Produkcja kwasów organicznych Bakterie octowe Bakterie należące do rodziny Acetobacteraceae (obejmującej 18 rodzajów wg klucza Bergey a) nazywane są bakteriami octowymi. Głównymi przedstawicielami tej rodziny są dwa rodzaje Acetobacter sp. (15 gatunków) i Gluconobacter sp (4 gatunki) oraz niedawno wyodrębniony Gluconacetobacter sp (15 gatunków). Są to bakterie Gram-ujemne lub Gram-zmienne, bezwzględnie tlenowe, kształtu pałeczkowatego. Nie wytwarzają zarodników, często natomiast wydzielają substancje śluzowe (jest to charakterystyczny objaw psucia się piwa i wina zakażonego tymi bakteriami). Naturalnie występują w roślinach, najczęściej współbytują z dzikimi drożdżami wszędzie tam, gdzie obecne są wydzieliny lub soki zawierające cukry. Występują pojedynczo lub po dwie, a rzadziej w postaci krótkich łańcuszków. Mogą być urzęsione lub nieurzęsione. Bakterie z rodzaju Acetobacter wykazują urzęsienie peritrichalne (wkołorzęse) i są mało ruchliwe, natomiast Gluconobacter są urzęsione biegunowo. Charakterystyczną cechą w hodowli jest występowanie form inwolucyjnych o pogrubionych lub wydłużonych kształtach. Rodzaj Acetobacter wykazuje zdolność wzrostu na podłożach zawierających azot w postaci mineralnej (sole amonowe), w przeciwieństwie do Gluconobacter, który wymaga dodatku organicznego źródła azotu (najczęściej wyciągu drożdżowego). Wszystkie bakterie octowe mają zdolność do utleniania etanolu do kwasu octowego, jednak tylko Acetobacter i Gluconacetobacter mogą dalej utleniać kwas octowy do dwutlenku węgla i wody, ponieważ posiadają komplet enzymów cyklu Krebsa (podobnie może przekształcać kwas mlekowy) tzw. grupa peroxidans. Bakterie Gluconobacter sp. nie potrafią natomiast utleniać kwasu octowego i mlekowego do CO 2 i H 2O z uwagi na brak enzymów cyklu Krebsa (tzw. grupa suboxidans). Charakteryzują się za to wysoką aktywnością ketogenną utleniają glukozę do kwasu glukonowego i dalszych ketopochodnych. Posiadają także zdolność utleniania alkoholi polihydroksylowych (np. glicerolu do dihydroksyacetonu lub sorbitolu do sorbozy). Bakterie octowe pełnią ważną rolę w przemyśle farmaceutycznym oraz chemicznym. Są wykorzystywane do produkcji kwasu octowego metodą biotechnologiczną (rodzaj Acetobacter sp.). produkcja octów jest podstawowym zastosowaniem tych bakterii już od stuleci. Bakterie octowe bardzo często rozwijają się w nieprawidłowo zabezpieczonych napojach alkoholowych typu piwa i wina stanowiąc jedną z najczęstszych przyczyn strat w browarnictwie i produkcji wina (kwaśnienie alkoholu). Wynika to z naturalnej sukcesji ekologicznej: produkt metabolizmu drożdży etanol jest wykorzystywany przez rozwijające się bakterie octowe (tworzą śluzowate kolonie i kożuchy). podobne straty mogą powstawać w przypadku przetworów owocowych i warzywnych konserwowanych zalewami octowo-cukrowymi. W tym przypadku może też dochodzić do odkwaszania zalewy w wyniku działalności bakterii z rodzaju Acetobacter (gł. A. xylinus, A. pasteurianus, A. aceti). Bakterie octowe są także przyczyną psucia jabłek i gruszek. Z drugiej 1
