyna Piwocka Adiunkt Kierownik Pracowni Cytometrii Instytut Biologii Doświadczalnej im. M. Nenckiego PAN w Warszawie Warszawa, 2012
1. Imię i Nazwisko. Katarzyna Piwocka, MSc., PhD. Instytut Biologii Doświadczalnej im. M. Nenckiego PAN Ul. Pasteura 3, 02-093 Warszawa Tel: 22-5892162 Fax: 22-8225342 e-mail: k.piwocka@nencki.gov.pl 2. Posiadane dyplomy, stopnie naukowe/ artystyczne z podaniem nazwy, miejsca i roku ich uzyskania oraz tytułu rozprawy doktorskiej. 2001 stopieo doktora nauk biologicznych, specjalnośd biochemia, Instytut Biologii Doświadczalnej im. M. Nenckiego PAN w Warszawie. Praca doktorska Kurkumina i UVC jako czynniki indukujące różne ścieżki apoptozy w komórkach Jurkat. Promotor - Prof. dr hab. Ewa Sikora Praca uzyskała wyróżnienie Rady Naukowej Instytutu Biologii Doświadczalnej PAN im. M. Nenckiego w Warszawie. 1994 tytuł magistra biologii, specjalnośd mikrobiologia, Uniwersytet Warszawski, Wydział Biologii, Zakład Genetyki Bakterii. Promotor Prof. dr hab. Mirosława Włodarczyk 3. Informacje o dotychczasowym zatrudnieniu w jednostkach naukowych/ artystycznych. Od czerwca 2010 kierownik Pracowni Cytometrii, Instytut Biologii Doświadczalnej im. M. Nenckiego PAN w Warszawie 2004-2010 adiunkt, Pracownia Molekularnych Podstaw Starzenia, Zakład Biochemii, Instytut Biologii Doświadczalnej im. M. Nenckiego PAN w Warszawie 2003-2004 staż podoktorski, Cell Development and Disease Laboratory, kierownik prof. Thomas G. Cotter, BiooSciences Institute, University College Cork, Irlandia 1995-2002 asystent, Zakład Biochemii Komórki, Instytut Biologii Doświadczalnej PAN im. M. Nenckiego w Warszawie 2
4. Wskazanie osiągnięcia* wynikającego z art. 16 ust. 2 ustawy z dnia 14 marca 2003 r. o stopniach naukowych i tytule naukowym oraz o stopniach i tytule w zakresie sztuki (Dz. U. nr 65, poz. 595 ze zm.): * w przypadku, gdy osiągnięciem tym jest praca/ prace wspólne, należy przedstawid oświadczenia wszystkich jej współautorów, określające indywidualny wkład każdego z nich w jej powstanie 4.1. Spis publikacji wchodzących w skład osiągnięcia Tytuł osiągnięcia: Nowe prożyciowe mechanizmy aktywowane przez onkogen BCR-ABL w komórkach przewlekłej białaczki szpikowej, promujące rozwój i progresję choroby oraz opornośd na terapię; poszukiwanie nowych celów i strategii terapeutycznych. Prace oryginalne: 1. Piwocka K #., Vejda S #, Cotter TG, O Sullivan GC, McKenna SL. (2006). Bcr-Abl reduces endoplasmic reticulum releasable calcium levels by a Bcl-2-independent mechanism and inhibits calciumdependent apoptotic signaling. Blood 2006;15;107(10):4003-10. IF 2006: 10,558; 5-letni IF: 10,075; MNiSW: 45; liczba cytowao: 9 # jednorzędni autorzy 2. Wolanin K., Magalska A., Mosieniak G., Klinger R., McKenna S., Vejda S., Sikora E. Piwocka K. (2006). Curcumin affects components of the chromosomal passenger complex and induces mitotic catastrophe in apoptosis-resistant Bcr-Abl-expressing cells. Molecular Cancer Research 2006; 4(7): 457-69; autor korespondujący IF 2006: 4,373; 5-letni IF: 4,746; MNiSW: 35; liczba cytowao: 32 3. O Sullivan-Coyne G., O Sullivan G.C., Piwocka K., McKenna S.L. (2009). Curcumin induces apoptosis-independent death in esophageal cancer cells British Journal of Cancer 2009; 101(9):1585-95. IF 2010: 4,831; 5-letni IF: 4,936; MNiSW: 35; liczba cytowao: 35 4. Wolanin K., Magalaska A., Kusio M., Mosieniak G., Podszywałow-Bartnicka P., Vejda S., McKenna S.L., Sikora E. and Piwocka K. (2010). Expression of oncogenic kinase Bcr-Abl impairs mitotic checkpoint and promotes aberrant divisions and resistance to microtubule-targeting agents. Molecular Cancer Therapeutics 2010 May;9(5):1328-38; autor korespondujący IF 2010: 5,225; 5-letni IF: 5,596; MNiSW: 40; liczba cytowao: 6 5. Kusio-Kobialka M, Wolanin K, Podszywalow-Bartnicka P, Sikora E, Skowronek K, McKenna SL, Ghizzoni M, Dekker FJ and Piwocka K. (2012a). Increased acetylation of lysine 317/320 of p53 caused by BCR-ABL protects from cytoplasmic translocation of p53 and mitochondria-dependent apoptosis in response to DNA damage. Apoptosis 2012, 17(9): 950-963; autor korespondujący IF 2011: 4,788; 5-letni IF: 4,125; MNiSW: 30 3
6. Kusio-Kobialka M., Podszywalow-Bartnicka P., Peidis P., Glodkowska-Mrowka E., Wolanin K., Leszak G., Seferynska I., Stoklosa T., Koromilas A.E #. and Piwocka K #. (2012b). The PERK-eIF2α phosphorylation arm is a pro-survival pathway of BCR-ABL signaling and confers resistance to imatinib treatment in chronic myeloid leukemia cells. Cell Cycle 2012 Nov.1, 11(21) w druku, autor korespondujący # - autorzy dzielą koordynację projektu IF 2012: 5,359; 5-letni IF: 4,579; MNiSW: 30 Inne prace: 7. Wolanin K., Piwocka K. (2007). Rola surwiwiny w mitozie. Postepy Biochemii 2007;53(1):10-8. Bez IF; liczba cytowao: 7 8. Wolanin K., Piwocka K. (2008). Kurkumina od medycyny naturalnej do kliniki. KOSMOS 2008; 57(1). Bez IF, MNiSW: 4 9. Piwocka K., Wolanin K., Kusio-Kobialka M., Podszywalow-Bartnicka P. (2011). Bcr-Abl hits at mitosis; implications for chromosomal instability, aneuploidy and therapeutic strategy. Rozdział w pracy zbiorowej: Myeloid Leukemia Basic Mechanisms of Leukemogenesis", edited by: Steffen Koschmieder and Utz Krug. ISBN 978-953-789-5 - wydawnictwo InTech, grudzieo 2011, str. 1-27; autor korespondujący * Opis indywidualnego wkładu habilitanta w powstanie każdej z wieloautorskich publikacji znajduje się w Załączniku 4 (Wykaz opublikowanych prac naukowych lub twórczych prac zawodowych). Oświadczenia wszystkich współautorów określające indywidualny wkład każdego z nich w powstanie poszczególnych prac znajdują się w Załączniku 5 (Oświadczenia współautorów). 4.2 Omówienie celu naukowego/artystycznego ww. pracy/prac i osiągniętych wyników wraz z omówieniem ich ewentualnego wykorzystania. Nowe prożyciowe mechanizmy aktywowane przez onkogen BCR-ABL w komórkach przewlekłej białaczki szpikowej, promujące rozwój i progresję choroby oraz opornośd na terapię; poszukiwanie nowych celów i strategii terapeutycznych. Nowotwory, w tym nowotwory krwi, mimo znaczącego postępu w medycynie, wciąż stanowią jedno z głównych zagrożeo współczesnego świata. Wiadomo, że w nowopowstających komórkach nowotworowych musi dojśd do uruchomienia całego szeregu szlaków sygnałowych. Pozwalają one komórkom zachowad zdolnośd do samoodnawiania i niekontrolowanych podziałów, posiadad nieograniczony potencjał proliferacyjny, zachowad niewrażliwośd na brak czynników wzrostowych, opornośd na apoptozę, zdolnośd do angiogenezy i przerzutowania, niewrażliwośd na stres metaboliczny, uszkodzenia DNA, stres mitotyczny oraz niestabilnośd genomową (Hanahan i wsp. 2000; Negrini i wsp. 2010). Również progresja choroby oraz nabywanie oporności wiążą się z nabywaniem przez komórki 4
