Rozdział barwników roślinnych techniką cienkowarstwowej chromatografii adsorpcyjnej Cel ćwiczenia Celem ćwiczenia jest teoretyczne i praktyczne zapoznanie studentów z techniką cienkowarstwowej chromatografii adsorpcyjnej i jej zastosowaniem do rozdzielania barwników roślinnych. Wprowadzenie Chromatografia to fizykochemiczna metoda rozdzielania mieszanin, których składniki ulegają zróżnicowanemu podziałowi pomiędzy dwie fazy, fazę ruchomą i stacjonarną. Jeżeli fazą ruchomą jest gaz, to chromatografia nosi nazwę gazowej, gdy ciecz, wówczas nazywana jest cieczową, w przypadku fazy ruchomej będącej płynem w stanie nadkrytycznym mówi się o chromatografii nadkrytycznej. Fazą stacjonarną natomiast może być ciało stałe bądź ciecz osadzona na stałym nośniku. Faza ruchoma przepływając przez fazę stacjonarną powoduje migrację poszczególnych składników mieszaniny. Składniki te przemieszczają się z różną szybkością wynikającą z ich odmiennego powinowactwa do adsorbenta, odmiennego swoistego powinowactwa do ligandu, z różnic w ich masie cząsteczkowej, z różnic w wypadkowym ładunku, bądź z różnej rozpuszczalności w określonych warunkach rozdziału. Stąd, w zależności od przewagi czynników działających różnicująco na rozdzielane substancje można wyróżnić 5 zasadniczych metod chromatograficznych: chromatografię adsorpcyjną, powinowactwa, sita molekularnego, jonowymienną i podziałową. Ze względu na technikę prowadzenia rozdziału wyróżniamy chromatografię kolumnową, w której faza stacjonarna umieszczana jest w kolumnie, lub chromatografię planarną, w której faza stacjonarna umieszczana jest na płaszczyźnie (bibułowa i cienkowarstwowa). W chromatografii cienkowarstwowej rozdział mieszaniny substancji wykonuje się na cienkich warstwach nośnika (stanowiącego fazę stacjonarną lub będącego nośnikiem fazy ruchomej) osadzonych na płytkach szklanych, plastikowych lub aluminiowych. W zależności od zastosowanego nośnika, rozdział może mieć charakter chromatografii adsorpcyjnej (na żelu krzemionkowym, tlenku glinu), podziałowej (na celulozie, skrobi) lub jonowymiennej (na karboksymetylo-celulozie). 1
Chromatografia adsorpcyjna opiera się na zjawisku adsorpcji, czyli nagromadzeniu cząsteczek rozdzielanych substancji na powierzchni adsorbenta za pomocą słabych oddziaływań fizykochemicznych. W czasie przesuwania się fazy ruchomej po powierzchni adsorbenta (faza stacjonarna), substancje słabo adsorbujące się (o mniejszym powinowactwie do adsorbenta) przesuną się na większą odległość niż substancje silnie adsorbowane (o większym powinowactwie do adsorbenta), a opisany proces nosi nazwę rozwijania chromatogramu. Powinowactwo adsorpcyjne (siłę adsorpcji) zatrzymywanej na adsorbencie substancji (adsorbatu) uzależnione jest od natury chemicznej i właściwości adsorbentu, adsorbatu oraz fazy ruchomej. Fazę ruchomą stanowi najczęściej rozpuszczalnik lub mieszanina rozpuszczalników o różnych stopniach polarności, od węglowodorów po alkohole i kwasy organiczne. Adsorbentem jest nierozpuszczalna w stosowanym układzie rozpuszczalników substancja, niereagująca z rozdzielanymi związkami. Adsorbenty można podzielić na dwie zasadnicze grupy, tj. polarne, np. żel krzemionkowy, tlenek glinowy, i niepolarne, np. węgiel aktywny, talk. Najczęściej stosowanym adsorbentem jest żel krzemionkowy, wysokoporowaty, amorficzny kwas krzemowy, którego aktywność uwarunkowana jest obecnością na jego powierzchni grup hydroksylowych. Grupy te mogą tworzyć wiązania wodorowe z polarnymi grupami rozdzielanych substancji. Termiczna aktywacja żelu (110 C) przed rozdziałem ma na celu usunięcie z jego powierzchni wody blokującej grupy hydroksylowe. Na adsorbencie polarnym zachodzi silna adsorpcja substancji o charakterze polarnym, a bardzo słaba substancji niepolarnych, w myśl zasady: im substancja bardziej polarna tym silniej adsorbuje się na powierzchni polarnego adsorbenta z niepolarnego rozpuszczalnika. Stąd droga migracji substancji bardziej polarnej jest mniejsza w stosunku do substancji mniej