AmpliTest Panel odkleszczowy (Real Time PCR) Zestaw do wykrywania sekwencji DNA specyficznych dla bakterii Borrelia burgdorferi, Anaplasma, Ehrlichia oraz pierwotniaków rodzaju Babesia (B. canis, B. gibsoni, B. divergens) techniką Real Time PCR Nr kat.: BAC13-50 Wielkość zestawu: 50 oznaczeń Objętość pojedynczej reakcji: 20 µl Limit detekcji: 6 kopii DNA Przed użyciem zestawu należy uważnie zapoznać się z niniejszą instrukcją. Amplicon sp. z o. o. ul. Duńska 9 54-427 Wrocław Polska, NIP: 8943052339, KRS: 0000501830 www.amplicon.pl email: contact@amplicon.pl, tel. +48 71 733 67 06, fax +48 71 733 67 24
ZASTOSOWANIE Zestaw AmpliTest Panel odkleszczowy (Real Time PCR) jest przeznaczony do wykrywania sekwencji specyficznych dla bakterii z grupy Borrelia burgdorferi, bakterii z rodzaju Anaplasma oraz Ehrlichia, a także wybranych gatunków pierwotniaków rodzaju Babesia (B. canis, B. gibsoni, B. divergens) w preparatach DNA uzyskanych z tkanek zwierzęcia (kleszcza, ssaka). W celu uniknięcia problemów z wydajnością reakcji Real Time PCR preparaty DNA powinny być przygotowane przy użyciu metod pozwalających otrzymać wysokiej jakości DNA pozbawiony inhibitorów reakcji PCR. Zalecane są zestawy do izolacji DNA oparte o złoża krzemionkowe (tzw. zestawy kolumienkowe). ZAKRES STOSOWANIA Diagnostyka weterynaryjna in vitro Badania i rozwój (B+R) SKŁADNIKI ZESTAWU Nazwa Opis Ilość Kolor wieczka RM Mieszanina reakcyjna 2 300 µl Zielony PC Kontrola pozytywna 2 50 µl Czerwony NC Kontrola negatywna 2 50 µl Niebieski Woda Woda 2 300 µl Biały TRANSPORT i PRZECHOWYWANIE Transport odbywa się w suchym lodzie. Po otrzymaniu przesyłki należy ją natychmiast rozpakować. Składniki testu przechowywać -20 C. UNIKAĆ EKSPOZYCJI SKŁADNIKA RM NA ŚWIATŁO; Unikać wielokrotnego zamrażania i rozmrażania składników testu w szczególności składnika RM. Trzy cykle zamrożenia i rozmrożenia składnika RM nie wpływają znacząco na jakość wyników. WSKAZÓWKA: na etykietach probówek zawierających składnik RM znajdują się pola, w których można zaznaczać ilość rozmrożeń danej porcji. Nie używać składników testu po upływie daty przydatności do użycia. 2
ZASADA DZIAŁANIA Zestaw AmpliTest Panel odkleszczowy (Real Time PCR) zawiera startery namnażające fragmenty genomów badanych patogenów. Detekcja obecności DNA charakterystycznego dla wykrywanych patogenów następuje dzięki specyficznym sondom typu TaqMan, które przyłączając się do powstających amplikonów (powielanych fragmentów DNA) ulegają hydrolizie. Podczas hydrolizy z sond uwalniane są barwniki fluorescencyjne FAM, Cy5 oraz Texas Red, który są następnie wykrywane przez układ optyczny aparatu do Real Time PCR. Odpowiednio dobrane sekwencje starterów i sond zapewniają wysoką specyficzność reakcji. W celu zwiększenia wiarygodności wyników Zestaw AmpliTest Panel odkleszczowy (Real Time PCR) zawiera kontrolę wewnętrzną (egzogenny fragment DNA) oraz układ starterów i sondy do jej namnożenia i detekcji. Detekcja kontroli wewnętrznej odbywa się dzięki uwalnianiu przez sondę barwnika fluorescencyjnego HEX. Obecność kontroli wewnętrznej pozwala na monitorowanie prawidłowego przebiegu reakcji Real Time PCR. Amplifikacja kontroli wewnętrznej nie wpływa na wydajność wykrywania sekwencji specyficznej dla oznaczanych patogenów. Pozytywny wynik kontroli wewnętrznej stanowi potwierdzenie prawidłowego przebiegu reakcji Real Time PCR. POTRZEBNY SPRZĘT I DODATKOWE MATERIAŁY Aparat do Real Time PCR: LightCycler 480 (Roche) LightCycler 96 (Roche) RotorGene 3000/6000 (Qiagen) Inne urządzenia umożliwiające detekcję barwników fluorescencyjnych FAM, HEX, Cy5 oraz Texas Red. Zestaw AmpliTest Panel odkleszczowy (Real Time PCR) nie zawiera barwnika normalizacyjnego ROX. Dodanie barwnika ROX do mieszaniny reakcyjnej nie jest możliwe, gdyż odpowiadający mu kanał detekcji jest 3