strony, od stuleci produkowane napoje alkoholowe typu cydrów (w polskiej tradycji jabłeczniki i gruszeczniki) powstają w wyniku spontanicznej fermentacji moszczu jabłkowego (rzadziej gruszkowego) przez drożdże, a następnie częściowej fermentacji octowej prowadzonej przez naturalną mikroflorę owoców, w tym głównie bakterie octowe, w warunkach bardzo delikatnego dostępu tlenu. Stąd też gotowy napój typu cydr ma unikalne walory organoleptyczne pośrednie pomiędzy piwem, a winem. Cydr może być także wykorzystany do produkcji napojów destylowanych typu calvados lub applejack. Bakterie octowe wykorzystywane są także do utleniania cukrów prostych do kwasów jednokarboksylowych (-onowych) oraz do otrzymywania produktów dalszego utleniania, czyli ketokwasów (kwas 5-ketoglukonowy, kwas 2-ketoglukonowy, kwas 2,5-diketoglukonowy). Praktyczne znaczenie ma otrzymywanie kwasu glukonowego z wykorzystaniem bakterii Gluconobacter sp. oraz δ-laktonu kwasu glukonowego (zastosowanie w piekarnictwie). Kwas glukonowy jest wykorzystywany w przemyśle spożywczym, a glukoniany stosowane są w przemyśle farmaceutycznym do otrzymywania preparatów zawierających łatwo przyswajalne źródło jonów wapnia lub żelaza. Glukonian sodu stosowany jest ponadto w produkcji płynów myjących i proszków do prania oraz w budownictwie jako dodatek do zapraw betonowych. Roczna produkcja kwasu glukonowego wynosi ok. 40 tys. ton. Gluconobacter suboxydans (dawny syn. Acetobacter oxidans) jest wykorzystywany do otrzymywania witaminy C mieszaną metodą chemiczno-mikrobiologiczną. Bakterie te przeprowadzają biokonwersję sorbitolu do sorbozy, która jest dalej przekształcana na drodze chemicznej do witaminy C (kwasu askorbowego). Fermentacja octowa i produkcja octu Ocet stosowano już w starożytności jako przyprawę oraz przede wszystkim do konserwowania żywności. Dodatkową zaletą octu (wykorzystywaną zwłaszcza współcześnie) jest pobudzanie przemiany materii stąd zastosowanie jako środka na odchudzanie. Ocet stosowano również do kąpieli leczniczych i nacierań. Współcześnie do celów chemicznych kwas octowy otrzymywany jest w procesie suchej destylacji drewna lub w wyniku pełnej syntezy chemicznej. Ocet konsumpcyjny nie może natomiast zawierać syntetycznego kwasu octowego, lecz kwas uzyskany na drodze biotransformacji z surowców pochodzenia naturalnego. Surowcem wyjściowym jest etanol zawarty w surówkach gorzelniczych lub rektyfikacie (ocet spirytusowy) oraz etanol występujący w winach białych lub czerwonych (tzw. ocet winny). Jako gotowy produkt ( ocet spożywczy ) wykorzystuje się podłoże pofermentacyjne, a nie oczyszczony kwas octowy. Ocet spożywczy jest więc 3,5%-10% roztworem kwasu octowego z towarzyszącymi mu pozostałościami składników zacieru octowniczego. Wyróżnia się następujące główne rodzaje octów spożywczych: 2
ocet spirytusowy (otrzymywany fermentacyjnie na bazie rozcieńczonego spirytusu) ocet balsamiczny (otrzymywany poprzez fermentację z moszczu winogron) ocet jabłkowy (otrzymywany z fermentacji wina owocowego jabłkowego lub moszczu jabłkowego) ocet ryżowy (produkowany głównie na Dalekim Wschodzie z ryżu lub sake). Bakterie z rodzaju Acetobacter oraz Gluconobacter posiadają zdolność do częściowego utleniania cukrów (glukoza, fruktoza) lub alkoholi (etanol, propanol, butanol, mannitol, glicerol). Zwyczajowo proces ten określany jest jako fermentacja octowa (lub octanowa), jednak jest to proces ściśle tlenowy. Niewykorzystany produkt końcowy- kwas octowy jest wydzielany do podłoża:ch 3CH 2OH + O 2 CH 3COOH + H 2O Utlenianie zachodzi w dwóch etapach: najpierw do aldehydu octowego, a następnie do kwasu octowego, towarzyszy temu znaczna ilość wydzielanego ciepła.ch 3CH 2OH CH 3CHOH CH 3COOH W zależności od gatunku (różna tolerancja na kwasowość środowiska) ilość wytworzonego kwasu wynosi 2-13%. Po wyczerpaniu się substratu bakterie z rodzaju Acetobacter mogą dalej utleniać kwas octowy do CO2 i H2O (powodując stratę w produkcji octu). Podstawowym parametrem niezbędnym do prawidłowego przebiegu fermentacji octowej jest dostęp do odpowiednio dużej ilości powietrza. Zarówno tradycyjne, jak i współczesne technologie produkcji octu muszą zapewniać ścisły kontakt bakterii i pożywki z tlenem 3
