432 Probl Hig Epidemiol 2012, 93(2):

432 Probl Hig Epidemiol 2012, 93(2): 432-439 Stężenie askorbinianu i homocysteiny w osoczu a aktywność czerwonokrwinkowych enzymów antyoksydacyjnych u chorych z przewlekłą lub schyłkową niewydolnością nerek Ascorbate and homocysteine concentrations in the plasma and erythrocytes antioxidant enzymes activity of patients with the chronic or end stage renal insufficiency Agata Pietrzycka 1/, Eve Grzybowska-Chowaniec 2/, Marek Stępniewski 1/, Monika Głuch-Lutwin 1/, Przemysław Miarka 2/, Władysław Sułowicz 2/ 1/ Zakład Radioligandów Katedry Farmakobiologii, Wydział Farmaceutyczny, Collegium Medicum, Uniwersytet Jagielloński w Krakowie 2/ Katedra i Klinika Nefrologii, Wydział Lekarski, Collegium Medicum, Uniwersytet Jagielloński w Krakowie Cel pracy, materiał i metoda. Oznaczenie u pacjentów z przewlekłą i schyłkową niewydolnością nerek poziomów kwasu askorbowego i homocysteiny w osoczu, oznaczenie całkowitej zdolności zmiatania rodnika DPPH, a także aktywności SOD i CAT w hemolizatach krwinek czerwonych oraz porówanie w grupach z prawidłowym i wysokim stężeniem kwasu askorbowego. Wyniki porównano do grupy pacjentów wydolnych nerkowo, dobranych wiekiem do grupy z niewydolnością nerek. Wyniki. W badanych grupach kobiet i mężczyzn w wieku 46-70 lat, wysokie stężenia kwasu askorbowego, przewyższające stężenia fizjologiczne (powyżej 68 µmol/l) związane były ściśle z przebiegiem choroby. Zaobserwowano wyższe stężenie askorbinianu w osoczu pacjentów z przewlekłą lub schyłkową niewydolnością nerek, przy czym znamiennie wyższą wartość stwierdzono w grupie kobiet (p 0.001) niż mężczyzn. W grupie chorych z niewydolnościami nerek stwierdzono spadek RSDPPH do granicznej wartości 30%. Stężenia Hcy były również wyższe, choć nieznamiennie, w grupach kobiet z podwyższonym stężeniem askorbinianu i istotne statystycznie w grupie mężczyzn. Wykazano, że w grupie pacjentów z przewlekłą lub schyłkową niewydolnością nerek, wit. C w osoczu wydaje się korelować bezpośrednio z poziomem homocysteiny oraz fibrynogenu. W grupie chorych z prawidłową czynnością nerek stwierdzono bezpośredni związek poziomu askorbinianu z przebiegiem choroby niedokrwiennej serca oraz aktywnością enzymów antyoksydacyjnych. Wniosek. Warto rozważyć suplementację kwasem askorbinowym tylko u tych chorych u których stwierdzono niedobór antyoksydantów, lub u których zaobserwowano wysoki poziom wskaźników stresu oksydacyjnego (np. niską zdolność zmiatania rodnika DPPH). Aim, material & method. Determination of ascorbic acid and homocysteine levels, total capacity of scavenging DPPH radicals (RSDPPH) in plasma, as well as antioxidant enzymes activities in erythrocytes hemolisates of patients with chronic renal failure. The results were compared with the subjects with sufficient renal function, matched in age and cardiovascular diseases. Results. In the studied groups of women and men high concentrations of ascorbic acid, in excess of physiological concentrations (above 68 µmol/l) were associated closely with the course of the disease. It was observed that concentrations of ascorbate in the plasma of patients with chronic or end stage renal disease, were significantly higher in women (p 0.001) than in men. In patients RSDPPH was found to be decreased to the lower limit 30%. The Hcy concentrations were higher, in groups of women and in men. It was shown that in patients with chronic or end stage renal disease, ascorbate appears to correlate directly with the level of homocysteine and fibrinogen. In patients with sufficient renal function, the level of ascorbate directly corelated with the course of coronary artery disease and activity of antioxidant enzymes. Conclusion. The supplementation with ascorbic acid is worth to be taken into consideration only in the patients with decreased antioxidant levels, or high levels of oxidative stress markers. Key words: ascorbate, homocysteine, antioxidant enzymes, renal insufficiency Słowa kluczowe: askorbinian, homocysteina, enzymy antyoksydacyjne, niewydolność nerek Probl Hig Epidemiol 2012, 93(2): 432-439 www.phie.pl Nadesłano: 30.10.2011 Zakwalifikowano do druku: 24.02.2012 Adres do korespondencji / Address for correspondence Agata Pietrzycka Uniwersytet Jagielloński, Zakład Radioligandów ul. Medyczna 9, 30-688 Kraków, e-mail: apietrzy1@cm-uj.krakow.pl

