Dr hab. med. Aleksandra Szlachcic Kraków, 10.08.2015 Katedra Fizjologii UJ CM 31-531 Kraków, ul. Grzegórzecka 16 Tel.: 601 94 75 82 RECENZJA PRACY DOKTORSKIEJ Recenzja pracy doktorskiej mgr Michała Stanisława Majewskiego, pt.: Badanie aktywności metabolitów L-tryptofanu na drodze szlaku kynureninowego jako potencjalnych substancji o działaniu wazoaktywnym. Przedstawiona do recenzji praca posiada typowy dla rozprawy doktorskiej układ. Zawiera 119 stron, 8 tabel, 54 ryciny oraz 184 pozycje piśmiennictwa. Informacje zawarte w pracy przedstawione są przejrzyście, opierają się na najnowszych doniesieniach naukowych, a wyniki opracowane są w czytelny i jasny sposób. Jednym z podstawowych elementów warunkujących stałość homeostazy organizmu ludzkiego jest utrzymanie szerokości naczyń krwionośnych, a tym samym przepływu krwi na poziomie pokrywającym zapotrzebowanie metaboliczne tkanek. Napięcie mięśni gładkich naczyń krwionośnych zależy od złożonego mechanizmu, w którym poszczególne czynniki w sposób bezpośredni lub pośredni modyfikują aktywność skurczową komórek mięśniowych. W warunkach fizjologicznych podstawowym mechanizmem kontroli szerokości naczyń krwionośnych jest regulacja miogenna, czyli zmiana tonusu naczyniowego pod wpływem czynnika mechanicznego, jakim jest
ciśnienie transmuralne. Regulacja miogenna wyjaśnia występujące w niektórych łożyskach naczyniowych zjawisko stałego przepływu krwi pomimo wahań ciśnienia napędowego. Aktywność mechanizmu miogennego jest zróżnicowana w zależności od miejsca występowania tzn. od lokalizacji łożyska naczyniowego oraz od budowy naczyń i dotyczy przede wszystkim arterioli i zwieraczy prekapilarnych. Ponadto miogenna kontrola tonusu naczyniowego jest modyfikowana przez szereg czynników humoralnych, mechanizmy neurogenne oraz czynniki pochodzenia śródbłonkowego. Śródbłonek naczyń krwionośnych odgrywa podstawową rolę w utrzymaniu homeostazy naczyniowej poprzez uwalnianie licznych substancji o działaniu autokrynnym lub parakrynnym w odpowiedzi na bodźce fizyczne lub chemiczne. Pośród licznych funkcji śródbłonka: udział w krzepnięciu krwi, fibrynolizie, procesach zapalnych itd., znajduje się produkcja i uwalnianie substancji wazoaktywnych pod wpływem różnorodnych czynników takich, jak stres, hormony, neurotransmitery, autokaidy, czynniki wzrostowe. Jednym z podstawowych czynników śródbłonkowych regulujących tonus naczyń jest lipofilny gaz, tlenek azotu (NO), syntezowany z L-argininy w obecności NO-syntazy występującej w postaci 3 izoform kodowanych przez odrębne geny, co skutkuje istnieniem NO-syntazy neuronalnej, konstytutywnej i indukowalnej. Efektem działania NO jest rozkurcz mięśni gładkich naczyń w wyniku pobudzenia kaskady cyklazy guanylowej. Szlak konstytutywna syntaza NO-NO-cGMP-kinaza białkowa G jest najlepiej scharakteryzowanym mechanizmem wazorelaksacyjnym zależnym od śródbłonka naczyń. Dowodem na kluczowe znaczenie tego mechanizmu w regulacji tonusu naczyniowego jest gwałtowny wzrost ciśnienia tętniczego po podaniu inhibitorów syntazy- NO, jak również ciężka postać nadciśnienia tętniczego u genetycznie zmodyfikowanych myszy pozbawionych konstytutywej syntazy NO. W trakcie badań okazało się, że aktywność śródbłonkowego szlaku NO-cGMP ulega modyfikacjom pod
wpływem czynników endogennych, jak i egzogennych. Efektem tego jest zmiana szerokości naczyń i w sposób pośredni zmiana ciśnienia tętniczego. Czynniki takie, jak: donory NO, inhibitory fosfodiesteraz metabolizujących cgmp, niezależne od NO aktywatory cyklazy guanylowej, endogenne lub egzogenne inhibitory syntazy-no, niedobór L-argininy zmieniają ilość wyprodukowanego przez śródbłonek NO. Skutkiem tego jest nie tylko modyfikacja naczyniorozszerzającego działania tlenku azotu, ale także innych procesów, gdyż NO posiada szeroki zakres działania biologicznego. Poza własnościami wazoaktywnymi, jest mediatorem stanu zapalnego, wpływa na agregację płytek, oraz proliferację komórek mięśni gładkich, co skutkuje tym, że uczestniczy nie tylko w patogenezie nadciśnienia systemowego i płucnego. Udział śródbłonka w kontroli szerokości naczyń nie ogranicza się