atmosferycznym. Zacier octowniczy, czyli brzeczka fermentacyjna, jest odpowiednio rozcieńczonym roztworem etanolu (6-12%) z niewielkim dodatkiem kwasu octowego (ok. 2%). Niezbędny jest także dodatek soli mineralnych (amonowych i fosforanów). Surowcami na bazie których przygotowuje się zacier octowniczy są spirytusy (ziemniaczany, zbożowy, owocowy), piwo, wino lub moszcze, a także słód jęczmienny, soki owocowe, zboża, ziemniaki, buraki cukrowe, melasa po ich uprzednim sfermentowaniu. Wyróżnia się trzy główne metody produkcji octu spożywczego, wśród których najstarszą i najprostszą jest metoda powierzchniowa (metoda orleańska). W metodzie tej wino pozostawiano w kadzi fermentacyjnej lub płaskim naczyniu. Bakterie fermentacji octowej dostawały się do naczynia za pośrednictwem muszki owocowej (Drosophila aceti) fermentacja spontaniczna. Proces przebiegał bardzo powoli a drobnoustroje nie były połączone z żadnym nośnikiem. Z czasem wprowadzono nośniki, np. wytłoki winogron, łodygi winorośli, na których bytowały drobnoustroje. Naczynie okresowo wstrząsano, aby zwiększyć natlenienie pożywki. Maksymalne stężenie octu w tej metodzie nie przekraczało zazwyczaj 8%. W metodzie klasycznej (ociekowej) wysokie kadzie drewniane (~ 3 m) lub kamionkowe (~ 5 m) o podwójnym dnie wypełniano wiórami z drewna bukowego lub rzadziej innym materiałem (pumeks, koks, węgiel drzewny, kolby kukurydziane). Na ich powierzchni bytują namnożone bakterie fermentacji octowej. Substrat (wino lub roztwór etanolu) podawano od góry kadzi - spływał on grawitacyjnie w dół. Dzięki dużej powierzchni wiórów i obfitemu dostępowi powietrza, zasysanego przez dolne otwory kadzi (przepływ powietrza w przeciwprądzie), zacier stopniowo zmieniał się w ocet w toku powolnego ściekania. Procedurę powtarzano kilkakrotnie, aż do uzyskania odpowiedniego stężenia octu. Cały proces trwał kilka do kilkunastu dni, a stężenie uzyskanego octu mieściło się w granicach 9-15%. Raz namnożone drobnoustroje wykorzystywano przez wiele lat. Najnowsza i najbardziej wydajna metoda współczesna (wgłębna) prowadzona jest w bioreaktorach (acetatorach). Utlenianie alkoholu przebiega w ściśle kontrolowanych warunkach. Do fermentacji stosowane są czyste, wyselekcjonowane kultury. Proces prowadzi się w sposób półciągły - przebiega on do momentu spadku stężenia alkoholu do 0,3%, wówczas część octu zostaje odprowadzona a dostarczana jest nowa porcja pożywki. Cykl produkcyjny trwa 40-48 godzin, a wydajność bioprocesu sięga 98%. Stężenie kwasu octowego w produkcie końcowym wynosi do 15%. Istnieją technologie pozwalające uzyskać ocet o stężeniu 18-20% przy użyciu odpornych szczepów bakterii octowych. Ocet surowy jest filtrowany w celu usunięcia zanieczyszczeń, szczególnie białek powodujących mętnienie octu. Fermentacja cytrynianowa Do drobnoustrojów przeprowadzających fermentację cytrynianową z dość dużą wydajności zaliczamy liczne gatunki pleśni, drożdże (Candida, Rhodotorula, Torulopsis), bakterie (Bacillus licheniformis). Jednak największe znaczenie mają grzyby z gatunku Aspergillus niger. Fermentacja 4