zarezerwowany dla barwnika Texas Red uwalnianego przez sondę wykrywającą sekwencję specyficzną dla bakterii Anaplasma/Ehrlichia. Probówki reakcyjne (próbówki PCR, płytki PCR, kapilary w zależności od posiadanego urządzenia do Real Time PCR) Wirówka do probówek reakcyjnych Wirówka stołowa Pipety automatyczne w zakresie 1-1000 µl Sterylne końcówki z filtrami do pipet automatycznych Zestaw do izolacji DNA W zależności od użytego zestawu do izolacji DNA może być potrzeby dodatkowy sprzęt i materiały. IZOLACJA DNA Z poszczególnych osobników pobrać fragmenty tkanek, a następnie wyizolować DNA. Ilość potrzebnego materiału zależy od użytej metody izolacji DNA. Do izolacji DNA zaleca się stosowanie zestawów opartych o złoża krzemionkowe (tzw. zestawów kolumienkowych), gdyż zapewniają one uzyskanie próbek DNA o odpowiedniej jakości pozbawionych inhibitorów reakcji PCR. W przypadku innych metod izolacji preparat DNA może zawierać związki, które istotnie zmniejszają wydajność reakcji PCR. Prowadzi to do obniżenia czułości testu, a w skrajnych przypadkach do braku amplifikacji DNA. Próbki DNA należy przechowywać w +4 C (krótki okres przechowywania) lub w -20 C (długi okres przechowywania). REAKCJA REAL TIME PCR 1. Określić liczbę próbek DNA poddawanych analizie (n). 2. Rozmrozić składniki testu. Po rozmrożeniu składników dokładnie wymieszać zawartość probówek i krótko je zwirować. Składniki po rozmrożeniu przechowywać w +4 C lub na lodzie. UNIKAĆ EKSPOZYCJI składnika RM NA ŚWIATŁO. 3. Określić ilość DNA dodawanego do reakcji (x µl). Optymalna ilość DNA w reakcji wynosi 100-200 ng. Ilość DNA dodawanego do reakcji nie powinna przekroczyć 400 ng. Duże ilości DNA dodanego do reakcji PCR 4
hamują aktywność polimerazy DNA i obniżają czułość testu. Typowo 100-200 ng DNA jest zawarte w 1-5 µl próbki DNA uzyskanej przy użyciu zestawu kolumienkowego. 4. Dokładnie wymieszać ze sobą (n + 3) 12 µl mieszaniny reakcyjnej RM oraz (n + 3) (8 - x) µl wody. 5. Do n + 2 probówek reakcyjnych (probówek PCR, kapilar, studzienek na płytce) nanieść po (20 x) µl przygotowanej mieszaniny. 6. Do n probówek reakcyjnych dodać po x µl przygotowanych preparatów DNA. Do jednej z pozostałych dwóch próbówek reakcyjnych dodać kontrolę negatywną NC, a do drugiej kontrolę pozytywną PC. UWAGA: kontrolę pozytywną należy dodać jako ostatnią. 7. Zamknąć probówki reakcyjne, a następnie krótko je zwirować. 8. Probówki reakcyjne umieścić w aparacie do Real Time PCR i wykonać reakcję według następującego protokołu: Denaturacja wstępna Amplifikacja (45 cykli) Schłodzenie aparatu 95 C 5 min 95 C 10 s 60 C 50 s* 30-40 C 30s (zależnie od typu aparatu) *Na końcu tego etapu ustawić odczyt fluorescencji w kanałach dla FAM, HEX, Cy5 oraz Texas Red. Kanał dla FAM służy do wykrywania sekwencji specyficznej dla bakterii z grupy Borrelia burgdorferi, kanał Cy5 do wykrywania sekwencji specyficznej dla wybranych pierwotniaków rodzaju Babesia, na kanale Texas Red wykrywa się sekwencje specyficzną dla bakterii z rodzaju Anaplasma i Ehrlichia. Kanał dla HEX służy do wykrywania kontroli wewnętrznej. 5
Borrelia burgdorferi Anaplasma/Ehrlichia Babesia Kontrola wewnętrzna Opis wyników w tekście poniżej INTERPRETACJA WYNIKÓW L.p. Rodzaj próbki FAM Texas Red Cy5 HEX Wynik 1 Kontrola pozytywna + + + + Prawidłowy 2 Kontrola negatywna - - - + Prawidłowy 3 Oznaczenie 1 + - - + 4 Oznaczenie 2 - + - + 5 Oznaczenie 3 - - + + 6 Oznaczenie 4 + - + + 7 Oznaczenie 5 - + + + 8 Oznaczenie 6 + + - + 9 Oznaczenie 7 + + + + 10 Oznaczenie 8 - - - + Wykrywane sekwencje Oznaczenia 1-3 wyniki dodatnie wskazujące na obecność w preparacie DNA jednego oznaczanego patogenu; Oznaczenia 4-6 wyniki dodatnie wskazujące na obecność w preparacie DNA dwóch oznaczanych patogenów; Oznaczenie 7 wynik dodatni wskazujący na obecność w preparacie DNA wszystkich trzech