Pietrzycka A i wsp. Stężenie askorbinianu i homocysteiny w osoczu a aktywność czerwonokrwinkowych enzymów... 433 Wstęp U pacjentów z przewlekłą niewydolnością nerek występuje zarówno wzmożona produkcja reaktywnych form tlenu, jak i obniżona efektywność enzymatycznych i nieenzymatycznych układów antyoksydacyjnych. Schyłkowy okres niewydolności nerek wymaga leczenia nerkozastępczego dializoterapii, która może dodatkowo nasilać stres oksydacyjny, głównie w wyniku kontaktu krwinek czerwonych z błoną dializatora. Obrona antyoksydacyjna krwinek czerwonych jest utrzymana przez enzymatyczne i nie-enzymatyczne układy w obrębie cytoplazmy komórek, błonowy układ antyoksydacyjny (plasma membrane redox system PMRS) jak również układy antyoksydacyjne przestrzeni międzykomórkowych i osocza. Nieenzymatyczne układy antyoksydacyjne obejmują całkowity potencjał antyoksydacyjny, stanowiący wypadkową działania niskocząsteczkowych antyoksydantów (np. kwasu moczowego, albuminy, fibrynogenu) oraz PMRS. W obrębie błonowego układu antyoksydacyjnego działają reduktaza cytochromu b 5, oksydoreduktaza-1 NADH, wchodzące w skład błon komórkowych antyoksydanty hydrofilne (kwas askorbinowy), glutation i inne tiole (cysteina, grupy SH koenzymu a) oraz antyoksydanty lipofilne (α-tokoferole) [1]. Pierwszą linię obrony przed reaktywnymi formami tlenu (RFT) stanowią antyoksydanty enzymatyczne. Dysmutaza ponadtlenkowa przekształca anionorodnik nadtlenkowy do nadtlenku wodoru. Nadtlenek wodoru z kolei jest rozkładany przez katalazę i peroksydazę glutationową [25, 26]. W reakcji peroksydazy glutationowej, glutation jest utleniany do dwusiarczku glutationu, z którego reduktaza glutationowa odtwarza glutation. Dzięki czemu wszystkie enzymy antyoksydacyjne i antyoksydanty drugorzędowe stanowią całkowicie zintegrowany układ, który przeciwdziała stresowi oksydacyjnemu, rozwijającemu się pod wpływem wolnych rodników tlenowych. Glutation jest głównym niskocząsteczkowym antyoksydantem erytrocytów. Obniżone stężenie zredukowanego glutationu obserwowane w przewlekłej niewydolności nerek, prowadzi do nasilania się peroksydacji lipidów i białek błony komórkowej erytrocytów oraz do oksydacyjnej denaturacji hemoglobiny z powstaniem ciałek Heinza, powodując zwiększoną podatność erytrocytów na hemolizę [2]. Dla syntezy GSH w erytrocytach konieczny jest aminokwas L-cysteina. Dlatego obniżony poziom i w związku z tym mniejszy napływ z L-cysteiny do krwinki czewronej może być ważnym czynnikiem przyczyniającym się do rozwoju stresu oksydacyjnego [3]. Badania epidemiologiczne i kliniczne prowadzone w ciągu ostatnich lat dowiodły, że kolejnym ważnym czynnikiem związanym z powikłaniami stresu oksydacyjnego u pacjentów z niewydolnością nerek lub cukrzycą prowadzącym m.in. do miażdżycy jest poziom homocysteiny w osoczu. Poziom homocysteiny w osoczu wzrasta wraz z wiekiem i związany jest przede wszystkim z stylem życia, dietą lub paleniem papierosów [4]. Ponadto stwierdzono, że hiperhomocysteinemia jest ściśle związana z wzrostem ryzyka zgonu z powodu chorób układu krążenia [5]. W wyniku autooksydacji cząsteczek Hcy-SH powstają mieszane disulfidy homocyteiny, tiolaktony oraz produkty połączenia homocysteiny do białek, które uszkadzają komórki śródbłonka naczyniowego [6, 7]. Szczególnie ciekawą obserwacją wydaje się kumulacja S-nitrozo pochodnych homocysteiny w miejscach zaburzeń przepływu krwi, w rozgałęzieniach naczyń krwionośnych lub w pobliżu narastającej blaszki miażdżycowej [8]. Równowaga pomiędzy układami antyoksydacyjnymi osocza a błonowym układem antyoksydacyjnym erytrocytów zależy od właściwości antyoksydacyjnych i stężenia askorbinianu. Dowiedziono że witamina C odgrywa ważną rolę w utrzymaniu równowagi antyoksydacyjnej m.in. w cukrzycy typu 2 [9] oraz w procesie starzenia [10, 11]. Suplementacja kwasem askorbinowym zalecana jest pacjentom z niewydolnością nerek i z niedokrwistością z niedoboru żelaza, leczonych erytropoetyną w celu zapobiegania oporności na erytropoetynę. Injekcje witaminy C przed hemodializą z zastosowaniem niemodyfikowanej błony celulozowej, zapobiegały peroksydacji lipidów erytrocytów, głównie w wyniku odtworzenia witaminy E z rodnika α-tokoferolowego w warstwie lipidowej błon komórkowych [12-14]. W badaniach przedstawionych przez Carr A. oraz Frei B. [15] witamina C zmniejszała zarówno in