prowadzona przy udziale drożdży jest łatwiejsza do prowadzenia w systemie ciągłym, jest też bardziej wydajna. Wadą jest duży udział kwasu izocytrynowego (do 20%). W przeciwieństwie do bakterii, grzyby strzępkowe są dużo bardziej podatne na separację przez filtrowanie, co usprawnia technologię procesu i nie wymaga dużych nakładów energii. Grzyby syntetyzują kwasy organiczne w warunkach tlenowych. Zjawisko nadmiernego wydzielania pośrednich produktów metabolizmu podstawowego (w tym kwasu cytrynowego) wynika z braku pewnych pierwiastków śladowych w podłożu hodowlanym. Powstaje możliwość celowej regulacji metabolizmu grzybów w kierunku nadprodukcji i wydzielania określonego produktu. Jest to wykorzystane w skali przemysłowej. Substraty wykorzystywane do otrzymywania kwasu cytrynowego to: melasa buraczana lub trzcinowa (w mniejszym stopniu melasa kukurydziana, sojowa lub pomarańczowa), hydrolizaty skrobi ziemniaczanej i kukurydzianej, glukoza (techniczna lub czysta), cukier (biały i surowy), koncentraty soków z buraków i trzciny cukrowej. Pożywka może być uzupełniana źródłami azotu organicznego i fosforu nieorganicznego oraz dodatkiem soli mineralnych (magnez, siarka, cynk, żelazo, miedź, mangan).w syntezie kwasu cytrynowego (oraz innych kwasów organicznych) przez grzyby kluczową rolę odgrywają enzymy cyklu kwasów trójkarboksylowych (cyklu Krebsa). Substratem bezpośrednim jest glukoza. Fumaran, jabłczan, bursztynian i cytrynian są wydzielane do podłoża jako produkty pośrednie cyklu Krebsa. Wydajność fermentacji zależy w dużym stopniu od składu pożywki. Tworzeniu się kwasu sprzyja mała ilość związków azotu (limitacja procesów wzrostu grzybni) i jednocześnie duża zawartość cukru w podłożu (10% na podłożu sacharozowym i 16% na podłożu melasowym). Wytwarzanie kwasu cytrynowego jest związane z okresem głodowania grzyba. Wysoką wydajność produkcji kwasu cytrynowego warunkują Fe 2+, Mn 2+ i Zn 2+ (jeżeli są w stężeniach limitujących aktywność hydratazy akonitanowej poniżej 0,1 mg/100 ml pożywki). Biochemiczne warunki nadprodukcji kwasu cytrynowego przez A. niger 5
Zarówno dzikie szczepy A. niger, jak i przede wszystkim mutagenizowane szczepy przemysłowe mają zdolność do nadprodukcji kwasu cytrynowego. Wynika to z naturalnej bądź indukowanej sztucznie niskiej aktywności określonych enzymów cyklu Krebsa, cyklu glioksalowego oraz tzw. alternatywnego szlaku oddechowego. Łącznie nadprodukcja kwasu cytrynowego u A. niger jest więc uwarunkowana trzema mechanizmami biochemicznymi. Głównym substratem w nadprodukcji cytrynianu jest sacharoza, stąd pierwszym etapem biosyntezy jest jej hydroliza warunkowana wysoką aktywnością inwertazy. Enzym ten jest w większości wydzielany do podłoża produkcyjnego (ponad 60%). Produkty hydrolizy sacharozy glukoza i fruktoza są włączane następnie w szlak glikolityczny będący podstawowym źródłem prekursorów biosyntezy kwasu cytrynowego. Powstający pirogronian jest włączany do cyklu Krebsa. Kwas cytrynowy powstaje w wyniku kondensacji acetylo-coa ze szczawiooctanem, jednak dalsze jego przekształcenia w cyklu Krebsa są hamowane w wyniku bardzo niskiej aktywności hydratazy akonitanowej (głównie poprzez regulację składu pożywki odpowiednio niskie stężenie jonów Fe 2+, Zn 2+, Mn 2+ ) katalizującej przekształcenie cytrynianu w izocytrynian. Powstający w tych warunkach nadmiar cytrynianu jest usuwany poza komórki do środowiska hodowlanego, dzięki czemu nie występuje sprzężenie zwrotne hamujące tempo glikolizy. Kolejne dwa enzymy cyklu Krebsa również mają obniżoną aktywność. Są to dehydrogenaza izocytrynianowa (hamowana przez niskie ph środowiska oraz gromadzący się w mitochondriach cytrynian) i dehydrogenaza α- ketoglutaranu. Drugim mechanizmem warunkującym nadprodukcję jest współwystępujący cykl glioksalowy, w którym izocytrynian jest przekształcany w szczawiooctan wzbogacający pulę tego związku w pierwszej, kluczowej reakcji cyklu Krebsa i jednocześnie biosyntezy kwasu cytrynowego. Kluczowym enzymem szlaku glioksalowego, o wysokiej