nowotworowe nowych cech. Mimo, że o biologii nowotworów wiadomo coraz więcej a kolejne terapie wprowadzane są do klinik, wciąż wiele mechanizmów uczestniczących w progresji nowotworów oraz uniemożliwiających skuteczną terapię przeciwnowotworową jest niejasnych i nie do kooca poznanych. Istnieje koniecznośd poszukiwania nowych celów terapeutycznych oraz nowych strategii terapeutycznych, zarówno celowanych ( targeted therapy ) jak i o szerokim spektrum działania ( multitargeted therapy ), w celu opracowania efektywniejszych i skuteczniejszych terapii przeciwnowotworowych (Carella i wsp. 2011). Nie da się tego dokonad bez dokładnego poznania mechanizmów, które aktywowane są w komórkach nowotworowych i sprzyjają rozwojowi nowotworu, jego ekspansji i nabywaniu oporności na leczenie. W niniejszym omówieniu chciałabym przedstawid wyniki moich badao dotyczących poszukiwania nowych prożyciowych szlaków sygnałowych aktywowanych przez onkogen BCR-ABL w komórkach przewlekłej białaczki szpikowej, wpływających na rozwój i progresję choroby oraz opornośd na terapię (Piwocka i wsp. 2006; Wolanin, Piwocka i wsp. 2010; Piwocka i wsp. 2011; Kusio- Kobialka, Piwocka i wsp. 2012a, Kusio-Kobialka, Piwocka i wsp. 2012b). Nowoodkryte przez nas szlaki mogą stanowid potencjalny cel terapeutycznej interwencji. Ponadto, celem moich badao było także poszukiwanie alternatywnych mechanizmów indukcji śmierci w komórkach nowotworowych, w tym białaczkowych, opornych na klasyczną apoptozę (Wolanin, Piwocka i wsp. 2006; O Sullivan, Piwocka i wsp. 2010). Biologia nowotworów była głównym tematem prowadzonych przeze mnie badao od początku mojej drogi naukowej, co zostało opisane w innych częściach autoreferatu. Zagadnieniami przedstawionymi w tej części zaczęłam zajmowad się w czasie stażu podoktorskiego, który odbyłam w BioScience Institute, University College Cork w Irlandii w Cell Development and Disease Laboratory, kierowanym przez prof. Thomasa Cottera. Projekt realizowany był wspólnie z dr Sharon McKenna z Cork Cancer Research Centre, która była moim bezpośrednim opiekunem. Staż zaowocował współpracą naukową z dr McKenna, która trwa do chwili obecnej i jej rezultatem są wspólne publikacje. Po powrocie do Instytutu Nenckiego do Pracowni kierowanej przez prof. Ewę Sikorę rozpoczęłam realizację własnych projektów naukowych, związanych z tematyką przewlekłej białaczki szpikowej. W kolejnych latach nawiązałam następne współprace naukowe, które przyczyniły się do powstania pozostałych przedstawionych w tej części prac, które szczegółowo zostały omówione poniżej. Rozwój i progresja przewlekłej białaczki szpikowej (CML) Przewlekła białaczka szpikowa (Chronic Myeloid Leukemia - CML) powstaje w wyniku nowotworowej transformacji multipotencjalnej komórki macierzystej szpiku, stanowi około 20% wszystkich białaczek i dotyczy osób najczęściej miedzy 40 a 65 rokiem życia (Calabretta, Perrotti 2004). Charakterystycznym markerem genetycznym CML jest fuzyjny chromosom Philadelphia (Ph1), powstały w wyniku translokacji fragmentu długiego ramienia jednego z chromosomów 22 pary na długie ramię chromosomu pary 9. Jego obecnośd stwierdzono w ponad 95% przypadków CML. Efektem tej fuzji jest powstanie chimerycznego genu bcr-abl, którego produktem jest białko BCR-ABL. BCR-ABL charakteryzuje konstytutywna aktywnośd kinazy tyrozynowej, prowadząca do aktywacji wielu szlaków prożyciowych (PI3/Akt, Jak/STAT, Ras/Raf/Erk i NFkB). BCR-ABL jest uważany za czynnik genetyczny w patogenezie CML, a ekspresja kinazy tyrozynowej jest podstawowym czynnikiem transformacji nowotworowej w CML (Ren i wsp. 2005). 5
Rozwój i naturalny przebieg CML odbywa się w 3 fazach charakteryzujących się narastającą opornością na leczenie (Ryc. 1). BCR-ABL BCR-ABL Niestabilność genomu Dodatkowe mechanizmy prożyciowe Faza chroniczna Faza przyspieszenia Kryzys blastyczny Rycina 1 Schemat rozwoju przewlekłej białaczki szpikowej W rozwoju choroby wyróżnia się fazę przewlekłą, fazę akceleracji i kryzys blastyczny (kryzę blastyczną) (Savona i wsp. 2008). W fazie przewlekłej dochodzi do akumulacji dojrzałych komórek mieloidalnych i znacznego nagromadzenia białych krwinek we krwi obwodowej. Na tym etapie chemoterapia daje stosunkowo dobre rezultaty i prowadzi do długotrwałych okresów remisji. Faza przewlekła u pacjentów, u których nie doszło do przeszczepu szpiku, po około 3-5 latach ulega progresji do tzw. kryzy blastycznej, w której komórki tracą zdolnośd do różnicowania. Fazę blastyczną charakteryzuje ostry przebieg i pojawiająca opornośd na cytostatyki, a stosowane terapie są często nieskuteczne, remisje krótkotrwałe a rokowanie u chorych jest złe (Perrotti i wsp. 2010). Pojawiająca się opornośd dotyczy także terapii imatinibem (Glivec Novartis) lekiem nowej generacji będącym specyficznym inhibitorem kinazy tyrozynowej BCR-ABL, oraz innych specyficznych inhibitorów kinazy tyrozynowej BCR-ABL, jak dasatinib czy nilotinib (Volpe i wsp. 2009). Mimo intensywnych badao prowadzonych w tej dziedzinie, molekularne mechanizmy leżące u podstawy zarówno progresji choroby, jak nabywania fenotypu oporności na chemoterapeutyki nie są do kooca poznane. Koniecznośd wyjaśnienia mechanizmów uczestniczących w progresji choroby i znalezienia dróg obejścia pojawiającej się niewrażliwości na śmierd komórkową jest więc szczególnie istotna w przypadku komórek ze stadium kryzysu blastycznego, który koreluje ze wzrostem oporności na leczenie i aktywacją wielu szlaków o właściwościach prożyciowych. Wśród sugerowanych przyczyn wskazano na występowanie mutacji w genie bcr-abl, zwiększony poziom ekspresji BCR-ABL, pojawienie się pomp P-gp na błonie komórkowej (Quintas-Cardama i wsp. 2009). Kluczowe szlaki sygnałowe aktywowane przez BCR-ABL zostały już opisane (Calabretta, Perrotti 2004; Goldman, Melo 2008). Szczególnie istotna dla indukcji progresji CML wydaje się byd zmieniona regulacja mechanizmów kontrolujących przeżycie komórek (Donato i wsp. 2004; Nambu i wsp. 2010; Jagani i wsp. 2010). Stwierdzono, że także komórki macierzyste CML (leukemia stem cells - LSCs) charakteryzuje opornośd na imatinib, czego efektem jest wznowa choroby (Graham i wsp. 2002). Ponieważ opornośd tych komórek nie jest związana z dodatkowymi mutacjami w BCR-ABL, szczególnie istotne jest poznanie prożyciowych szlaków sygnałowych odpowiedzialnych za wzmożoną przeżywalnośd i opornośd komórek LSCs, w celu wskazania nowych strategii terapeutycznych (Chen i wsp. 2010). Badania ostatnich lat umożliwiły nowe spojrzenie na prożyciowe mechanizmy kluczowe dla rozwoju nowotworu. Oprócz znanych już szlaków hamujących apoptozę, fenotypu oporności wielolekowej (MDR), mechanizmów związanych z aktywacją proliferacji, zahamowaniem różnicowania, 6
pojawianiem się niestabilności genomowej, zwrócono uwagę na zjawisko określane jako adaptacyjna odpowiedź komórek na stres (Schroder, Kaufman 2005; Ron, Walter 2007). Powszechnie wiadomo, że w trakcie rozwoju nowotworu, komórki narażone są na niekorzystne warunki mikrośrodowiska, stres replikacyjny i genotoksyczny, brak czynników wzrostowych, niedotlenienie, wzrost poziomu reaktywnych form tlenu i inne. Komórki eukariotyczne zdolne są do adaptacji do niekorzystnych warunków, dzięki wykształceniu wysoce utrwalonych ewolucyjnie mechanizmów aktywujących protekcyjne szlaki sygnałowe (Wang i wsp. 2010; Murakami 2007; Rutkowski, Kaufman 2007). Konstytutywny, łagodny stres prowadzi do uruchomienia mechanizmów adaptacyjnych, pozwalających na przeżycie, natomiast stres ostry indukuje odpowiedź prowadzącą do śmierci komórki. Równowaga pomiędzy adaptacją i przeżyciem a śmiercią komórkową ma niezwykle istotne znaczenie dla funkcji komórek Ryc. 2. Aktywacja komórkowej odpowiedzi na stres związana jest z reorganizacją funkcji komórki i aktywacją kompleksowej odpowiedzi o charakterze ochronnym. STRES ZABURZENIE HOMEOSTAZY Komórkowa odpowiedź na stres Rycina 2. Aktywacja komórkowej odpowiedzi na stres indukowanej na skutek zaburzeo homeostazy komórki. W komórkach nowotworowych mechanizm ten ma funkcje ochronne i umożliwia adaptację do niekorzystnych warunków i przeżycie komórek. Adaptacja / przeżycie Śmierć komórki Innym mechanizmem silnie korelującym z progresją choroby jest wzrost aneuploidii i niestabilności genomowej. Niestabilnośd genomowa może wynikad z zaburzeo liczby i struktury chromosomów na skutek nieprawidłowych podziałów komórek (niestabilnośd chromosomowa) (Foijer i wsp. 2010) lub akumulacji mutacji i uszkodzeo na skutek błędów w systemach naprawy DNA (Economopoulou i wsp. 2011). Istnieje hipoteza zapoczątkowana przez Boveriego w XIX wieku mówiąca o tym, że aneuploidia i niestabilnośd chromosomowa stoją u podstaw rozwoju nowotworu (Holland, Cleveland 2009). Zaburzenia te pozwalają na generowanie komórek o nowych cechach i są uważane za jeden z podstawowych czynników sprzyjających nowotworzeniu (Negrini i wsp. 2010). Biorąc pod uwagę, że komórki CML w kryzie blastycznej mają wysoki poziom niestabilności chromosomowej, powstawanie komórek aneuploidalnych o nowych cechach wydaje się mied istotne znaczenie także w przypadku przewlekłej białaczki szpikowej (Johansson i wsp. 2002; Amiel i wsp. 2006, Giehl i wsp. 2005). Model transformacji CML zaproponowany przez Perrottiego wskazuje, że nabywanie zmian genetycznych i epigenetycznych oraz aberracji chromosomowych przez komórki macierzyste nowotworu LSCs i komórki z nich się wywodzące jest przyczyną progresji z fazy chronicznej do fazy kryzy blastycznej (Perrotti i wsp. 2010). Moje badania koncentrowały się na poszukiwaniu nowych szlaków sygnałowych aktywowanych przez BCR-ABL, które wpływają na mechanizmy promujące niestabilnośd chromosomową oraz prożyciową odpowiedź o charakterze adaptacyjnym, a tym samym zwiększają potencjał kancerogenny komórek i sprzyjają rozwojowi nowotworu. Odkrycie nowych mechanizmów pozwala na wskazanie nowych celów terapeutycznych, potencjalnych biologicznych markerów progresji choroby oraz na szersze zrozumienie zjawiska progresji choroby i nabywania oporności na terapię. 7
Zaburzenia kontroli mitozy jako mechanizm promujący niestabilnośd chromosomową i aneuploidię w komórkach przewlekłej białaczki szpikowej. Jak już wspomniałam, zjawisko aneuploidii i niestabilności genetycznej silnie koreluje z pojawianiem się kryzysu blastycznego w rozwoju CML. Postuluje się, że odpowiedzialna za to zjawisko jest podwyższona ekspresja BCR-ABL i amplifikacja genetycznie niestabilnego fenotypu komórek (Melo, Barnes 2007). W jedynym doniesieniu wykazano, że u pacjentów CML w kryzysie blastycznym ekspresja białka BRCA1 jest silnie obniżona, jednak autorzy wiązali tę obserwację z zaburzeniami naprawy DNA (Deutsch i wsp. 2003). Białko BRCA1, oprócz dobrze scharakteryzowanej funkcji w naprawie DNA, jest też czynnikiem regulującym ekspresję całej grupy genów zaangażowanych w regulację punktu kontroli mitozy (Spindle Assembly Checkpoint, SAC) (Bae i wsp. 2005; Wang i wsp. 2004). Punkt kontroli mitozy odgrywa kluczową rolę w prawidłowej segregacji chromosomów w czasie mitozy i jest jednym z głównych mechanizmów odpowiadających za stabilnośd genomu (Musacchio, Salmon 2007). Ponadto, prawidłowo funkcjonujący SAC jest warunkiem prawidłowej odpowiedzi na związku zaburzające strukturę i funkcje mikrotubul, zatrzymanie komórek w mitozie i indukcję katastrofy mitotycznej. Komórki nowotworowe z nieczynnym SAC, mimo nieprawidłowości zwykle są w stanie dzielid się dalej, co prowadzi do niekontrolowanych, nieprawidłowych podziałów i aneuploidii lub/i poliploidii. Ponieważ wiele naszych i innych obserwacji wskazywało na upośledzenia regulacji mitozy w komórkach z BCR-ABL, postanowiliśmy sprawdzid, jak ekspresja BCR-ABL wpływa na poziom BRCA1 oraz funkcjonowanie punktu kontroli mitozy. Badania te przeprowadzone były we współpracy z dr Sharon McKenna z CCRC, częściowo w trakcie krótkoterminowego stażu w jej laboratorium. Badania prowadziłam wykorzystując oryginalny model komórkowy przewlekłej białaczki szpikowej, stworzony i scharakteryzowany w pracowni prof. Cottera (Keeshan i wsp. 2001). W tym celu mysie komórki progenitorowe 32D Cl3 zostały stransfekowane onkogenem BCR-ABL i wyprowadzono linie ze stabilną ekspresją BCR-ABL na różnym poziome ja w swoich badaniach wykorzystywałam komórki linii C2 z niskim poziomem BCR-ABL oraz linii C4 z wysokim poziomem BCR-ABL. Komórki z niskim poziomem BCR- ABL (C2) wykazują wiele cech komórek z fazy chronicznej CML, natomiast linia komórek eksprymujących BCR-ABL na wysokim poziomie (C4) charakteryzuje opornośd na wiele czynników proapoptotycznych, odpowiadają one blastycznej fazie choroby. Komórki te wywoływały u myszy białaczko-podobne schorzenia, co potwierdza onkogenne właściwości powstałych komórek. Zastosowanie tego modelu pozwalało na analizę zmian będących wynikiem tylko różnego poziomu ekspresji BCR-ABL, gdyż linie te wywodzą się z komórek 32D i posiadają to samo tło genetyczne. Biorąc pod uwagę, że powszechnie wykorzystywane linie komórek nowotworowych zostały uzyskane od pacjentów w kryzysie blastycznym i komórki te charakteryzuje wiele zmian wtórnych oraz wysoki poziom aneuploidii, zastosowanie opisanego wyżej modelu jest bardzo cenne gdyż pozwala na badanie cech zależnych wyłącznie od różnego poziomu ekspresji BCR-ABL. Wykazaliśmy, że BCR-ABL powoduje silne obniżenie poziomu białka BRCA1 oraz obniżoną ekspresję genów regulowanych przez BRCA1, takich jak Mad2, Bub3, Bub1, BubR1, należących do kompleksu SAC (Wolanin, Piwocka i wsp. 2010). Bezpośrednią zależnośd tej regulacji potwierdziliśmy, wyciszając ekspresję BRCA1, stosując sirna skierowane przeciw BRCA1. Zastosowanie imatinibu, specyficznego inhibitora BCR-ABL, powodowało zarówno wzrost poziomu BRCA1, jak i ekspresji genów Bub1, Bub3, BubR1 oraz Mad2, potwierdzając zależnośd od aktywności BCR-ABL. Komórki z BCR-ABL z obniżonym poziomem BRCA1 nie były w stanie zaktywowad prawidłowo punktu kontroli mitozy w odpowiedzi na zaburzenia mitozy. Nie dochodziło do zatrzymania podziałów w mitozie i komórki ulegały tzw. wyślizgnięciu się z mitozy (mitotic slippage) i przejściu do fazy 4NG1. Obserwowano dekondensację chromatyny oraz przyspieszoną degradację cykliny B1 towarzyszące przejściu z mitozy do 4NG1. Ekspresja BCR-ABL upośledzała także funkcję kolejnego punktu kontroli - postmitotycznego punktu 8
kontroli, którego celem jest zapobieganie rozpoczęcia kolejnej rundy replikacji DNA i poliploidyzacji. Co więcej, stwierdziliśmy, że komórki poliploidalne są zdolne do wejścia w mitozę, co jest szczególnie niebezpieczne, gdyż prowadzi do powstania komórek o nieprawidłowym zestawie chromosomów. W efekcie tych zaburzeo dochodziło do generowania komórek aneuiploidalnych i oporności na związki uszkadzające mikrotubule. Założyliśmy, że skoro za te efekty odpowiada bezpośrednio ekspresja BCR-ABL, to nie traktowane niczym komórki CML powinny charakteryzowad się nieprawidłowościami w przebiegu mitozy, komórkami o wielopolarnych wrzecionach podziałowych i co ważne, zaburzenia te nie są dla niech letalne. Stwierdziliśmy liczne nieprawidłowości mitozy w komórkach z BCR-ABL a procent nieprawidłowych mitoz silnie korelował z poziomem ekspresji BCR-ABL (Wolanin, Piwocka i wsp. 2010). Wśród zaburzeo występowały wielopolarne wrzeciona podziałowe, tzw. pogubione chromosomy (lagging chromosomes), tzw. mostki chromosomowe (chromosomal bridges) powstające na skutek nieefektywnej segregacji chromosomów oraz mikrojądra. Towarzyszyły temu nieprawidłowości w mechanizmach kontroli ilości centrosomów, czego skutkiem jest nieprawidłowo uformowane wrzeciono podziałowe. Wyniki tej pracy wzbogaciły wiedzę na temat przyczyn niestabilności chromosomowej w komórkach CML i dodały do znanych już zaburzeo wywołanych przez BCR-ABL, defekty funkcji punktów kontroli mitozy i kontroli poliploidalności. Co więcej, pokazaliśmy, że za zaburzenia te odpowiada obniżony poziom białka BRCA1 i obniżona ekspresja komponentów SAC. Obniżoną ekspresję BRCA1 i zaburzenia kontroli mitozy obserwowano do tego czasu w nowotworach piersi i prostaty (Chabalier i wsp. 2006; Bae i wsp. 2005). Uzyskane przez nas wyniki wskazują na to, że defekty związane z zaburzeniami poziomu i funkcji BRCA1 są powszechniejsze i dotyczą także przewlekłej białaczki szpikowej. Obserwacja wskazująca, że komórki poliploidalne nie umierają i są w stanie się dzielid, ulegając nieprawidłowym podziałom, jest bardzo istotna w świetle