vivo jak i ex vivo poziom wskaźników oksydacji lipoprotein. Obserwowano obniżenie poziomu anionorodnika ponadtlenkowego i poziomu utlenionego cholesterolu o niskiej gęstości (ox-ldl). W innym badaniu z kolei stwierdzono obniżenie S-nitrozotioli po podaniu witaminy C [16]. Zażywanie witaminy C w dawce niższej niż dawki rekomendowane związane może być z wzrostem poziomu produktów oksydacji DNA komórki, ale paradoksalnie zbyt wysokie dawki askorbinianu również mogą powodować oksydacyjne uszkodzenie kwasów nukleinowych [17]. Wysoce prawdopodobnym jest że zbyt niskie lub zbyt wysokie stężenia witaminy C oraz związane z tym zaburzenie równowagi antyoksydacyjnej pomiędzy składnikami błonowym układem antyoksydacyjnym krwinek czerwonych (PMRS) a osoczem prowadzi do rozwoju stresu oksydacyjnego leżącego u podstaw rozwoju powikłań chorobami układu krążenia w prze-

434 Probl Hig Epidemiol 2012, 93(2): 432-439 biegu przewlekłęj i schyłkowej niewydolności nerek. Stres oksydacyjny może być spotegowany przez wysoki poziom homocysteiny w osoczu. Cel pracy Oznaczenie w krwi uzyskanej od pacjentów z przewlekłą i schyłkową niewydolnością nerek poziomów kwasu askorbowego i homocysteiny w osoczu, a także aktywności enzymów antyoksydacyjnych cynkowo-miedziowej dysmutazy ponadtlenkowej i katalazy w hemolizatach krwinek czerwonych i porówanie wyników w grupach z prawidłowym i wysokim stężeniem kwasu askorbowego. Wyniki porównano również w odniesieniu do grupy pacjentów wydolnych nerkowo, dobranych wiekiem do grupy z niewydolnością nerek. Materiał badawczy i metoda Badaniami objęto 47 chorych z przewlekłą (stadium 3-4) i schyłkową niewydolnością nerek (stadium 5) leczonych w Klinice Nefrologii Szpitala Klinicznego CM UJ w Krakowie w wieku 46-66 lat. 51% z nich stanowiły kobiety a 49% stanowili mężczyźni. Do badań jako grupę kontrolną włączono 45 pacjentów Oddziału Angiologii i Kardiologii (II Katedry Chorób Wewnętrznych i Kliniki Alergii i Immunologii CM UJ), dobranych wiekiem i z prawidłową czynnością nerek, ale z chorobami układu krążenia lub z cukrzycą, z czego 47% stanowiły kobiety, a 53% mężczyźni. Do badań zostali włączeni pacjenci po uzyskaniu od nich pisemnej zgody na badania, które zostały zaakceptowane przez Komisję Bioetyczną UJ CM; nr zgody KBET/48/B/2008. Materiał do badań stanowiła krew żylna pobrana na K3-EDTA, na czczo, w trakcie rutynowych badań lekarskich. We krwi osób badanych oznaczono parametry czerwonokrwinkowe (RBC, WBC, Ht, Hb, MCHC) płytkowe (PLT, MPV) oraz mocznik, kreatyninę, cholesterol całkowity, trójglicerydy, glukozę, kwas moczowy, fibrynogen, homocysteinę. Próbki krwi żylnej, transportowano w lodzie, w probówkach osłoniętych folią przed działaniem światła. W czasie do dwóch godzin od momentu pobrania próbki krwi zwirowano przy 1800 obrotów/ min przez 15 minut, oddzielono osocze a następnie z krwinek czerwonych przygotowano hemolizaty w stosunku 1:20. Próbki przed ozaczeniem przechowywano nie dłużej niż jeden miesiąc. W osoczu oznaczono spektrofotometrycznie stężenie kwasu askorbinowego na podstawie zdolności askorbinianów do redukcji jonów żelaza III do jonów żelaza II (Ferric Reducing Ability of Ascorbate in Plasma FRASC) wg metody I. Benzie [18]. Całkowitą zdolność antyoksydacyjną osocza zmierzono na podstawie zdolności zmiatania rodnika DPPH metodą podaną przez Janaszewską i in. [19, 20]. Stężenie całkowitej niezwiązanej homocyteiny mierzono kolorymetrycznie na podstawie reakcji grup SH z pochodną 7-trifluorometylo-4-chloro-N-metylochinoliny [21]. W hemolizatach krwinek czerwonych oznaczenie aktywności cynkowo-miedziowej dysmutazy ponadtlenkowej (CuZn-SOD) wykonano w oparciu o metodę Douglas a R. Spitz a i Larre go W. Oberley a [22, 23], natomiast aktywność katalazy zmierzono wg metody zaproponowanej przez Aebi [24]. Rożnice zmienności między grupami oceniono jednoczynnikową analizę wariancji ANOVA, czyli analizę wpływu tylko jednego czynnika na wyniki przeprowadzanego badania. W analizie tej zastosowano metodę T (test Tukey a) poszukiwania różnicy dla nierównych liczności (HSD). Wnioskowanie przeprowadzono na poziomie istotności α=0,05. Zależności między zmiennymi zbadano za pomocą wieloczynnikowej analizy danych analizy skupień. W analizie skupień dane pogrupowano w skupiska, w oparciu o odległości euklidesowe i regułę amalgamacji/wiązania metodą