Streszczenie Celem mojej pracy było badanie obecności bakterii w próbkach gleb, pobranych ze stanowisk reprezentujących różne ekosystemy glebowe, określenie ich przynależności systematycznej oraz stwierdzenie aktywności enzymatycznej w reakcjach rozkładu różnego typu substancji organicznych. Do oznaczania mikroorganizmów wykorzystałam zróżnicowane pod względem składu podłoża, co umożliwiło mi obserwację efektów rozkładu związków pokarmowych, z których składa się świeża materia organiczna. Przy doborze stanowisk, z których pobrałam próbki gleby kierowałam się jej składem i właściwościami chemicznymi. Próbki gleby, przeznaczone do badań, pobrano z trzech stanowisk, znajdujących się na terenie powiatu puckiego. Analiza laboratoryjna została przeprowadzona w sierpniu 2010 na Wydziale Chemii Politechniki Gdańskiej w Katedrze Leków i Biochemii. Przeprowadzone przeze mnie obserwacje wykazały, że: w glebach pobranych ze wszystkich stanowisk występują bakterie amylolityczne obecność bakterii amonifikacyjnych wykryto jedynie w próbce gleby, pochodzącej z nad strefy brzegowej morza w glebie żadnego z badanych stanowisk nie wykryto obecności bakterii asymilujących azot Wstęp Gleba jest powierzchniową warstwą litosfery, będąca naturalnym środowiskiem życia mikroorganizmów takich jak wirusy, bakterie, grzyby i glony. Za jej twórców uznaje się bakterie chemoautotroficzne, a w szczególności nitryfikatory. Mikroorganizmy te wytwarzają, w trakcie chemosyntezy silne kwasy, które przekształcają i rozkładają skałę macierzystą oraz związki organiczne, wzbogacając powstającą glebę. Obecne w glebie drobnoustroje przetwarzają materię organiczną, tworząc biomasę własnych komórek oraz nagromadzają substraty niezbędne do uzupełniania zasobów próchnicy. Mikroorganizmy glebowe cechują się zróżnicowanymi właściwościami biochemicznymi, które czynią je niezbędnymi ogniwami obiegów wielu pierwiastków w przyrodzie, w tym przede wszystkim węgla i azotu. Jak wykazało przeprowadzone przeze mnie doświadczenie, bakterie, tworzące mikroflorę gleby wykazują różne właściwości enzymatyczne. Zdolne są one do wytwarzania enzymów zewnątrzkomórkowych, trawiących skrobię amylaz i proteaz hydrolizujących białka oraz enzymów, rozkładających lipidy. Zdjęcie 1. Podłoże agarowe z dodatkiem skrobi na którym wykrywano obecność bakterii amylolitycznych w glebie ze stanowiska 3.
Materiały i metody Rozmieszczenie stanowisk, z których pobrano glebę. Przebieg doświadczenia 1. Rewa- strefa brzegowa morzawydma biała 2. Kazimierz-las, 2-3 metry od skraju lasu 3. Kazimierz- pole uprawne Próbki gleb zostały pobrane w sierpniu 2010 roku z trzech stanowisk, znajdujących się w powiecie puckim. Przy ich doborze kierowano się jak największą różnorodnością cech fizyko-chemicznych gleb. W celu zbadania aktywności enzymatycznej mikroflory gleby przeprowadzono doświadczenie, które ilustruje następujący schemat: Przebieg doświadczenia 1. Próbkę ziemi z każdego ze stanowisk umieszczono w jałowej kolbce i rozcieńczono solą fizjologiczną. Następnie kolbkę wytrząsano przez 5 minut. 2.Przygotowanymi wcześniej podłożami (agarowym z dodatkiem skrobi, agarowym z dodatkiem tłuszczu oraz Fraziera z żelatyną) zalano płytki Petriego. Do jednej z przygotowanych probówek dodano 5 ml pożywki z mannitolem, do drugiej tyle samo 1% wody peptonowej. 3. Z kolbki pobrano 200µl sklarowanej cieczy nadosadowej i naniesiono ją kolejno na trzy płytki Petriego zalane wcześniej podłożami i do dwóch probówek z pożywkami. Po dodaniu do szalek Petriego oraz probówek podłoży inkubowano je przez 24 godziny w temperaturze 26-30ºC. Po okresie inkubacji powierzchnie płytek zalano: 1. płynem Lugola, 2. 20% roztworem siarczanu miedzi(ii), 3. nasyconym roztworem siarczanu amonowego. Procedury przedstawione na powyższym schemacie wykonano dla próbek gleb, pobranych ze wszystkich badanych stanowisk.