proponowanych mechanizmów uczestniczących w progresji choroby, którą wiąże się z rozwijającą się poliploidią i generowaniem komórek niestabilnych genetycznie o nowych cechach (Ilaria 2005; Perrotti i wsp. 2010). Wyniki naszych badao pozwoliły na zaproponowanie modelu przedstawiającego wpływ ekspresji BCR-ABL i obniżonego poziomu BRCA1 na niestabilnośd genomową i rozwój aneuploidii w komórkach przewlekłej białaczki szpikowej (Piwocka i wsp. 2011), Ryc. 3. Jednym z warunków przeżycia komórek dzielących się nieprawidłowo, czego efektem są pęknięcia DNA, jest niewrażliwośd na zależną od p53 apoptozę, która aktywowana jest w odpowiedzi na uszkodzenia DNA. Wykazaliśmy, że w komórkach z BCR-ABL nie dochodzi do translokacji białka p53 z jadra komórkowego do cytoplazmy, co jest niezbędnym warunkiem do aktywacji białka BAX, oraz przejścia Bax i p53 do mitochondriów a co za tym idzie indukcji apoptozy (Kusio-Kobiałka, Piwocka i wsp. 2012a). Przyczyną tych zaburzeo była wzmożona acetylacja białka p53 na resztach seryny 317, które to miejsce znajduje się w sekwencji regulującej przemieszczanie się p53 między jądrem a cytoplazmą. Stosując mutanty p53 S317A wykazaliśmy kluczową rolę tego miejsca w regulacji translokacji p53 do cytoplazmy oraz podatności na apoptozę indukowaną związkami uszkadzającymi DNA. Wykazaliśmy też, że niskocząsteczkowy specyficzny inhibitor acetyltansferazy PCAF, która bierze udział w acetylacji p53 na resztach seryny 317 uwrażliwia komórki z BCR-ABL na związki uszkadzające DNA. W pracy tej opisaliśmy nowy mechanizm oporności komórek z BCR-ABL na uszkodzenia DNA, wskazując nowe, potencjalnie interesujące miejsca interwencji terapeutycznej. 9
BCR-ABL Ekspresja BRCA1 Obniżona ekspresja genów regulowanych przez BRCA1 (BubR1, Mad2, Bub1, Bub3, cyklina B1) Amplifikacja centrosomów Zaburzenia odpowiedzi na uszkodzenia DNA Zaburzone funkcje punktu kontroli mitozy Nieprawidłowości w formowaniu wrzeciona podziałowego Nieprawidłowa segregacja chromosomów Zaburzone funkcje punktów kontroli cyklu komórkowego Błędy naprawy DNA Wysoki poziom genomowej i chromosomowej niestabilności Zwiększona zdolność generowania komórek aneuploidalnych Rycina 3. Model przedstawiający wpływ obniżonego poziomu BRCA1 na mechanizmy promujące niestabilnośd genomową, nieprawidłowe podziały i aneuploidię w komórkach przewlekłej białaczki szpikowej. Wg. Piwocka i wsp. 2011, zmodyfikowane. Strategia terapii wielocelowej kurkumina jako potencjalny związek przeciwnowotworowy o szerokim spektrum działania; indukcja zaburzeo podziałów i katastrofy mitotycznej w komórkach opornych na apoptozę Jak wspominałam wcześniej, BCR-ABL indukuje liczne szlaki antyapoptotyczne, co uniemożliwia aktywację procesu śmierci komórkowej przez wiele powszechnie stosowanych chemioterapeutyków, których działanie opiera się na indukcji apoptozy. Ponadto, co także opisałam powyżej, efektem deregulacji punktu kontroli mitozy jest także niewrażliwośd na związki wpływające na stabilnośd mikrotubul i tworzenie wrzeciona mitotycznego. Stąd koniecznośd poszukiwania nowych strategii terapeutycznych, które albo uruchamiają alternatywne szlaki śmierci komórki albo uderzają w wiele różnych celów terapeutycznych, aby przełamad opornośd. Przez kilka lat, pracując w zespole prof. Ewy Sikory, zajmowałam się badaniem naturalnego związku o właściwościach przeciwzapalnych i przeciwnowotworowych kurkuminy. Kurkumina, jako związek o szerokim spektrum działania, uderza w wiele celów w komórce, z których liczne zostały już scharakteryzowane (Sikora-Polaczek i wsp. 2010; Sikora i wsp. 2010), Ryc. 4. Są to między innymi białka regulujące cykl, czynnik transkrypcyjny NFkappaB, białka regulujące apoptozę z rodziny Bcl2 oraz IAP, białko p53, prożyciowe szlaki sygnałowe JAK/STAT oraz Akt, enzymy regulujące stan zapalny COX-2 i 5- LOX, białka kontrolujące angiogenezę takie jak MMP-2, MMP-9, ICAM-1, VCAM-1 i wiele innych. 10
W prowadzonych przeze mnie wcześniej badaniach wykazałam, że kurkumina indukuje niezależną od kaspaz śmierd komórek nowotworowych, które charakteryzowała opornośd na klasyczną apoptozę (Piwocka i wsp. 1999; Piwocka i wsp. 2002). Inne badania wykazały, że kurkumina wywołuje zaburzenia struktury wrzeciona podziałowego w opornych na apoptozę komórkach MCF-7, co sugerowało indukcję alternatywnej ścieżki śmierci komórki katastrofy mitotycznej (Holy i wsp. 2002). Katastrofa mitotyczna jest procesem śmierci komórki następującym pod wpływem różnego typu zaburzeo podziału, prowadząc m. in. do zatrzymania komórek w mitozie, nieprawidłowości wrzeciona podziałowego i rozpadu jądra komórkowego na tzw. mikrojądra (mikronukleacja) (Castedo i wsp. 2004; Vakifahmetoglu i wsp. 2008). Postanowiliśmy sprawdzid, czy komórki z ekspresją BCR-ABL, oporne na klasyczną apoptozę, będą wrażliwe na kurkuminę. Badania te prowadziłam we współpracy z innymi członkami zespołu prof. Ewy Sikory, która od lat zajmowała się różnymi aspektami działania kurkuminy. Wykorzystaliśmy opisany już przeze mnie wcześniej komórkowy model przewlekłej białaczki szpikowej. Czynniki transkrypcyjne Mediatory stanu zapalnego TNF, IL-1, 2, 5, 6, 8, 12, COX-2, 5-LOX, PSA, CRP AP-1, NFkB, STAT 1, 3, 5, HIF-1, CBP, WT-1, Notch-1, -katenina, ATF-3, CHOP, SP-1, PPAR-, NrF2, p53 Kinazy białkowe PKA, PKB, PKC, Src, FAK, PAK, ERK, JNK, JAK, MAPK, Pp60c Receptory IR, FasR, IL-8R, CXCr4, LDLR, EGFR, HER2, H2R, ITR, EPCR, AHR, ITR Kurkumina Inne enzymy: reduktaza glutationu GST, ATPaza, acetylotransferaza histonówp300, inos, HO-1, MMP-9, HDAC 1, 3, 8 inne białka: DEF-40, topoizomeraza II, MDR-1, integraza HIV-1 Regulatory cyklu komórkowego cyklina D1, cyklina E, c-myc, p21 Regulatory apoptozy anty-apoptotyczne: cflip, IAP, XIAP, Bcl-2, Bcl-Xl, surwiwina, Hsp70 pro-apoptotyczne: Bax, Bid, kaspaza 3 i 8 Regulatory cyklu komórkowego cyklina D1, cyklina E, c-myc, p21 Modyfikowane wg. Sikora E. et al. Current Pharmaceutical Design, 2010, 16, 884-892 Rycina 4. Molekularne cele kurkuminy. Wykazaliśmy, że kurkumina hamuje proliferację i indukuje śmierd komórek z BCR-ABL. Komórki pod wpływem kurkuminy zatrzymywały się w fazie G2/M cyklu komórkowego, co korelowało z obniżonym poziomem cykliny D2 oraz indukcją białek p21 i p27 (Wolanin, Piwocka i wsp. 2006). 11
Symptomy apoptozy towarzyszyły dopiero ostatnim stadiom śmierci komórkowej i były zjawiskiem wtórnym. W komórkach traktowanych kurkuminą zaobserwowaliśmy nagromadzenie komórek w mitozie oraz liczne nieprawidłowości morfologii jądra komórkowego, wrzeciona podziałowego oraz cytokinezy, Ryc. 5. A B B 1 2 3 4 5 6 Rycina 5. Morfologia jąder komórkowych komórek ulegających prawidłowej mitozie mitozy (A) oraz komórek z BCR-ABL traktowanych kurkuminą, ulegających nieprawidłowym podziałom (B). Na rysunku widoczne są wrzeciona monopolarne (1, 2), wrzeciona wielopolarne (3, 4), różne etapy tworzenia mikrojąder (5-8). Zmodyfikowane wg. Wolanin i wsp. 2006. 