Warda. Analizę statystyczną danych wykonano z wykorzystaniem pakietu oprogramowania do analiz statystycznych StatSoft Statistica v. 9.0. Wyniki Hiperglikemia lub cukrzyca występowały u 22 pacjentów grupy kontrolnej (55%), natomiast wśród osób z niewydolnością nerek cukrzycę lub hiperglikemię stwierdzono ą u 25% chorych. W grupie badanej najczęstsze choroby układu sercowo-naczyniowego to: nadciśnienie tętnicze (45% przypadków) oraz choroba niedokrwienna mięśnia sercowego (43% przypadków). U 37% występowały obie jednostki chorobowe równocześnie. Ponadto, w tej grupie pacjentów, hipercholesterolemia występowała u 30% badanych, hiperhomocysteinemia u 53%, natomiast podwyższony poziom fibrynogenu stwierdzono u 33% przypadków. Spośród pacjentów objętych badaniem, 80% w grupie kontrolnej deklarowało, że nie pali papierosów a w grupie badanej 9% (tab. I). Wyniki badań ogólnych we krwi osób badanych przedstawiono w tabeli II. Zaobserwowano wyższe stężenie askorbinianu w osoczu pacjentów z przewlekłą lub schyłkową niewydolnością nerek, przy czym znamiennie wyższą wartość stwierdzono w grupie kobiet (p 0.001) (ryc. 1). Wartości FRASC powyżej 68.0 µmol/l występowały

Pietrzycka A i wsp. Stężenie askorbinianu i homocysteiny w osoczu a aktywność czerwonokrwinkowych enzymów... 435 Tabela. I. Ogólna charakterystyka kohort badanych pacjentów Table I. General characteristics of cohorts of studied patients Czynniki ryzyka % przypadków w grupie Pacjenci wydolni nerkowo (n = 45) Pacjenci z przewlekłą lub schyłkową niewydolnością nerek (n = 47) Płeć Kobiety n = 21 47.0% n = 24 51.0% Mężczyźni n = 24 53.0% n = 23 49.0% Cukrzyca lub hiperglikemia n = 22 49.0% n = 12 25.0% Nadciśnienie tętnicze n = 38 55.0% n = 29 45.0% Choroba niedokrwienna n = 27 60.0% n = 20 43.0% m. sercowego, choroba wieńcowa Hipercholesterolemia n = 16 36.0% n = 14 30.0% Hiperhomocysteinemia n = 26 58.0% n = 25 53.0% Hiperfibrynogenemia n = 15 33.0% n = 10 21.0% Nikotynizm / Paczkolata n=9 20.0% n=4 9.0% /20.5 /5.6 paczkolat paczkolat Tabela II. Ogólne parametry biochemiczne badanych pacjentów Table II. General biochemical parameters of studied patients Parametr Pacjenci wydolni nerkowo (n=45) Mediana Dolny-Górny Kwartyl Pacjenci z przewlekłą lub schyłkową niewydolnością nerek (n= 47) Dolny-Górny Mediana Kwartyl Wiek w chwili R 62.0 56.0-70.0 R 51.0 46.0-66.0 badania K 68.0 61.0-74 K 56.0 41.0-70.0 M 58.0 52.0-68.0 M 49.0 46.0-66.0 Ciśnienie skurczowe R 140.0 130.0-150.0 R 130.0 120.0-145.0 mm Hg K 140.0 140.0-150.0 K 130.0 120.0-142.0 M 140.0 130.0-160.0 M 138.0 130.0-150.0 Ciśnienie R 80.0 80.0-90.0 R 80.0 75.0-90.0 rozkurczowe K 80.0 75.0-90.0 K 80.0 80.0-90.0 mm Hg M 90.0 80.0-92.5 M 80.0 75.0-90.0 BMI R 29.4 25.2-33.0 R 28.7 22.9-31.2 K 29.6 25.8-32.4 K 29.0 24.4-31.5 M 28.7 24.9-33.1 M 26.4 22.5-30.0 Cholesterol całkowity R 5.9 5.1-7.6 R 5.4 4.5-7.0 mmol/l K 5.1 4.9-7.4 K 6.2 4.7-7.6 M 6.8 5.9-7.6 M 4.5 3.2-5.8 Triglicerydy R 2.8 2.4-9.0 R 2.0 1.2-2.6 mmol/l K 2.4 2.2-7.9 K 2.0 1.4-2.4 M 5.9 2.8-9.0 M 2.3 1.2-3.4 Glukoza R 5.4 4.8-6.4 R 5.1 4.9-5.9 mmol/l K 5.5 5.0-6.5 K 5.1 4.5-6.0 M 5.4 4.8-6.7 M 5.2 4.9-5.8 Kwas moczowy R 332.5 250.0-355.2 R 355.1 351.0-396.0 µmol/l K 285.5 225.0-355.2 K 355.1 346.5-398.0 M 348.0 307.0-356.8 M 371.0 349.1-386.0 Fibrynogen g/l R 3.3 2.8-4.5 R 4.0 3.1-5.7 K 2.9 2.5-3.3 K 3.6 2.9-5.6 M 4.5 3.7-4.8 M 5.2 3.8-6.1 Hcy-SH µmol/l R 9.1 8.6-9.8 R 9.8 8.9-11.4 K 9.0 8.6-9.7 K 9.6 8.8-10.7 M 9.1 8.5-10.0 M 11.4 9.6-14.9 Ryc. 1. Wykres pudełkowy porównujący stężenie witaminy C wyrażone jako FRASC (Ferric Reducing Ability of Ascorbate) w osoczu: A] między pacjentami z prawidłową funkcją nerek (Pacjenci WN) a grupą pacjentów z przewlekłą lub schyłkową niewydolnością nerek (Pacjenci PSchNN); B] między kobietami i mężczyznami w badanych grupach. Na wykresie linie poziome pogrubione przedstawiają wartości median, pudełka 25-75% natomiast wąsy wartości minimalne i maksymalne (Min-Maks). Prostokąt zaznaczony strzałką odpowiada wartościom referencyjnym stężenia askorbinianu w osoczu: 30.0-68.0 µmol/l Fig. 1. Box plot comparing ascorbic acid concentration in plasma expressed as FRASC (Ferric Reducing Ability of Ascorbate) between men and women in the group of patients with chronic renal failure and in patients with sufficient renal function u 57% pacjentów z niewydolnością nerek (głównie