Wyniki S trefy zabarwienia/ 5 zmętnienia duże średnie małe 4 3 2 1 śladowa ilość 0 S tanowisko 1 amylolitycz ne proteolitycz ne lipolitycz ne amonifikacyjne wiążące azot Wykres 1. Flora bakteryjna stanowiska 1. S trefy zabarwienia/ zmętnienia duże średnie małe śladowa ilość 4 3 2 1 0 S tanowisko 2 amylolitycz ne proteolitycz ne lipolitycz ne amonifikacyjne wiążące azot Wykres 2. Flora bakteryjna stanowiska 2. S trefy z abarw ienia/ z mętnienia 5 4 duże 3 średnie małe 2 1 śladowa ilość 0 S tanowis ko 3 amylolityc z ne proteolityc z ne lipolityc z ne amonifikac yjne wiąż ąc e az ot Wykres 3. Flora bakteryjna stanowiska 3.
Charakterystyka stanowisk: Stanowisko 1- gleba pobrana ze strefy brzegowej morza, inicjalna luźna eoliczna, charakteryzuje się bardzo słabo wykształconym poziomem próchnicznym, małą żyznością, kwaśnym odczynem (ph 3-4), jest przeważnie bardzo sucha. Stanowisko 2 gleba pobrana 2-3 metry od skraju lasu, gleba bielicowa, uboga w składniki pokarmowe, charakteryzuje się kwaśnym odczynem(ph 4,5-5) oraz niekorzystnymi warunkami wodnymi. Jej kwasowość dodatkowo wzrasta wraz ze wzrostem domieszki piasku. Stanowisko 3- gleba pobrana z pola uprawnego, gleba płowa. Naturalnie cechuje się odczynem kwasowym; jednak, kiedy wykorzystuje się ją w rolnictwie, podlega ona wapnowaniu, po którym odczyn staje się obojętny lub lekko zasadowy(ph 7-8). Rodzaj poszukiwanych bakterii Rodzaj podłoża Stanowisko 1 2 3 Agarowe z Amylolityczne dodatkiem skrobi Agarowe z Lipolityczne tłuszczem Fraziera z Proteolityczne żelatyną 1% woda Amonifikacyjne peptonowa Asymilujące azot Płynne z mannitolem Tabela1. Obecność bakterii w glebie poszczególnych stanowisk. dużo średnio dużo średnio mało brak śladowa ilość mało średnio brak śladowa ilość mało brak brak brak Obecność bakterii amylolitycznych stwierdzano na podstawie powstania stref przejaśnienia, które wystąpiły w próbkach gleb, pobranych ze wszystkich trzech stanowisk. W materiale ze stanowiska 2. odbarwienie było tylko częściowe, natomiast w próbkach pobranych ze stanowisk 1. i 3., strefa przejaśnienia objęła powierzchnię całej szalki. Występowanie w glebie bakterii lipolitycznych stwierdzano na podstawie występowania miejscowego zielonego zabarwienia. Pojawiło się ono w próbkach gleb, zebranych ze stanowisk 1. i 2.; jednak na płytce 1. było go więcej. Obecność bakterii proteolitycznych również określano według występowania stref przejaśnienia. Obszary takie zaobserwowano na próbkach gleb wszystkich stanowisk. Najwięcej było ich w masie, pobranej ze stanowiska 3., a najmniej ze stanowiska 1. O występowaniu bakterii amonifikacyjnych w probówkach z 1% wodą peptonową świadczyło zaobserwowane zmętnienie roztworu oraz obecność kożucha lub osadu. Zmętnienie wystąpiło w probówkach, w których badano glebę ze stanowisk 2. i 3., jednak było ono niewielkie. Występowanie bakterii asymilujących azot stwierdza się na podstawie pojawienia się na powierzchni pożywki grubej śluzowatej błonki, która jednak nie wystąpiła w żadnej z próbce, badanych gleb.