7 8 9 Wykazaliśmy, że kurkumina indukuje katastrofę mitotyczną związaną z nieprawidłowym funkcjonowaniem kompleksu białkowego CPC, tzw. kompleksu wędrującego po chromosomach (chromosomal passenger complex). Kompleks ten reguluje przebieg mitozy i jest niezbędny do koordynacji zman cytoszkieletu i chromatyny na każdym etapie mitozy (Ruchaud i wsp. 2007a; Ruchaud i wsp. 2007b). Jako pierwsi wskazaliśmy kompleks CPC jako nowy molekularny cel działania kurkuminy, a przyczyną tych zaburzeo był obniżony pod wpływem kurkuminy poziom białka surwiwiny. Surwiwina, oprócz znanych funkcji, jakie pełni w regulacji apoptozy, jest kluczowym składnikiem kompleksu CPC, regulującym lokalizację i funkcję białka Aurora B (Vader i wsp. 2006). Brak surwiwiny powodował zaburzenia lokalizacji białka Aurora B, a w efekcie nieprawidłowe funkcjonowanie całego kompleksu. Biorąc pod uwagę, że kompleks CPC reguluje przebieg mitozy od metafazy do cytokinezy, defekty jego funkcji mają dla komórki krytyczne znaczenie. W komórkach traktowanych kurkuminą nie obserwowaliśmy prawidłowo uformowanego wrzeciona podziałowego, nie dochodziło do segregacji chromosomów oraz prawidłowej cytokinezy. Jednak samo wyciszenie ekspresji surwiwiny w komórkach z BCR-ABL nie wystarczyło, aby wywoład podobne efekty. Prowadziło do nieprawidłowej lokalizacji białka Aurora B oraz intensywnej poliploidyzacji efektu bardzo niebezpiecznego, gdyż sprzyjającego generowaniu komórek aneuploidalnych o niestabilnym genomie. W komórkach pozbawionych surwiwiny nie obserwowaliśmy wzrostu poziomu białek p21 i p27, które są potrzebne do zatrzymania cyklu komórkowego po wyciszeniu surwiwiny (Wolanin, Piwocka i wsp. 2006). Indukcja p21 i p27 jest efektem aktywacji zależnego od p53 punktu kontroli cyklu komórkowego w odpowiedzi na wyciszenie surwiwiny (Beltrami i wsp. 2004), a w komórkach z BCR-ABL ten punkt kontroli nie jest w pełni funkcjonalny. W przypadku badanych przez nas komórek CML, dla uzyskania efektu cytotoksycznego nie wystarczyło wyciszenie ekspresji surwiwiny, konieczne są inne, dodatkowe efekty działania kurkuminy, które upośledzają prożyciowe szlaki aktywne w komórkach nowotworowych. Podsumowując, wykazaliśmy, że kurkumina wywołuje śmierd o cechach katastrofy mitotycznej w komórkach CML opornych na apoptozę. Kurkumina wykazywała silne działanie antyproliferacyjne i cytotoksyczne, co wskazuje na jej potencjalne zastosowanie w terapii przeciwbiałaczkowej. Jest to pierwsze doniesienie wskazujące surwiwinę i kompleks białek wędrujących po chromosomach (CPC) jako cel molekularny kurkuminy. Co więcej, wydaje się, że indukcja katastrofy mitotycznej jest alternatywną 12
strategią eliminacji komórek z BCR-ABL. Katastrofa mitotyczna może byd wyidukowana między innymi w odpowiedzi na uszkodzenia DNA w komórkach z niesprawnymi punktami kontroli cyklu komórkowego, zaburzenia funkcji punktu kontroli mitozy lub struktury mikrotubul, zaburzenia funkcji białek wchodzących w skład kompleksu wędrującego po chromosomach. Wysoki poziom surwiwiny stwierdzono w komórkach pacjentów CML, i rośnie on istotnie w kryzysie blastycznym (Mori i wsp. 2002), a obniżenie poziomu surwiwiny uwrażliwiało komórki z BCR-ABL na apoptozę indukowaną imatinibem (Wang i wsp. 2005), co sugeruje, że terapia anty-surwiwinowa może byd skuteczna w przypadku pacjentów z przewlekłą białaczką szpikową. W świetle tej propozycji strategii, nasze wyniki wskazujące, że samo wyciszenie ekspresji surwiwiny może prowadzid do poliploidyzacji jest bardzo ważnym odkryciem. Pokazaliśmy, że w zależności od tła i kontekstu komórkowego, wyciszenie surwiwiny może mied bardzo niebezpieczne konsekwencje i prowadzid do aneuploidii. Konieczne jest więc, wcześniejsze zbadanie funkcjonowania punktów kontroli cyklu komórkowego dla określenia, czy terapia taka byłaby skuteczna. Terapia anty-surwiwinowa powinna byd rozpatrywana raczej jako terapia towarzysząca, gdyż pojedynczo może mied groźne konsekwencje dla części pacjentów (Mita i wsp. 2008; Fujie i wsp. 2005). Po opublikowaniu uzyskanych wyników, projekt dotyczący wykorzystania kurkuminy jako związku indukującego katastrofę mitotyczną w komórkach nowotworowych opornych na apoptozę, był kontynuowany w ramach współpracy z dr Sharon McKenna z Cork Cancer Research Centre, i dotyczył wpływu tego związku na komórki raka przełyku (oesophageal cancer), który zaliczany jest do grupy nowotworów głowy i szyi. Jest to jeden z bardziej rozpowszechnionych, złośliwych i trudnych do leczenia nowotworów i 5-letni okres przeżycia mimo zastosowania leczenia chirurgicznego, radioterapii i chemioterapii dotyczy tylko około 10% pacjentów (Sant i wsp. 2003). Przyczyny jego powstawania nie są wyjaśnione, stąd trudności w ustaleniu strategii terapeutycznych. Opornośd na apoptozę towarzyszy rozwojowi tego typu nowotworu i jest powodem niewrażliwości na większośd stosowanych powszechnie terapii (Johnstone i wsp. 2002). Postanowiliśmy zbadad, czy komórki raka przełyku będą również wrażliwe na kurkuminę, co mogłoby wskazywad na duży potencjał kurkuminy w terapii tych nowotworów. Wykazaliśmy, że kurkumina wpływa na zahamowanie proliferacji i zmniejszoną przeżywalnośd komórek kilku różnych linii raka przełyku (O Sullivan-Coyne, Piwocka i wsp. 2009). Śmierd komórkową cechowały symptomy katastrofy mitotycznej, takie jak zahamowanie cyklu komórkowego w fazie G2/M, zwiększony poziom cykliny B1, nagromadzenie komórek w mitozie oraz typowa morfologia jądra komórkowego wskazująca na zaburzenia przebiegu mitozy. Zmiany te dotyczyły komórek linii najbardziej wrażliwych na działanie kurkuminy. Przebiegające procesy indukcji śmierci komórkowej były niezależne od kaspaz proteaz typowych dla apoptozy, co jest zgodne z danymi literaturowymi mówiącymi, że aktywacja kaspaz nie jest potrzebna do indukcji śmierci komórkowej na drodze katastrofy mitotycznej (Mansilla i wsp. 2006), oraz naszymi poprzednimi wynikami, gdyż podobne cechy obserwowaliśmy wcześniej w traktowanych kurkuminą komórkach przewlekłej białaczki szpikowej (Wolanin, Piwocka i wsp. 2006). Także inne prace prowadzone w naszym zespole wykazały, że kurkumina indukuje katastrofę mitotyczną w nowotworowych komórkach opornych na apoptozę (Magalska i wsp. 2006). Uzyskane wyniki wskazują na to, że indukcja katastrofy mitotycznej może byd uniwersalnym mechanizmem śmierci indukowanej przez kurkuminę w komórkach opornych na apoptozę. Jednocześnie, w komórkach linii raka przełyku stwierdziliśmy pojawianie się wakuol charakterystycznych dla autofagii, jednak siła tego zjawiska była różna i wakuole nie występowały w komórkach ulegających katastrofie mitotycznej. Podobne obserwacje sugerujące, że w komórkach dochodzi do indukcji autofagii pod wpływem kurkuminy opublikowali także inni autorzy (Aoki i wsp. 2007). Wydaje się jednak, że to indukcja katastrofy mitotycznej jest główną przyczyną cytotoksyczności kurkuminy w przypadku komórek raka przełyku. Jest to szczególnie istotne w przypadku eliminacji komórek raka przełyku opornych na wiele różnych strategii terapeutycznych 13
bazujących na indukcji apoptozy. W tym przypadku wiąże się nadzieje z terapeutycznym zastosowaniem kurkuminy, gdyż jak na razie jest to jedna z niewielu skutecznych metod eliminacji tego typu komórek. Nasza praca była jedną z pierwszych wskazujących na potencjalne wykorzystanie kurkuminy w terapii nowotworów głowy i szyi. Od czasu naszej publikacji, badania dotyczące tego zagadnienia rozwijają się intensywnie i dotyczą zarówno badao in vitro jak i in vivo, w których potwierdzono przeciwnowotworowe działanie kurkuminy i jej duży potencjał w terapii różnych typów nowotworów, w tym głowy i szyi oraz białaczek (Jurenka i wsp. 2009; Wilken i wsp. 2011; Ye i wsp. 2012; Subramaniam i wsp. 2012; Epstein i wsp. 2010). Jednocześnie, prowadzone są intensywne prace nad zwiększeniem biodostępności kurkuminy (Bansal i wsp. 2011). Dobre rezultaty uzyskuje się stosując liposomowe nośniki kurkuminy, łącząc kurkuminę z różnymi nanocząsteczkami lub tworząc różnego typu emulsje i mikrokaspułki. Zastosowanie tych strategii pozwala obniżyd kilkunasto- lub nawet kilkudziesięciokrotnie stężenia kurkuminy, przez co możliwośd wejścia kurkuminy do klinik na szerszą skalę jest znacznie bardziej realna. Symptomy stresu siateczki śródplazmatycznej (ER stress) w komórkach z ekspresją BCR-ABL W zespole kierowanym przez prof. Thomasa Cottera, w BioSciences Institute, University College Cork w Irlandii, w którym odbywałam staż podoktorski, zainteresowani byliśmy poszukiwaniem nowych