kobiet), natomiast w grupie kontrolnej wysoki FRASC stwierdzono u 27% pacjentów z prawidłową czynnością nerek (głównie mężczyzn). Różnice w stężeniu askorbinianu mogą być spowodowane suplementowaniem wit. C w grupie chorych z niewydolnością nerek. U 49 % chorych podaje się erytropoetynę, a u tych chorych suplementacja kwasem askorbowym ma zapobiegać oporności na erytropoetynę. Podwyższone stężenie askorbinianu wynika z podawania chorym witaminy C przed dializą lub też może być konsekwencją stylu życia tej grupy chorych dieta (chorzy zjadają regularnie owoce i warzywa) i niepalenie papierosów. Askorbinian należy do niskocząsteczkowych ale najsilniej działających antyoksydantów. Niestety w wysokich stężeniach, przekraczających fizjologiczne stężenie 68.0 µmol/l, pod wpływem innych reaktywnych form tlenu oraz wolnych rodników powstają rodniki askorbinianu, które mogą potęgować stres oksydacyjny. W konsekwencji obserwowano zmniejszenie zdolności zmiatania rodnika DPPH (Radical Scavenging of DPPH RSDPPH) w osoczu kobiet i mężczyzn obydwu grup. W grupie chorych z niewydolnościami nerek stwierdzono spadek RSDPPH do granicznej wartości 30.0% (ryc. 2). U pacjentów z grupy kontrolnej i grupy z niewydolnością nerek ale z wysokim FRASC stwierdzono niższe aktywności enzymów antyoksydacyjnych niż w podgrupach z fizjologicznym stężeniem askorbinianu (ryc. 3). U kobiet i mężczyzn z przewlekłą niewydolnością nerek, u których FRASC w osoczu mieścił się w wartościach prawidłowych, aktywności dysmutazy

436 Probl Hig Epidemiol 2012, 93(2): 432-439 ponadtlenkowej i katalazy były w normie i nie różniły się między sobą. W próbkach przypadków z wartościami FRASC powyżej 68.0 µmol/l, aktywności obydwu enzymów antyoksydacyjnych były niższe o około 50%. W grupie kobiet i mężczyzn z prawidłową czynnością nerek, aktywność SOD była znamiennie niższa niż w grupie pacjentów z niewydolnością nerek (p 0.02). Wysoki poziom askorbinianu spowodował spadek aktywności SOD o 20% w hemolizatach erytrocytów kobiet, i o 16% u mężczyzn. Ryc. 2. Wykres pudełkowy porównujący zdolność zmiatania rodnika DPPH w osoczu: między kobietami i mężczyznami w grupie pacjentów z prawidłową czynnością nerek i w grupie chorych z przewlekłą lub schyłkową niewydolnością nerek. Na wykresie linie poziome pogrubione przedstawiają wartości median, pudełka 25-75% natomiast wąsy wartości minimalne i maksymalne (Min-Maks) Fig. 2. Box plot comparing total capacity of scavenging DPPH radicals (RSDPPH) in plasma between men and women in the group of patients with chronic renal failure and in patients with sufficient renal function Porównanie stężenia homocysteiny w osoczu (ryc. 4) wykazało znamiennie statystycznie wyższe stężenie Hcy u mężczyzn z przewlekłą lub schyłkową niewydolnością nerek. Stężenia tego aminokwasu były również wyższe, choć nieznamiennie, w grupach kobiet z podwyższonym stężeniem askorbinianu. Uwagę zwraca fakt, że zarówno u mężczyzn z prawidłową funkcją nerek (ale z chorobami układu krążenia) jak i z przewlekłą lub schyłkową niewydolnością nerek występował większy rozrzut wyników. Wieloczynnikowa analiza skupień wszystkich zmiennych (ryc. 5) pokazała, że w grupie pacjentów z przewlekłą lub schyłkową niewydolnością nerek, FRASC w osoczu wydaje się korelować bezpośrednio z poziomem homocysteiny oraz fibrynogenu (strzałki). Na stężenie askorbinianu w tej grupie pośrednio mogą wpływać: występowanie cukrzycy lub hiperglikemii, nadciśnienie tętnicze lub choroba niedokrwienna serca. Ryc. 3. Wykres pudełkowy porównujący aktywności katalazy i dysmutazy ponadtlenkowej w hemolizatach krwinek czerwonych: między kobietami i mężczyznami w grupie pacjentów z prawidłową czynnością nerek i w grupie chorych z przewlekłą lub schyłkową niewydolnością nerek. Na wykresie linie poziome pogrubione przedstawiają wartości median, pudełka 25-75% natomiast wąsy wartości minimalne i maksymalne (Min-Maks) Fig. 3. Box plot comparing antioxidant enzymes activities in erythrocytes hemolisates between men and women in the group of patients with chronic renal failure and in patients with sufficient renal function Ryc. 4. Wykres pudełkowy porównujący całkowite stężenie wolnej homocysteiny w osoczu: między kobietami i mężczyznami w grupie pacjentów z prawidłową czynnością nerek i w grupie chorych z przewlekłą lub schyłkową niewydolnością nerek. Na wykresie linie poziome pogrubione przedstawiają wartości median, pudełka 25-75% natomiast wąsy wartości minimalne i maksymalne (Min-Maks) Fig. 4. Box plot comparing homocysteine levels in plasma between men and women in the group of patients with chronic renal failure and in patients with sufficient renal function