polarnej, słabiej adsorbowanej. Stopień adsorpcji rośnie wraz ze wzrostem liczby polarnych grup funkcyjnych oraz ilością podwójnych wiązań występujących w cząsteczce adsorbatu. Grupy funkcyjne ze względu na wzrastającą siłę oddziaływania z polarnym adsorbentem można uszeregować w następującej kolejności: -Cl < -H < -OCH 3 < -COOR < -C = O < -CHO < -NH 2 < -OH < - CONH 2 < -COOH. Na powinowactwo adsorpcyjne ma również wpływ polarność fazy ruchomej. Stosowane w chromatografii adsorpcyjnej rozpuszczalniki zostały ułożone zgodnie z wzrastająca zdolnością do wymywania zaadsorbowanych substancji, w tzw. szereg eluotropowy (od najmniej do najbardziej polarnych): eter naftowy < cykloheksan < eter etylowy < chloroform < aceton < benzen < metanol < woda < kwasy i zasady. Im większa siła elucyjna rozpuszczalnika, tym silniej wypiera on z powierzchni adsorbenta zaadsorbowane substancje. Tak więc, przepływ rozpuszczalnika powoduje przemieszczanie się rozdzielanych 2
substancji, tym szybsze, im słabsza jest adsorpcja danej substancji i większa siła elucyjna rozpuszczalnika. Prędkość wędrówki poszczególnych składników, czyli odległość, na jaką przesunęły się one od miejsca startu w określonym czasie, wyraża się tzw. współczynnikiem przesunięcia (Rf): Rf = przesunięcie badanej substancji przesunięcie czoła rozpuszczalnika Barwniki roślinne to związki nierozpuszczalne w wodzie, natomiast dobrze rozpuszczalne w rozpuszczalnikach organicznych. Należą do nich chlorofile, karoteny i ksantofile (Rys. 2). W zielonych liściach występują wszystkie wymienione barwniki, jednak chlorofili jest najwięcej i to one maskują barwę karotenoidów. Barwniki występujące w kwiatach należą do flawonoidów, wśród których szczególną rolę odgrywają antocyjany o różnym natężeniu barwy czerwonej, niebieskiej i fioletowej. Ze względu na charakter budowy (brak lub obecność polarnych grup funkcyjnych) i długość łańcuchów węglowych w cząsteczce, barwniki roślinne różnią się znacznie polarnością. Chlorofile są to związki magnezoporfirynowe zbudowane z 4 pierścieni pirolowych połączonych mostkami metinowymi z centralnie umieszczonym atomem magnezu. Z resztą propionylową występującą przy atomie węgla 7 związany jest estrowo fitol (C 20 H 39 OH), alkohol nienasycony pochodny izopentenolu. Chlorofil b różni się tym od chlorofilu a, że grupa metylowa przy atomie 3 węgla jest zastąpiona grupą aldehydową. Karotenoidy, do których należą karoteny i ksantofile, są pochodnymi izopentenylowymi. W liściach głównym składnikiem karotenowym jest β-karoten, którego cząsteczka na obu końcach zawiera pierścienie β-jononu. Karoteny α i β różnią się położeniem wiązań podwójnych w pierścieniu jononu. Ksantofile są to utlenione pochodne karotenów, zawierające w pierścieniach jononu grupy hydroksylowe, karbonylowe lub karboksylowe. Odznaczają się one jaśniejszym od karotenów, żółtym zabarwieniem. Najpowszechniej występującym ksantofilem jest luteina. W warunkach ćwiczenia, wymienione barwniki zostaną wyekstrahowane z roślin za pomocą rozpuszczalnika organicznego jakim jest aceton, następnie zostaną naniesione w postaci mieszaniny na płytkę chromatograficzną pokrytą warstwą żelu krzemionkowego i rozdzielone w kamerze zawierającej układ rozpuszczalników - eter naftowy:aceton. Do rozdziału barwników zostanie wykorzystana technika wstępująca rozwijania chromatogramu, w której rozpuszczalnik podsiąka od dołu żelu do góry dzięki działaniu sił kapilarnych. 3
Rys. 2. Wzory strukturalne podstawowych barwników roślinnych: chlorofili (A) oraz karotenoidów (B) W trakcie rozwijania chromatogramu, poszczególne związki barwne przemieszczają się z różną prędkością i układają w następującej kolejności od góry płytki: karoteny o barwie pomarańczowożółtej, feofityna (chlorofil, w którym Mg zastąpiony jest przez 2H) o barwie oliwkowobrunatnej, chlorofil a o barwie niebieskozielonej, chlorofil b o barwie żółtozielonej 4