szlaków antyapoptotycznych aktywowanych przez onkogen BCR-ABL, które decydują o oporności na terapię. W prowadzonych badaniach wykazaliśmy po raz pierwszy, że ekspresja BCR-ABL prowadzi do zaburzeo homeostazy wapniowej w komórkach CML a w efekcie indukcji łagodnego stresu siateczki śródplazmatycznej (ER stress) (Piwocka i wsp. 2006). Siateczka śródplazmatyczna (ER) jest organellum będącym swoistym czujnikiem wrażliwym na różne czynniki stresogenne (zaburzenia homeostazy wapniowej, zaburzenia obróbki potranslacyjnej białek, stanu redox, brak czynników wzrostowych, nagromadzenie nieprawidłowych białek i inne (Ellgaard, Helenius 2003. Jak wspominałam wcześniej, w warunkach stresu w ER dochodzi do aktywacji komórkowej odpowiedzi na stres zwanej Unfolded Protein Response (UPR), w celu uruchomienia szlaków adaptacyjnych, umożliwiających przeżycie (Schroder, Kaufman 2005). Związane jest to z aktywacją trzech głównych szlaków sygnałowych zależnych od aktywacji IRE1, PERK and ATF6, prowadzących do aktywacji białek sensorowych, kinaz, białek opiekuoczych, czynników transkrypcyjnych, białek regulujących mechanizmy translacji, obronę antyoksydacyjną, metabolizm, autofagię, apoptozę i proliferację. Istnieje już wiele dowodów uzyskanych w badaniach nad innymi typami nowotworów na to, że mechanizm ten może byd jednym z najsilniejszych sygnałów promujących rozwój nowotworu, a co za tym idzie jest niezwykle interesującym celem terapeutycznym (Pyrko i wsp. 2007; Martin i wsp. 2010). Stwierdziliśmy, że komórki z ekspresją BCR-ABL charakteryzują się zaburzoną homeostazą wapniową oraz zmniejszoną, w porównaniu z komórkami bez BCR-ABL, pulą wolnego wapnia w siateczce śródplazmatycznej - ER (Piwocka i wsp. 2006). Jest to o tyle istotne, że wyrzut wapnia z ER, czego konsekwencją jest wzrost poziomu wapnia w cytoplazmie oraz mitochondriach, jest jednym z istotnych elementów indukcji apoptozy zależnej od mitochondriów (Rasola i wsp. 2011). Skutkiem obniżonego wyrzutu wapnia z siateczki śródplazmatycznej komórek z BCR-ABL był także obniżony pojemnościowy napływ wapnia i znacznie zmniejszone pobieranie wapnia przez mitochondria, a w efekcie brak indukcji pro-apoptotycznej odpowiedzi zależnej od wapnia w tych komórkach. Wykazaliśmy, że jest to silny mechanizm chroniący przed apoptozą, niezależny od białek z rodziny Bcl-2. Zaburzenia homeostazy wapniowej są jednym z głównych elementów wpływających na funkcjonowanie ER. W dalszych badaniach wykazaliśmy, że w mysich i ludzkich komórkach z BCR-ABL dochodzi do wzrostu poziomu 14
białka Grp78, które jest markerem indukcji stresu ER. Było to pierwsze doniesienie wskazujące, że w komórkach z BCR-ABL może dochodzid do aktywacji łagodnego, nietoksycznego stresu ER. Powyższe wyniki prezentowałam w czasie 12 th Euroconference on Apoptosis, gdzie uzyskałam I nagrodę za plakat. Aktywacja i znaczenie komórkowej odpowiedzi na stres i szlaku PERK-eIF2 aktywowanych w komórkach z BCR-ABL W tym czasie, moimi wynikami zainteresował się prof. Antonis Koromilas z McGill University w Montrealu, który zajmuje się między innymi badaniem kinaz PKR i PERK oraz czynnika regulacji translacji eif2 i ich roli w nowotworzeniu (Raven, Koromilas 2008; Su i wsp. 2008, Mounir i wsp 2011). Nawiązaliśmy współpracę i rozpoczęłam realizację projektu dotyczącego roli szlaku sygnałowego PERKeIF2, który jest jednym z trzech głównych szlaków aktywowanych w odpowiedzi na stres ER (Wek i wsp. 2006), Ryc. 6. Głównym efektem aktywacji szlaku PERK-eIF2 jest zahamowanie bądź rearanżacja translacji białek na skutek zahamowania inicjacji translacji mrna oraz aktywacja czynnika transkrypcyjnego ATF4 (Ron, Harding 2000; Raven, Koromilas 2008; Proud 2005). Siła i czas trwania aktywacji czynnika eif2 może mied istotny wpływ na funkcjonowanie komórek nowotworowych i aktywację prożyciowych lub proapoptotycznych szlaków w odpowiedzi na stres a w efekcie odpowiedź na terapię. Przed nami nikt nie zajmował się badaniem udziału odpowiedzi zależnej od aktywacji PERKeIF2 w rozwoju nowotworów krwi, były natomiast doniesienia mówiące o ochronnej roli adaptacyjnej komórkowej odpowiedzi na stres ER w rozwoju guzów litych. (Pyrko i wsp. 2007; Dong i wsp. 2008; Martin i wsp. 2010). stres ER Grp78 Odpowiedź UPR IRE1 eif2α PERK eif2α-p ATF6 Reorganizacja translacji białek w komórce Aktywacja czynnika transkrypcyjnego ATF4 Rycina 6. Komórkowa odpowiedź na stres siateczki śródplazmatycznej UPR (Unfolded Protein Response), wyróżniono badany przez nas szlak sygnałowy PERK-eIF2a. PRZEŻYCIE PROMOCJA NOWOTWORU ŚMIERĆ KOMÓRKI W ramach współpracy z prof. Koromilasem otrzymałam plazmidy kodujące zmutowane białka PERK (dom. negative PERK-6, dom. negative dead kinase PERK-Y615, PERK-K618A, PERK-wt) oraz eif2 (dom. negative eif2α-s51a i constitutively active eif2α-s51d). Narzędzia te umożliwiły specyficzne wyłączanie aktywności badanego przez nas szlaku. Na badania aktywacji i roli szlaku PERK-eIF2 w przeżyciu i oporności komórek z BCR-ABL uzyskałam grant MNiSW. Badania prowadziliśmy na mysich i ludzkich liniach przewlekłej białaczki szpikowej oraz komórkach CD34+ uzyskanych z krwi obwodowej pacjentów CML w różnych fazach. Wykazaliśmy, że w komórkach z ekspresją BCR-ABL dochodzi do aktywacji szlaku PERK-eIF2 (Kusio-Kobialka, Piwocka i wsp. 2012b). Aktywacja ta była specyficznie regulowana przez ekspresję BCR-ABL i nie dochodziło do niej ani w spoczynkowych i proliferujących ludzkich limfocytach, ani w komórkach ostrej białaczki - HL60, niezwiązanej z ekspresją BCR-ABL. Co więcej, stwierdziliśmy zależnośd pomiędzy aktywnym stanem badanego szlaku a opornością komórek na apoptozę indukowaną imatinibem. Badając komórki z ekspresją zmutowanej formy BCR-ABL, które są niewrażliwe na imatinib wykazaliśmy, że obserwowane zmiany są specyficzne i zależą od aktywacji kinazy 15
BCR-ABL. Wykorzystując inhibitor kaspaz ZVAD-fmk sprawdziliśmy, że spadek aktywności szlaku obserwowany w komórkach umierających pod wpływem imatinib, nie jest skutkiem zachodzącego procesu apoptozy. Ekspresja zmutowanych białek PERK i eif2 prowadząca do zahamowania badanego szlaku i upośledzenia przesyłanego sygnału, zmniejszała przeżywalnośd komórek i wyraźnie uwrażliwiała je na działanie imatinibu. Co więcej, zaobserwowaliśmy także obniżony potencjał proliferacyjny i klonogenny komórek, w których doszło do ekspresji zmutowanej formy białka eif2. Podsumowując, wykazaliśmy, że w mysich i ludzkich komórkach z ekspresją BCR-ABL dochodzi do aktywacji komórkowej adaptacyjnej odpowiedzi na stres i szlaku sygnałowego PERK-eIF2 a jego aktywnośd korelowała z opornością na śmierd komórkową indukowaną imatinibem. Nasze wyniki wskazują na bardzo istotne cytoprotekcyjne znaczenie tej ścieżki sygnałowej w indukcji oporności na imatinib i wpływie na kancerogenne zdolności komórek przewlekłej białaczki szpikowej. Rola szlaku PERK-eIF2 w rozwoju przewlekłej białaczki szpikowej in vivo i klinicznej oporności na terapię imatinibem W dalszej części prowadzonych przez nas badao interesowało nas, czy uzyskane wcześniej obserwacje zostaną potwierdzone u pacjentów z przewlekłą białaczką szpikową w różnych fazach, co znacznie zwiększyłoby wartośd otrzymanych przez nas wyników. Ponadto, stwierdzenie korelacji pomiędzy aktywnością badanego przez nas szlaku sygnałowego a progresją choroby czy opornością na imatinib sugerowałoby, że mógłby to byd potencjalny marker biologiczny progresji choroby. Obecnie istnieje bardzo niewiele biologicznych markerów pozwalających określid stadium choroby czy podatnośd na terapię (Oehler i wsp. 2009). W celu przeprowadzenia zaplanowanych badao, nawiązałam współpracę z dr Tomaszem Stokłosą z Warszawskiego Uniwersytetu Medycznego oraz dr Iloną Seferyoską