Pietrzycka A i wsp. Stężenie askorbinianu i homocysteiny w osoczu a aktywność czerwonokrwinkowych enzymów... 437 Ryc. 5. Wykresy drzewkowe dla wieloczynnikowej analizy skupień metodą aglomeracji metodą Warda w oparciu o odległości euklidesowe. Na wykresie tym zmienne które leżą bliżej siebie, są powiązane liniami w kształcie litery U. Im wysokość litery U jest niższa tym dwie zmienne są ściślej ze sobą powiązane / lepiej skorelowane. Odl odległość; Odl. maks. odległość maksymalna Fig. 5. Dendrograms for cluster analysis by agglomeration method W grupie chorych z prawidłową czynnością nerek stwierdzono bezpośredni związek poziomu askorbinianu z przebiegiem choroby niedokrwiennej serca oraz aktywnością enzymów antyoksydacyjnych: dysmutazy ponadtlenkowej i katalazy (strzałka na ryc. 5). Na poziom homocysteiny w osoczu może bezpośrednio wpływać poziom glukozy i fibrynogenu. Ponadto, stwierdzono że Hcy korelowała z wypadkową zdolnością osocza do zmiatania rodnika DPPH (ryc. 5). Dyskusja W badanych grupach kobiet i mężczyzn w wieku 46-70 lat, wysokie stężenia kwasu askorbinowego, przewyższające stężenia fizjologiczne (powyżej 68.0 µmol/l) związane były ściśle z przebiegiem choroby. W grupie chorych z prawidłową funkcją nerek stężenie askorbinianu związane było z spadkiem aktywności enzymów antyoksydacyjnych: dysmutazą ponadtlenkową i katalazą (ryc. 3). Na zależności te zdaje się wpływać bezpośrednio choroba ale również palenie papierosów, choć zaledwie 20% pacjentów z tej grupy przyznało się do nałogu (tab. I). Być może znaczenie ma fakt, że aktywność SOD była dużo niższa od wartości prawidłowych (800.0-1600.0 IU/g Hb) u kobiet i mężczyzn (ryc. 3). Rolą dysmutazy ponadtlenkowej jest zmiatanie anionorodnika ponadtlenkowego [25, 26]. Należy przypuszczać że u chorych z chorobą niedokrwienną serca, chorobą wieńcową, hipercholesterolemią lub nadciśnieniem tętniczym występuje wysokie stężenie anionorodnika ponadtlenkowego. W obecności tej reaktywnej formy tlenu wysokie stężenia askorbinianu sprzyjają powstawaniu rodnika askorbylowego, który może obniżyć dodatkowo i tak już niską aktywność SOD. Wysokie stężenia rodnika askorbylowego zdają się być ściśle związane z zdolnością zmiatania rodnika DPPH (Radical scavengin DPPH RSDPPH) (ryc. 5). Nie zmieniona zdolność RSDPPH (ryc. 2) oraz wyższa aktywności katalazy u kobiet z prawidłową funkcją nerek (ryc. 3) wskazuje na aktywację czynników transkrypcyjnych (ryc. 6) [17]. Ryc. 6. Model działania antyoksydantów w przebiegu choroby, z szczególnym uwzględnieniem kwasu askorbinowego Fig. 6. Model of antioxidant activity in the course of disease, with focus on ascorbic acid

438 Probl Hig Epidemiol 2012, 93(2): 432-439 Wysoki FRASC powodował również wzrost poziomu homocysteiny. Wieloczynnikowa analiza skupień wykazała że na stężenie Hcy w grupie pacjentów z prawidłową funkcją nerek wpływać może przede wszystkim poziom glukozy oraz występowanie cukrzycy lub hiperglikemii (u 49% przypadków stwierdzono cukrzycę lub hiperglikemię a hiperhomocysteinemię obserwowano u 58%) (ryc. 5; tab. I). W grupie kobiet i mężczyzn z przewlekłą lub schyłkową niewydolnością nerek (PSchNN) stwierdzono ścisłą i bezpośrednią zależność między stężeniem jonów askorbinianu w osoczu a stężeniem homocysteiny i fibrynogenu (ryc. 5). Mimo przewagi liczebnej populacji kobiet z PSchNN (tab. I) i mimo znamiennie wyższego stężenia askorbinianu w osoczu (ryc. 1), to mężczyżni wydają się być szczególnie podatną grupą na działanie wysokich stężeń wit. C i być może rodnika askorbylowego. W osoczu mężczyzn, u których stwierdzono FRASC powyżej 68.0 µmol/l obserwowano znamiennie wyższe stężenia Hcy (p 0.001) niż u mężczyzn z stężeniem askorbinianu w normie (ryc. 4). Hiperhomocysteinemia (53% pacjentów z przewlekłą lub schyłkową niewydolnością nerek) korelowała z hipercholesterolemią (30% chorych PSchNN) (ryc. 5; tab. I). Ponadto, wysoki FRASC w grupie mężczyzn, zdaje się istotnie upośledzać zdolność zmiatania rodnika DPPH (ryc. 2). Obserwowano o 69% niższą aktywność dysmutazy