Dyskusja Każdy typ gleby, dzięki swoim specyficznym właściwościom fizyko-chemicznym, ma swoistą mikroflorę, cechującą się specyficznym metabolizmem. Potwierdzeniem tego stwierdzenia są wyniki przeprowadzonych badań, które wykazały znaczne różnice w składzie mikroflory badanych gleb, a każda próbka należała do innego typu. Należy pamiętać, że w glebach zachodzą procesy adaptacji enzymatycznej. Polegają one na przystosowaniu przez mikroorganizmy układów enzymatycznych do panujących w ich środowisku życia warunków pokarmowych. Ze względu na to, iż tłuszcze są związkami najbardziej zredukowanymi, stanowią one dla bakterii niezwykle bogate źródło energii. Bakterie lipolityczne nie wystąpiły w próbce gleby pobranej z pola (stanowisko 3), która charakteryzuje się najbardziej zasadowym odczynem. Fakt ten może wskazywać na to, iż najkorzystniejszym środowiskiem życia dla tych bakterii jest środowisko o ph oscylującym w granicach 3-4, jakim charakteryzuje się gleba eoliczna pobrana ze stanowiska 1., a w której stwierdzono największą obecność tych bakterii. Może być to również świadectwem obecności w glebie zanieczyszczeń, będących skutkiem działalności gospodarczej człowieka, bowiem ona przyczynia się do rozwoju flory zymogennej. Bakterie zdolne do trawienia skrobi wykryto w próbkach wszystkich badanych gleb, co wskazuje na powszechne występowanie tego związku pokarmowego w glebach, bez względu na ich żyzność(klasę gleby) czy charakteryzujący je odczyn ph. Bakterie te są ważne dla funkcjonowania gleby, ponieważ w wyniku ich działalności enzymatycznej powstaje dwutlenek węgla, który spulchnia glebę oraz jest asymilowany przez rośliny w celu wykorzystania go w procesie fotosyntezy. W literaturze możemy znaleźć informacje, iż w glebach o odczynie kwasowym mikroorganizmami trawiącymi białka, są głównie grzyby, natomiast w glebach zasadowych- bakterie. Informację tą potwierdzają wyniki, przeprowadzonych przeze mnie badań, które wskazują na obecność największej liczby bakterii proteolitycznych w próbce gleby rolnej o odczynie zasadowym i świadczy o tym obecność stref przejaśnienia. Zdjęcie 2. Szalka Petriego z podłożem Fraziera z żelatyną na którym badano próbkę gleby pobraną ze stanowiska2. pod kątem obecności bakterii proteolitycznych. Zdjęcie 3. Szalka Petriego z podłożem Fraziera z żelatyną, na której badano próbkę gleby pobraną ze stanowiska 2. po okresie inkubacji, widoczne strefy przejaśnienia świadczące o obecności poszukiwanych bakterii.
Działalność bakterii amonifikacyjnych jest ściśle związana z działalnością bakterii proteolitycznych. Proces amonifikacji polega bowiem na uwolnieniu wolnego amoniaku, który w glebie powstaje na skutek dezaminacji aminokwasów, a one z kolei są produktami hydrolizy białek, przeprowadzanej przez bakterie proteolityczne. W glebie, gdzie obecność bakterii proteolitycznych była śladowa (stanowisko 1.), bakterie amonifikacyjne nie wystąpiły. Zależność współwystępowania tych dwóch rodzajów bakterii możemy zaobserwować na wykresach 2. i 3., które wskazują na obecność bakterii amonifikacyjnych w próbkach gleby, zawierających odpowiednio małą i średnią ilość bakterii proteolitycznych. Bakterii amonifikacyjnych było jednak niewiele, co może być skutkiem dużej ilość cukrów, obecnych w glebie. W takim przypadku białka są dla bakterii jedynie źródłem azotu, a wydzielanie amoniaku jest słabsze. Bakterie wiążące azot, są to mikroorganizmy, które żyją w symbiozie z roślinami motylkowymi. W wyniku tego współżycia rośliny, niezdolne do asymilowania azotu atmosferycznego, otrzymują go w formie związków organicznych bakterii i są w stanie je przyswoić. Obecności tych bakterii nie stwierdzono w próbce żadnej z badanych gleb, nawet tej, pobranej z pola, co najprawdopodobniej było spowodowane nawozami azotowymi, stosowanymi przez rolników. W wyniku nawożenia w glebie znalazły się związki azotowe w formie dostępnej dla roślin i ich symbioza z bakteriami wiążącymi azot była ograniczona. Bakterie wytwarzają również enzymy, umożliwiające im trawienie wielu innych związków, których nie dotyczyła moja praca, np. celulozy czy chityny. Właściwości enzymatyczne bakterii ważne są dla procesów naturalnych, zachodzących w przyrodzie, oraz produkcji przemysłowej. Wykorzystywane są one między innymi w przemyśle kosmetycznym, garbarskim, papierniczym czy medycynie. Obecnie jedynie nieliczne enzymy wykorzystywane w przemyśle są pochodzenia roślinnego bądź zwierzęcego, a większość z nich produkowana jest przez drobnoustroje, w tym bakterie. Dzięki ich wykorzystaniu w przemyśle możliwe jest przyspieszenie oraz wzrost wydajności produkcji. Lepsza jest również jakość otrzymywanych produktów. Zastosowanie enzymów bakteryjnych pozwala także na oszczędności podczas produkcji w skali przemysłowej. Piśmiennictwo Bednarek B., Dziadowiec H., Pokojska U., Prusinkiewicz Z. (2004) Badania ekologicznogleboznawcze- PWN, Warszawa Maszewska Ziemięcka J. (1948) Zarys mikrobiologii gleby- Państwowy Instytut Wydawnictw Rolniczych, Warszawa Russel S. (1974) Drobnoustroje a życie gleby- PWN, Warszawa Praca zbiorowa pod redakcją naukową Dobrzańskiego B., Zawadzkiego S. (1981) Gleboznawstwo- Państwowe Wydawnictwo Rolnicze i Leśne, Warszawa Elimer E. (1999) Mikrobiologia techniczna- Wydawnictwo Akademii Ekonomicznej im. Oskara Langego we Wrocławiu, Wrocław