z Instytutu Hematologii w Warszawie. Analizę poziomu indukcji markerów stresu ER oraz aktywacji szlaku PERK-eIF2, przeprowadzano w komórkach CD34+ wyizolowanych z krwi obwodowej zdrowych dawców, pacjentów CML w fazie chronicznej (pacjenci w momencie diagnozy, przed leczeniem) oraz pacjentów CML w kryzysie blastycznym (pacjenci z opornością na imatinib) (Kusio-Kobialka, Piwocka i wsp. 2012b). W komórkach CD34+ od zdrowych dawców nie stwierdzono ani ekspresji BCR-ABL, jak i jego aktywności ani żadnych symptomów aktywacji stresu ER i szlaku sygnałowego PERK-eIF2. Natomiast w komórkach od pacjentów CML zaobserwowano wzrost aktywności szlaku PERK-eIF2 i co ważne, poziom aktywności korelował z progresją choroby i kliniczną opornością na terapię imatinibem. Żeby dokładniej przeanalizowad otrzymane wyniki, policzyliśmy stosunek (ratio) ufosforylowanej formy STAT5 świadczącej o aktywności BCR-ABL, oraz ufosforylowanych form PERK i eif2 świadczących o aktywności badanego szlaku, do aktyny. Stwierdziliśmy wyraźną korelację pomiędzy aktywnością BCR-ABL, progresją choroby związaną z opornością na terapię imatinibem a aktywnym stanem kinazy PERK oraz czynnika eif2. Wydaje się, że szlak PERK-eIF2 może mied istotne biologiczne znaczenie w rozwoju CML oraz jako potencjalny marker progresji choroby i oporności na imatinib. Obecnie intensywnie poszukuje się biologicznych markerów umożliwiających śledzenie postępu choroby i rozwijającego się kryzysu blastycznego (Zheng i wsp. 2006) i szlak PERK-eIF2 jest na pewno bardzo interesującym kandydatem do dalszych badao. Zamierzamy zweryfikowad uzyskane przez nas wyniki na większych grupach pacjentów. Do tej pory, aktywację szlaku PERK-eIF2 oraz jego istotną prożyciową rolę wykazano w innych typach nowotworów, nie w białaczkach (Lee i wsp. 2006; Dong i wsp. 2008; Martin i wsp. 2010). Jego cytoprotekcyjne funkcje wiązano z rozwojem guzów litych (Shiota i wsp. 2010), niedotlenieniem i stresem metabolicznym (Ye i wsp. 2010; Kim i wsp. 2010). Nasze badania wykazały, że szlak ten odgrywa 16
objętość guzów [mm 3 ] Dr Katarzyna Piwocka, Załącznik 2 bardzo ważną funkcję także w nowotworach krwi, wpływając na rozwój nowotworu i aktywację mechanizmów promujących nabywanie oporności na terapię. Ostatnio ukazała się praca, w której pokazano aktywację w komórkach z BCR-ABL innych czynników aktywowanych przez stres ER ATF6 i IRE1 (Tanimura i wsp. 2009). Są one spójne z naszymi wynikami świadczącymi o tym, że aktywacja odpowiedzi UPR zachodzi w komórkach z BCR-ABL. Byd może różne elementy adaptacyjnej odpowiedzi na stres w skoordynowany sposób wpływają na rozwój i progresję choroby. Badania powyższe są kontynuowane i nasze nieopublikowane jeszcze dane wskazują, że szlak PERK-eIF2 odgrywa także istotną rolę w cancerogenezie in vivo. W badaniach tych myszy NSG, z upośledzonym układem odpornościowym, zaszczepione zostały podskórnie komórkami CML linii K562 z ekspresją pustego plazmidu (K562-GFP) lub plazmidu kodującego zmutowane białko eif2, czego efektem jest zablokowanie szlaku sygnałowego PERK-eIF2 (K562-GFP/eIF2-S51A). Stwierdziliśmy, że komórki z mutacją eif2 tworzą wyraźnie mniejsze guzy (Kusio-Kobialka, Piwocka i wsp., dane niepublikowane) (Ryc. 7), z cechami zachodzącej martwicy, co potwierdza nasze wcześniejsze obserwacje o dużym pronowotworowym i prożyciowym znaczeniu tej ścieżki sygnałowej. W toku są dalsze badania in vivo, w których komórki nowotworowe podawane będą dożylnie. Powyższe badania finansowane są w ramach grantu Preludium Narodowego Centrum Nauki (kierownik mgr M. Kusio-Kobiałka, opiekun dr K. Piwocka). A K562-GFP Średnia masa guza 3,81 g ± 1,45 g K562-GFP/eIF2α-S51A Średnia masa guza 1,41 g ± 0,68 g B K562-GFP ** K562-GFP/eIF2α-S51A Rycina 7 Wyniki doświadczeo in vivo, w których myszy NSG zostały zaszczepione komórkami K562- GFP (kontrola) lub z ekspresją zmutowanej formy białka eif2a (K562-GFP /eif2a-s51a). A obraz zwierząt po 3 tygodniach wraz ze średnią masą guzów, B wykres przedstawiający objętośd guzów. Kusio-Kobiałka i wsp., dane niepublikowane. Podsumowując, scharakteryzowaliśmy nowy, silnie prożyciowy mechanizm aktywny w komórkach przewlekłej białaczki szpikowej, który związany jest z aktywacją komórkowej odpowiedzi na stres ER i szlaku PERK-eIF2. Stwierdziliśmy, że szlak ten odgrywa cytoprotekcyjną rolę w komórkach CML i jego aktywnośd związana jest z opornością na imatinib oraz progresją choroby. Uważamy, że jest to potencjalnie bardzo interesujący cel terapeutyczny oraz biologiczny marker progresji choroby i oporności na terapię. Uzyskane wyniki pozwoliły na stworzenie hipotezy dotyczącej nowych powiązao pomiędzy szlakiem PERK-eIF2, aktywowanym w odpowiedzi na stres a zależnymi od BCR-ABL mechanizmami promującymi niestabilnośd chromosomową i aneuploidię, co jest przedmiotem moich obecnych badao. Aktualnie prowadzone badania Jak opisywałam wcześniej wykazaliśmy, że ekspresja onkogenu BCR-ABL wpływa z jednej strony na zaburzenia regulacji mitozy i wzrost aneuploidii na skutek obniżonego poziomu białka BRCA1 (Piwocka i wsp. 2011; Wolanin, Piwocka i wsp. 2010) a z drugiej strony na aktywację komórkowej adaptacyjnej odpowiedzi na stres, wpływając tym samym na aktywację szlaków prożyciowych sprzyjających rozwojowi nowotworu (Piwocka i wsp. 2006; Kusio-Kobialka, Piwocka i wsp. 2012b). Oba 17
te procesy dotychczas analizowano dotychczas niezależnie od siebie. W naszych nieopublikowanych jeszcze badaniach wykazaliśmy, że zależne od BCR-ABL obniżenie poziomu BRCA1 odbywa się na poziomie translacji. Ponieważ rearanżacja translacji jest głównym skutkiem aktywacji szlaku PERK-eIF2 zaproponowaliśmy hipotezę zakładającą istnienie zależnych od BCR-ABL wzajemnych regulacji pomiędzy adaptacyjną odpowiedzią na stres siateczki śródplazmatycznej i aktywacją szlaku PERK-eIF2a mechanizmami regulującymi progresję CML (Ryc. 8). Szczególnie interesuje nas określenie roli badanych szlaków sygnałowych w regulacji translacji białka BRCA1, działania punktu kontroli mitozy i indukcji niestabilności genetycznej jako mechanizmów promujących rozwój i progresję przewlekłej białaczki szpikowej oraz kliniczną opornośd na terapię. Na realizację tego projektu uzyskałam 3-letni grant w ramach konkursu Opus Narodowego Centrum Nauki. Weryfikacja postawionej hipotezy i scharakteryzowanie nowych powiązao pomiędzy mechanizmami promującymi niestabilnośd genomową oraz szlakami prożyciowymi związanymi z aktywacją łagodnego stresu siateczki śródplazmatycznej pozwoli na nowe spojrzenie na mechanizmy prowadzące do powstawania i promocji nowotworu a także wskaże nowe potencjalne miejsca terapeutycznej interwencji. BRCA1 Stabilnośd genomowa i chromosomalna Naprawa uszkodzeo DNA Funkcje punktu kontroli mitozy Duplikacja centrosomó Translacja mrna BRCA1 BCR-ABL PERK-eIF2alpha Adaptacja i przeżycie Rearanżacja translacji Zmiana składu sekretomu Ochrona przed apoptozą Degradacja białek Rycina 8. Schemat przedstawiający hipotezę powiązania szlaku PERK-eIF2a regulującego adaptacyjną odpowiedź na stres oraz mechanizmów kontroli stabilności genomowej regulowanych przez BRCA1 w komórkach CML. Podsumowanie: Za najważniejsze osiągnięcia przedstawionych prac uważam: 1. Wykazanie, że w komórkach przewlekłej białaczki szpikowej ekspresja BCR-ABL prowadzi do zależnego od BRCA1 obniżenia poziomu ekspresji genów punktu kontroli mitozy, czego efektem są zaburzenia punktu kontroli mitozy, nieprawidłowe podziały komórki oraz niestabilnośd chromosomowa prowadząca do aneuploidii. 2. Wskazanie surwiwiny oraz kompleksu wędrującego po chromosomach jako nowego celu molekularnego kurkuminy oraz katastrofy mitotycznej jako alternatywnego mechanizmu śmierci indukowanej przez kurkuminę w komórkach opornych na apoptozę. Wykazanie, że monoterapia anty-surwiwinowa, w przypadku komórek z upośledzonymi punktami kontroli cyklu komórkowego, może prowadzid do zaburzeo podziałów komórki i poliploidyzacji. 18