ponadtlenkowej i o 43% katalazy w porównaniu do próbek mężczyzn z prawidłowym stężeniem askorbinianu (ryc. 3). Suplementację antyoksydantami zaleca się w celu ochrony komórek przed stresem oksydacyjnym. Najczęściej stosowany jest kwas askorbinowy (witamina C). Kwas askorbinowy jest niskocząsteczkowym, hydrofilnym antyoksydantem obecnym zarówno w cytoplaźmie komórki jak i zewnątrzkomórkowo w osoczu. Suplementacja kwasem askorbinowym zalecana jest pacjentom z niewydolnością nerek i z niedokrwistością z niedoboru żelaza w celu zapobiegania oporności na erytropoetynę [12]. Iniekcje witaminy C przed hemodializą z zastosowaniem niemodyfikowanej błony celulozowej mają zapobiegać peroksydacji lipidów błony komórkowej krwinek czerwonych, głównie w wyniku odtworzenia witaminy E z rodnika α-tokoferolowego w warstwie lipidowej [13-14]. Równowaga pomiędzy układami antyoksydacyjnymi osocza a błonowym układem antyoksydacyjnym erytrocytów zależy od właściwości antyoksydacyjnych i stężenia askorbinianu. Dowiedziono że witamina C odgrywa ważną rolę w utrzymaniu równowagi antyoksydacyjnej m.in. w cukrzycy typu 2 [9-11]. Kwas askorbinowy występuje in vivo w dwóch formach: w postaci jonu askorbinowego oraz w postaci rodnika askorbylowego. Wit. C będzie wpływać na komórki osłaniająco-antyoksydacyjnie lub też przeciwnie, może wywierać działanie prooksydacyjne, zależnie od dawki podania, stężenia askorbinianów w osoczu i komórkach. Ze schematu przedstawionego na ryc. 6 wynika, że wraz z rozwojem choroby (niewydolności nerek) pod wpływem czynników ryzyka wzrasta stres oksydacyjny. działanie antyoksydacyjne lub prooksydacyjne będzie zależało od tego na jakim etapie rozwoju choroby i stresu oksydacyjnego będzie podany antyoksydant np. kwas askorbinowy. Działanie antyoksydacyjne jest związane z: 1) hamowaniem reakcji utleniania i utrzymaniem niskiego stopnia utlenienia, poprzez zmiatanie nadmiaru reaktywnych form tlenu i wolnych rodników 2) zmniejszeniu oksydatywnego uszkodzenia komórek poprzez hamowanie uwalniania metali przejściowych, katalizujących reakcje Fentona i Habera-Weiss a; 3) aktywacją reakcji fofsorylacji białek oraz aktywacją czynników transkrypcyjnych, kodujących syntezę antyoksydantów enzymatycznych i nieenzymatycznych (ryc. 6). Askorbinian podany pacjentowi, u którego stwierdzono niskie stężenie jego jonów lub pacjentowi we wczesnym etapie rozwoju stresu oksydacyjnego towarzyszącego postępowi niewydolności nerek, będzie wywierać działanie antyoksydacyjne. Ponadto wit. C u tego chorego może spowolnić lub zapobiec powikłaniom ze strony układu sercowo-naczyniowego. Wskazywać na to może stężenie homocysteiny w osoczu w zakresie wartości referencyjnych. Z askorbinianu podanego choremu, u którego zaobserwowano stężenie wit. C przekraczające wartości fizjologiczne (30.0-68.0 µmol/l), w warunkach stresu oksydacyjnego, będą powstawały rodniki kwasu askorbinowego. Rodniki te mogą zwiększać uszkodzenie oksydatywne komórek, przewyższające możliwości naprawcze. Ponadto wysokie stężenia rodników askorbylowych mogą inaktywować odpowiedzi adaptacyjne na działanie RFT (ryc.6). Tym mechanizmem można wytłumaczyć znamiennie niższe aktywności katalazy zarówno u kobiet jak i u mężczyzn, z przewlekłą lub schyłkową niewydolonością nerek (p 0.02), podczas gdy w grupie chorych z prawidłową czynnością nerek nie obserwowano zmiany (mężczyźni) a nawet stwierdzono wzrost aktywności CAT (kobiety) (ryc. 3). Wysokie wartości FRASC zwiazane były z hipercholesterolemią, hiperhomocysteinemią i z hipefibrynogenemią (ryc. 6), czyli z wysokim ryzykiem incydentów sercowo-naczyniowych. Witaminę C łatwo przedawkować, choć skutki przedawkowania mogą być bardzo odległe. Dlatego też warto rozważyć suplementację kwasem askorbinowym tylko u tych chorych u których stwierdzono niedobór antyoksydantów, lub u któ-