oznaczanych patogenów; Oznaczenie 8 wynik ujemny. Brak odczytu w kanale dla HEX* oznacza, że reakcja Real Time PCR nie przebiegła w sposób prawidłowy. Jednoczesny brak pozytywnego odczytu fluorescencji w kanałach dla badanych próbek w przypadku kontroli pozytywnej i negatywnej wskazuje na złą jakość Zestawu AmpliTest Panel odkleszczowy (Real Time PCR) (niewłaściwe przechowywanie, transport, wygaśnięcie terminu przydatności do użycia itp.). Pozytywny odczyt fluorescencji w kanale dla HEX w przypadku kontroli pozytywnej i negatywnej i brak pozytywnego odczytu dla badanych próbek DNA oznacza złą jakość próbek DNA (obecność związków hamujących reakcję PCR) lub zbyt dużą ilość DNA użytego w reakcji. W tym 6
przypadku należy do reakcji dodać mniejszą objętość próbki DNA, jednocześnie dodając taką objętość wody, aby końcowa objętość reakcji wynosiła 20 µl. *Przy bardzo wysokim mianie bakterii/pierwotniaków może wystąpić brak odczytu w kanale HEX przy jednoczesnym odczycie w kanale FAM/Cy5/Texas Red. Zaleca się wtedy powtórzenie reakcji z zmniejszoną (10-100-krotnie) ilością DNA dodanego do reakcji. UWAGI DODATKOWE Zastosowane sondy TaqMan posiadają wygaszacze (Quenchers) typu BHQ (Black Hole Quencher ), które nie generują dodatkowych sygnałów fluorescencyjnych. W aparatach, które tego wymagają (np. RotorGene 6000), jako typ wygaszacza należy wybrać opcję none. Przygotowany test wykrywa powyżej 6 kopii bakteryjnego DNA obecnych w dodawanej próbce. Preparaty DNA uzyskane z pojedynczych osobników można ze sobą pulować i wykorzystywać w pojedynczym oznaczeniu. W tym celu równe objętości preparatów DNA (np. 10 µl) przeznaczonych do pulowania należy ze sobą dokładnie wymieszać i użyć jako matrycy w reakcji Real Time PCR. Pulowaniu można również poddawać kleszcze, tj. izolować DNA z kilku osobników jednocześnie. Należy jednak pamiętać, że pulowanie preparatów DNA zmniejsza możliwość uzyskania pozytywnego wyniku w przypadku próbek zawierających niewielką ilość bakterii. Nie stosować objętości reakcji mniejszych niż 20 µl. Zmniejszenie objętości reakcji powoduje znaczące zmniejszenie czułości testu. Należy zachować szczególną ostrożność podczas izolacji DNA, a materiał biologiczny uzyskany od chorych zwierząt traktować jako potencjalnie zakażony. Izolację DNA oraz detekcję obecności patogenów powinien wykonać odpowiednio przeszkolony personel w laboratorium spełniającym odpowiednie wymogi i dopuszczonym do pracy z zakażonym materiałem biologicznym. Należy zwrócić szczególną uwagę, aby podczas izolacji DNA nie doszło do krzyżowego zanieczyszczenia próbek DNA izolowanych równolegle. W celu maksymalnego wyeliminowania fałszywych wyników powinno się przestrzegać następujących zasad: - w miarę możliwości wyznaczyć osobne stanowiska do izolacji DNA, przygotowania reakcji Real Time PCR oraz jej wykonania/analizy; 7
- pomiędzy etapami izolacji DNA, przygotowania reakcji Real Time PCR należy dokonać zmiany odzieży laboratoryjnej (fartucha) oraz zmiany rękawiczek jednorazowych; - powierzchnię stanowisk do izolacji DNA i przygotowania reakcji Real Time PCR należy przemywać środkami usuwającymi/niszczącymi DNA; - do pipet automatycznych należy stosować wyłącznie sterylne końcówki z filtrem; - podczas przygotowywania reakcji Real Time PCR kontrolę pozytywną PC należy dodać jako ostatnią. Przed jej dodaniem, w miarę możliwości, należy zamknąć probówki z dodanymi próbkami DNA i kontrolą negatywną NC. TaqMan jest znakiem towarowym zastrzeżonym dla Applied Biosystems, Inc. LightCycler jest znakiem towarowym zastrzeżonym dla Roche Diagnostics GmbH. Black Hole Quencher jest znakiem towarowym zastrzeżonym dla Biosearch Technologies, Inc. Texas Red jest znakiem towarowym zastrzeżonym dla Molecular Probes, Inc. Cy5 jest znakiem towarowym zastrzeżonym dla Amersham Biosciences Corp. 8