3. Opisanie nowego mechanizmu oporności komórek z BCR-ABL na apoptozę indukowaną uszkodzeniami DNA, związanego ze wzmożoną acetylacją białka p53 na resztach lizyny 317 i zahamowaniem translokacji p53 z jądra komórkowego do cytoplazmy. Wskazanie nowych potencjalnych miejsc interwencji terapeutycznej. 4. Scharakteryzowanie nowego szlaku prożyciowego aktywowanego przez BCR-ABL w komórkach CML, związanego z indukcją łagodnego stresu siateczki śródplazmatycznej i aktywacją ścieżki sygnałowej PERK-eIF2. Wykazanie potencjału kancerogennego badanego szlaku oraz jego korelacji z progresją choroby i opornością na imatinib. 5. Wskazanie szlaku PERK-eIF2 jako potencjalnego celu terapeutycznego oraz biologicznego markera progresji do fazy kryzy blastycznej i rozwoju oporności na imatinib. 5. Omówienie pozostałych osiągnięd naukowo - badawczych. Po uzyskaniu tytułu magistra biologii na Wydziale Biologii Uniwersytetu Warszawskiego, w lutym 1995 roku rozpoczęłam pracę na stanowisku asystenta w Instytucie Biologii Doświadczalnej im. M. Nenckiego PAN, pod bezpośrednią opieką naukową prof. Ewy Sikory. Początkowo zaangażowana byłam w projekty związane z badaniem procesów śmierci i starzenia limfocytów. Efektem tych działao są dwie publikacje, w których jestem współautorką (pkt. 5.1.2, poz. 23, 24). Od początku swojej działalności naukowej, zainteresowana byłam biologią nowotworów, w szczególności badaniami związanymi z procesami śmierci komórkowej oraz molekularnym podłożem indukcji szlaków sygnałowych prowadzących do oporności na śmierd komórek nowotworowych, które mogłyby się stad celem terapii przeciwnowotworowej. W tym czasie, w grupie prof. Sikory rozpoczęto badania nad mechanizmami działania kurkuminy, naturalnego polifenolu pochodzenia roślinnego o silnych właściwościach przeciwnowotworowych, przeciwzapalnych i antyoksydacyjnych, od wieków wykorzystywanego w medycynie naturalnej. Molekularne mechanizmy działania tego związku były bardzo słabo poznane, chod kurkumina budziła bardzo duże zainteresowanie zarówno naukowców jak i klinicystów. Temat mojej pracy doktorskiej dotyczył zbadania mechanizmów odpowiedzialnych za hamowanie proliferacji i indukcję śmierci komórkowej przez kurkuminę w ludzkich komórkach limfoidalnych. Wykazałam, że kurkumina wykazuje właściwości antyproliferacyjne oraz indukuje nową, niezależną od kaspaz ścieżkę śmierci komórkowej. Wykazałam, że stan redoks komórki odgrywa rolę w indukcji nieklasycznej śmierci komórkowej indukowanej przez kurkuminę. Ważnym odkryciem było to, że kurkumina indukuje śmierd także w komórkach o fenotypie oporności wielolekowej, które są oporne na klasyczną apoptozę, a w związku z tym na wiele chemioterapeutyków indukujących w innych komórkach ten rodzaj śmierci. Wyniki moich badao weszły w skład czterech publikacji, w trzech z nich jestem pierwszym autorem (pkt. 5.1.2 poz. 27, 25; pkt. 5.1.1. poz. 21, 19). Prace te spotkały się z dużym zainteresowaniem i były licznie cytowane (odpowiednio 74, 97, 44 i 21 razy). W trakcie realizacji projektu, uzyskane wyniki prezentowałam na pięciu konferencjach zagranicznych i jednej krajowej. Na uczestnictwo w konferencjach zagranicznych uzyskałam stypendia organizatorów. Uzyskałam także trzy roczne granty KBN tzw. młodego badacza, na prowadzenie badao wchodzących w skład mojej 19
rozprawy doktorskiej. Praca doktorska, której promotorem była prof. Sikora, uzyskała wyróżnienie Rady Naukowej Instytutu Biologii Doświadczalnej im. M. Nenckiego. W tym czasie uczestniczyłam w kilku krajowych i międzynarodowych kursach dotyczących technik biologii molekularnej, metod badania procesu apoptozy oraz cytometrii przepływowej, a także byłam na krótkoterminowym stażu w laboratorium Prof. A. Cossarizzy w University of Modena and Reggio Emilia. Jednocześnie z realizacją własnej pracy doktorskiej oraz po obronie rozprawy, zaangażowana byłam w inne projekty prowadzone w naszym zespole, związane z badaniem różnych aspektów działania kurkuminy, czego efektem jest współautorstwo w trzech publikacjach (pkt. 5.1.2 poz. 26, 22; pkt 5.1.1. poz. 18). Współpracowałam także z innymi zespołami w naszym Instytucie, w ramach posiadanej ekspertyzy związanej z badaniem procesów śmierci komórkowej (pkt. 5.1.1 poz. 20). Na jednej z konferencji, na której prezentowałam swoje wyniki, spotkałam prof. Thomasa Cottera, kierownika Cell Development and Disease Laboratory w BioSciences Institute, University College Cork w Irlandii. W roku 2002 odbyłam krótkoterminowy staż, a w roku 2003 rozpoczęłam staż podoktorski w kierowanym przez niego laboratorium. Moje badania dotyczyły poszukiwania nowych, prożyciowych i antyapoptotycznych szlaków aktywowanych przez onkogen BCR-ABL w komórkach przewlekłej białaczki szpikowej (CML). W efekcie realizacji tego projektu odkryłam nowy prożyciowy szlak aktywny w komórkach CML, związany z zaburzeniami homeostazy wapniowej i aktywacją łagodnego stresu siateczki śródplazmatycznej (pkt. 5.1.1 poz. 12), co zostało dokładnie omówionej w części 4.2 tego autoreferatu. Wyniki te prezentowałam na trzech międzynarodowych konferencjach, na które uzyskałam stypendia organizatorów. Plakat prezentowany na 12 th Euroconference on Apoptosis w 2004 roku uzyskał pierwszą nagrodę. Jednocześnie intensywnie uczestniczyłam w realizacji innego projektu związanego z badaniem mechanizmów promujących rozwój i progresję CML. Wykazaliśmy, że komórki z ekspresją BCR-ABL wydzielają do środowiska zewnętrznego osteopontynę, która odpowiada za degradację czynnika IkappaB i aktywację czynnika transkrypcyjnego NFkappaB (pkt. 5.1.1 poz. 17). Obecnie osteopontyna została uznana za istotny czynnik sprzyjający nowotworzeniu i biomarker wielu typów nowotworów i jest bardzo intensywnie badana. W drugiej połowie 2004 roku wróciłam do Instytutu Biologii Doświadczalnej im. M. Nenckiego w Warszawie i rozpoczęłam pracę na stanowisku adiunkta w Pracowni Molekularnych Podstaw Starzenia, kierowanej przez prof. E. Sikorę. Wtedy też rozpoczęłam samodzielną działalnośd naukową i realizację tematów związanych z badaniami nad mechanizmami promującymi powstawanie i rozwój przewlekłej białaczki szpikowej oraz mechanizmami regulującymi indukcję śmierci w tych komórkach, zwłaszcza opornych na klasyczną apoptozę. Byłam opiekunem pracy doktorskiej Kamili Wolanin oraz dwóch prac magisterskich (więcej informacji podano w pkcie 5.8). Kontynuowałam badania związane z rolą szlaków aktywowanych przez łagodny stresy siateczki śródplazmatycznej w komórkach białaczkowych oraz ich znaczeniem, jako potencjalnego celu terapeutycznego. W ramach realizacji tego projektu nawiązałam współpracę z prof. Antonisem Koromilasem z McGill University w Montrealu. W 2008 roku odbyłam krótkoterminowy staż w jego laboratorium i wygłosiłam wykład na zaproszenie. Efektem tej współpracy są wspólne wnioski grantowe i publikacja w czasopiśmie Molecular Cancer Therapeutics (pkt. 5.1.1 poz. 1), oraz kolejne prace w przygotowaniu. Inna częśd prowadzonych przeze mnie badao dotyczy wpływu BCR-ABL na mechanizmy promujące niestabilnośd chromosomalną i progresję choroby. Szczególnie interesuje mnie wpływ BCR- ABL na funkcjonowanie punktu kontroli mitozy, regulację ekspresji białka BRCA1, oraz regulację procesów translacji (pkt. 5.1.1 poz. 4). Niestabilnośd chromosomowa jest jednym z podstawowych elementów kancerogenezy i generowania komórek nowotworowych o zmiennym genomie, co umożliwia pojawianie się komórek o nowych cechach. Jednocześnie, kontynuuję badania nad kurkuminą. Interesuje 20