oraz najbardziej polarne z rozdzielanych barwników ksantofile - luteina, wiolaksantyna i neoksantyna o barwie żółtej. Odczynniki 1. 96% etanol skażony acetonem 2. Żel krzemionkowy typu 60 G (60 - rozmiar porów 6 nm, G - 11 % domieszka gipsu) 3. Aceton 4. Układ rozwijający - eter naftowy:aceton (7:3) Wykonanie 1. Przygotowanie płytek chromatograficznych (jednocześnie cała grupa). 12 suchych płytek szklanych (po jednej na parę + 4 dodatkowe) o wymiarach 2,3 7,5 cm odtłuścić etanolem (1). Do małej zlewki odważyć 4,5 g żelu krzemionkowego (2), dodać 12 ml wody destylowanej i dokładnie wymieszać bagietką (porcja na 12 płytek). Z otrzymanej jednorodnej zawiesiny żelu każda para pobiera pipetą 1 ml, nanosi na odtłuszczoną płytkę i rozprowadza równomiernie po jej powierzchni za pomocą bagietki, a następnie przechylając delikatnie płytkę na boki. Powyższe czynności wykonać szybko, gdyż żel prędko krzepnie ze względu na zawartość gipsu. Sporządzoną płytkę chromatograficzną pozostawić na 15 minut na równej powierzchni stołu laboratoryjnego (powierzchnia żelu zmatowieje), po czym aktywować przez 15 minut w suszarce w temp. 110 C (aktywacja polega na usunięciu wody zaadsorbowanej na powierzchni żelu). Dodatkowe 4 płytki (na salę) wykorzystać dla przećwiczenia prawidłowego nakraplania. 2. Przygotowanie wyciągu z liści (w zespołach 4-osobowych). Odważyć 1 g liści pietruszki, rozetrzeć w moździerzu, dodać 3 ml acetonu (3) i znowu rozcierać tak szybko, aby nie wyparował rozpuszczalnik. Zawartość moździerza przesączyć przez mały zwitek watki, umieszczony w lejku, do suchej kalibrowanej probówki. Probówkę szczelnie owinąć parafilmem. 3. Nanoszenie ekstraktu barwników na płytki z adsorbentem (parami). Ekstrakt barwników (60µl) nanosić na płytkę chromatograficzną bardzo małymi kroplami w postaci pasma przyjmując, że linia startu jest oddalona 1 cm od krawędzi dolnej płytki i 0,5 cm od krawędzi bocznych. Preparat nanosić mikropipetą w trzech porcjach (3 x 20µl), za każdym 5
razem kolejną porcję ekstraktu nanieść dopiero po wyschnięciu poprzedniej. Uważać, aby podczas nakraplania ekstraktu nie naruszyć warstwy żelu końcówką mikropipety!!! 4. Rozwijanie chromatogramu (parami). Po wyschnięciu naniesionego ekstraktu, płytkę wstawić pionowo do kamery zawierającej 4,5 ml mieszaniny rozpuszczalników (4) i przykryć pokrywą. Linia naniesionych barwników musi znajdować się powyżej poziomu mieszaniny rozpuszczalników, w przeciwnym razie barwniki będą przechodziły do roztworu. Zwrócić uwagę, aby płytka w kamerze była ustawiona w pozycji możliwie dokładnie pionowej, i nie opierała się o ściany komory jedną z krawędzi bocznych, gdyż powoduje to nierównomierne wznoszenie się układu rozwijającego. Rozwijanie chromatogramu trwa ok. 20-30 minut. Płytkę wyjąć z kamery w momencie, kiedy czoło rozpuszczalnika dojdzie na odległość 0,5 cm od górnego końca płytki, i suszyć w temperaturze pokojowej pod wyciągiem przez kilka minut. Opracowanie wyników W sprawozdaniu należy przedstawić schemat ułożenia pasm barwników na rozwiniętym chromatogramie oraz podać ich zabarwienie. Przykładowe pytania 1. W jaki sposób i w jakim celu przeprowadza się aktywację żelu krzemionkowego przed rozdziałem? 2. Wyjaśnij jaki wpływ na powinowactwo adsorpcyjne rozdzielanych na żelu krzemionkowym substancji ma polarność fazy ruchomej, a jaki adsorbatu? 3. Co to jest współczynnik Rf? 4. Podaj krótką charakterystykę barwników występujących w zielonych liściach. 5. Które z barwników roślinnych, w warunkach rozdziału wykonywanego na ćwiczeniach, charakteryzują się najsłabszym powinowactwem adsorpcyjnym do żelu krzemionkowego? Uzasadnij. Literatura 1. Sherma J., Lippstone G. S. (1964). Chromatography of chloroplast pigments on preformed thin layers. J. Chrom. A 41, 220-227 2. Kacprzak F., Klimek B., Kwapińska H. (1969) Chromatografia barwników. Wydawnictwa naukowo-techniczne. Warszawa. 3. Strain H. H., Sherma J. (1969). Modifications of solution chromatography illustrated with chloroplast pigments. J. Chem. Educ. 46, 476-483. 4. Witkiewicz Z. (2000). Podstawy chromatografii. Wydawnictwo Naukowo-Techniczne. Warszawa. 6