Pietrzycka A i wsp. Stężenie askorbinianu i homocysteiny w osoczu a aktywność czerwonokrwinkowych enzymów... 439 rych zaobserwowano wysoki poziom wskaźników stresu oksydacyjnego (np. niską zdolność zmiatania rodnika DPPH lub niską aktywność katalazy). Jako potwierdzenie tego wniosku warto przytoczyć słowa Pana Profesora Barry ego Halliwella [17]: We do not administer antihypertensive drugs to patients in clinical trials without checking blood pressure, so why should we give antioxidants without checking that they have decreased oxidant status? Piśmiennictwo / References 1. Corti A, Casini AF, Pompella A. Cellular pathways for transport and efflux of ascorbate and dehydroascorbate. Arch Biochem Biophysics 2010, 500(2): 107-115. 2. Kannampuzha J, Donnelly SM, McFarlane PA, et al. Glutathione and riboflavin status in supplemented patients undergoing home nocturnal hemodialysis versus standard hemodialysis. J Ren Nutr 2010, 20(3): 199-208. 3. Rizvi SI, Maurya PK. L-cysteine influx in erythrocytes as a function of human age. Rejuvenation Res 2008, 11(3): 661-5. 4. Dinavahi R, Falkner B. Relationship of homocysteine with cardiovascular disease and blood pressure. J Clin Hypertens (Greenwich) 2004, 6(9): 494-500. 5. Melvin R, et al. Homocysteine and reactive oxygen species in metabolic syndrome, type 2 diabetes mellitus, and atheroscleropathy: The pleiotropic effects of folate supplementation. Nutr J 2004, 3: 4. 6. Jakubowski H, Zhang L, Bardeguez A, Aviv A. Homocysteine thiolactone and protein homocysteinylation in human endothelial cells: implications for atherosclerosis. Circ Res 2000, 87(1): 45-51. 7. Guilland JC, Favier A, Potier de Courcy G, Galan P, Hercberg S. Hyperhomocysteinemia: an independent risk factor or a simple marker of vascular disease? 2. Epidemiological data. Pathol Biol (Paris) 2003, 51(2): 111-121. 8. Jakubowski H. Homocysteine is a protein amino acid in humans. Implications for homocysteine-linked disease. J Biol Chem 2002, 277(34): 30425-3048. 9. Rizvi SI, Srivastava N. Erythrocyte plasma membrane redox system in first degree relatives of type 2 diabetic patients. Intern J Diabetes Mellitus 2010, 2(2): 119-121. 10. Rizvi SI, Pandey KB, Jha R, Maurya PK. Ascorbate recycling by erythrocytes during aging in humans. Rejuvenation Research 2009, 12(1): 3-6. 11. Van Duijn MM, Tijssen K, VanSteveninck J, et al. Erythrocytes reduce extracellular ascorbate free radicals using intracellular ascorbate as an electron donor. J Biological Chem 2000, 275(36): 27720 27725. 12. Abdollahzad H, Eghtesadi S, Nourmohammadi I, et al. Effect of vitamin C supplementation on oxidative stress and lipid profiles in hemodialysis patients. Intern J Vitamin Nutrition Research 2009, 79 (5-6): 281-287. 13. Fumeron C, Nguyen-Khoa T, Saltiel C, Kebede M, et al. Effects of oral vitamin C supplementation on oxidative stress and inflammation status in haemodialysis patients. Nephrol Dialysis Transplantation 2005, 20(9): 1874-1879. 14. Deved V, Poyah P, James MT, Tonelli M, Manns BJ, et al. Ascorbic Acid for Anemia Management in Hemodialysis Patients: A Systematic Review and Meta-analysis. Am J Kidney Diseases 2009, 54(6): 1089-1097. 15. Carr AC, Frei B. Toward a new recommended dietary allowance for vitamin C based on antioxidant and health effects in humans. Am J Clin Nutr 1999, 69: 1086-1107. 16. Carr A, Frei B. The role of natural antioxidants in preserving the biological activity of endothelium-derived nitric oxide. Free Radical Biol Med 2000, 28,12: 1806-1814. 17. Halliwell B. The antioxidant paradox. Lancet 2000, 355: 1179-80. 18. Choy CK, Benzie IF, Cho P. Ascorbic acid concentration and total antioxidant activity of human tear fluid measured using the FRASC assay. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2000, 41(11): 3293-8. 19. Janaszewska A, Bartosz G. Assay of total antioxidant capacity: comparison of four methods as applied to human blood plasma. Scand J Clin Lab Invest 2002, 62: 231-6. 20. Om P, Tej S, Bhat K. DPPH antioxidant assay revisited. Food Chemistry 2009, 113: 1202-1205. 21. Chaudiere J, Aguini N, Yadan J-C. Nonenzymatic Colorimetric Assay of Glutathione in the Presence of Other Mercaptans. Methods Enzymol 1999, 299: 276-286. 22. Oberley LW, McComick ML, Sierra-Rivera E, Kasemset S, Clair D. Manganese superoxide dismutase in normal and transformed human embryonic lung fibroblasts. Free Radic Biol Med 1989, 6: 379-384. 23. Spitz DR, Oberley L. An assay for superoxide dismutase activity in mammalian tissue homogenates. Anal Biochem 1989, 179: 8-18. 24. Aebi HE. Catalase. [in:] Methods of enzymatic analysis. Bergmayer HU. Verlag Chemie, Berlin 1983, 3, 273-3. 25. Dröge W. Free Radicals in the Physiological Control of Cell Function. Physiol Rev 2002, 82: 47-95. 26. Halliwell B, Gutteridge JMC. Free Radicals in biology and medicine. University Press, Oxford 2000.