aktywności u A. niger, jest liaza izocytrynianowa. Ostatnim mechanizmem warunkującym nadprodukcję kwasu cytrynowego u A. niger jest występowanie alternatywnego łańcucha oddechowego w mitochondrium. Kluczowym jego elementem jest tzw. alternatywna oksydaza AOX (alternative oxidase). Jej działanie umożliwia transport elektronów na tlen w sposób bezpośredni, czyli bez udziału układu cytochromów w błonie mitochondrialnej. Znaczenie alternatywnej oksydacji polega na zużywaniu gromadzącego się NADH z glikolizy (restytucja NAD + ), dzięki czemu nie dochodzi do hamowania zwrotnego tego szlaku jest to główny czynnik aktywujący AOX. Alternatywna oksydacja jest szlakiem mniej wydajnym energetycznie (mniejsza produkcja ATP o około 60%); znaczna część energii jest uwalniana w postaci ciepła. Podobny mechanizm alternatywnego oddychania opisano u innych grzybów (np. u Neurospora crassa) występuje on zwykle w czasie przechodzenia hodowli w etap stacjonarny po fazie logarytmicznego wzrostu. Warunkiem aktywacji AOX jest intensywne natlenianie środowiska. Nawet krótkotrwały niedobór tlenu w środowisku może zahamować aktywność AOX i pobudzić procesy proliferacji grzybni przy jednoczesnym zahamowaniu biosyntezy kwasu cytrynowego. Dodatkowym czynnikiem aktywującym AOX jest niedobór jonów 6
Cu 2+ niezbędnych do prawidłowej aktywności oksydazy cytochromowej spadek jej aktywności prowadzi do aktywacji AOX. Technologia produkcji kwasu cytrynowego Produkcję kwasu cytrynowego w skali przemysłowej prowadzi się dwiema alternatywnymi metodami: - metoda powierzchniowa jest przeprowadzana w ciekłej pożywce (najczęściej melasie) w komorach fermentacyjnych z tacami (LSF - liquid surface fermentation) lub w pożywce stałej (SSF solid state fermentation) w fermentorach tacowych, bębnowych, komorowych lub wieżowych. - metoda wgłębna (SmF submerged fermentation) - przeprowadzana w ciekłej pożywce, w klasycznych fermentorach o poj. 50-500m3 z mieszaniem i napowietrzaniem lub w fermentorach typu air-lift. Tą metodą uzyskuje się 80% światowej produkcji kwasu cytrynowego. Najkorzystniej jest prowadzić hodowle Aspergillus niger przy zachowaniu niskiego ph na początku procesu (ph=2,5-3,5), co warunkuje powstawanie czystego kwasu cytrynowego (bez syntezy innych produktów), a jednocześnie chroni hodowlę przed zakażeniami bakteryjnymi. Akumulacja i wydzielanie do pożywki produktów pośrednich cyklu kwasów trójkarboksylowych (w tym kwasu cytrynowego) przez kultury grzybów jest wynikiem niezrównoważonego metabolizmu tych 7
organizmów. W normalnych warunkach dzikie szczepy grzyba przeprowadzają całkowite utlenienie i asymilację substratów. Problemy technologiczne związane z produkcją kwasu cytrynowego związane są przede wszystkim z utrzymywaniem aktywnej i nieskażonej innymi gatunkami grzybów kultury pleśni. Hodowle Aspergillus niger z czasem ulegają degeneracji i tracą zdolność wytwarzania kwasu cytrynowego. Ponadto zdarzają się zakażenia bakteriami mlekowymi (Streptococcus i Leuconostoc), tlenową laseczką sienną (Bacillus subtilis), laseczką ziemniaczaną (Bacillus mesentericus), a nawet beztlenowym bakteriami gnilnymi np. Clostridium sporogenes. Kwas cytrynowy znajduje szerokie zastosowanie w przemyśle spożywczym (E330), głównie jako regulator kwasowości (napoje, dżemy, galaretki, słodycze). Kwas cytrynowy ma również działanie konserwujące, wybielające i przeciwutleniające, co wykorzystuje się w przemyśle spożywczym, farmaceutycznym i kosmetycznym a także w produkcji środków piorących. Roczna światowa produkcja kwasu cytrynowego wynosiła w 2007 roku ponad 1,6 mln ton. 8