do produkcji i uwalniania NO. Śródbłonek jest miejscem syntezy innych niezwykle istotnych i aktywnych względem mięśniówki naczyniowej substancji: metabolitów kwasu arachidonowego czy endotelin. Ponadto stwierdzono, że w stanie doświadczalnie wywołanej endotoksemii u myszy komórki śródbłonka naczyniowego wykazują ekspresję 2,3-dioksygenazy indoloaminowej, enzymu katalizującego metabolizm L-tryptofanu na drodze szlaku kynureninowego. To zjawisko koreluje ze spadkiem poziomu L-tryptofanu w osoczu krwi, wzrostem poziomu L-kynureniny i następczym spadkiem ciśnienia tętniczego. Podanie blokerów 2,3-dioksygenazy indoloaminowej prowadzi do wzrostu systemowego ciśnienia tętniczego u chorych zwierząt, ale nie stwierdzono tego efektu w przypadku niedoboru enzymu lub ϒ-interferonu, aktywatora 2,3-dioksygenazy indoloaminowej. Ponadto okazało się, że kynurenina w dawko-zależny sposób obniża ciśnienie krwi u myszy z nadciśnieniem, hamuje skurcz tętnic oraz działa relaksacyjnie na obkurczone fragmenty naczyń tętniczych. Wynika z tego, że szlak kynureninowy obok znanych do tej pory mediatorów, między innymi tlenku azotu pochodzenia śródbłonkowego, bierze udział w regulacji szerokości
łożyska naczyniowego. W związku z tym, że wyjaśnienie udziału wazoaktywnych czynników śródbłonkowych w utrzymaniu homeostazy naczyniowej w warunkach fizjologicznych czy w mechanizmach powstających zjawisk patologicznych w dalszym ciągu jest tematem otwartym prezentowana praca doktorska mgr Michała Stanisława Majewskiego posiada istotne znaczenie poznawcze w tym zakresie. Tytuł pracy jest zgodny z treścią rozprawy. Wstęp jest dobrze uzasadniony merytorycznie. Opiera się o najnowsze publikacje naukowe sugerujące udział metabolitów szlaku kynureninowego w regulacji tonusu naczyniowego. Stanowi wartościowy element rozprawy szczegółowo wprowadzając w badane zagadnienia. Cel przeprowadzonych badań został dobrze uzasadniony oraz przedstawiony klarownie i jednoznacznie. Celem Autora było: - zbadanie bezpośredniego wpływu produktów szlaku kynureninowego na naczynia tętnicze szczura w warunkach in vitro, - określnie wpływu metabolitów szlaku kynureninowego na naczynia poddane wcześniejszemu działaniu fenylefryny, serotoniny, KCl, - określnie aktywności naczyniowej metabolitów szlaku kynureninowego na poziome receptorowym. Metodyka została opisana przejrzyście i zrozumiale. Najpierw przedstawiono przygotowanie materiału biologicznego do badań in
vitro, sposób wyboru odpowiednich stężeń substancji referencyjnych oraz wyznaczanie ich efektu submaksymalnego oraz dawek kumulacyjnych. Następnie opisano przebieg wykonywanych pomiarów oraz procedury kończące eksperymenty. Ograniczenia pracy są przedstawione jednoznacznie, za co należy pochwalić Autora, który ma świadomość, że przeprowadzone eksperymenty są początkiem drogi badawczej a uzyskane wyniki nasuwają pytania, które wymagają odpowiedzi. Wnioski pokrywają się z uzyskanymi wynikami badań. Wskazane byłoby jednakże rozszerzenie badań w celu określenia ewentualnych interakcji z innymi czynnikami śródbłonkowymi w zakresie regulacji szerokości naczyń zarówno w warunkach in vitro jak i in vivo. Piśmiennictwo jest aktualne, obszerne oraz adekwatne do przedstawianego tematu. Jego dobór potwierdza dobrą znajomość dostępnej i aktualnej literatury w zakresie tematów poruszanych w rozprawie. Inne zastrzeżenia: Ryc. 9, str 25 brak wyjaśnienia niektórych użytych skrótów Str 28 receptory ryanodynowe, powinno być rianodynowe Str 36 jest in vivo, z treści wynika, że powinno być in vitro
Drobne uwagi: Pojedyncze błędy literowe Podsumowanie Prezentowana praca jest oryginalnym doniesieniem eksperymentalnym w zakresie własności naczynioruchowych metabolitów L-tryptofanu szlaku kynureninowego. W mojej ocenie rozprawa mgr Michała Stanisława Majewskiego spełnia całkowicie wymogi stawiane celem uzyskania stopnia doktora nauk farmaceutycznych. W związku z tym zwracam się do Wysokiej Rady Wydziału Farmaceutycznego z OML Gdańskiego Uniwersytetu Medycznego z wnioskiem o dopuszczenie jej Autora do dalszych etapów przewodu doktorskiego. Dr hab. med. Aleksandra Szlachcic