COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV Test, version 2.0

COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV Test, version 2.0 DO STOSOWANIA W DIAGNOSTYCE IN VITRO. COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV V2.0 72 Tests P/N: 04894570 190 HBV Test, v2.0 COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan PG WR 5.1 Liters P/N: 03587797 190 Wash Reagent PRZEZNACZENIE Test COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV, wersja 2.0 (v2.0), jest testem in vitro opartym na amplifikacji kwasu nukleinowego, służącym do ilościowego oznaczania DNA wirusa zapalenia wątroby typu B (HBV) w ludzkim osoczu oraz surowicy, wykorzystującym aparat COBAS AmpliPrep do automatycznego przetwarzania próbki oraz analizator COBAS TaqMan lub COBAS TaqMan 48 do automatycznej amplifikacji i detekcji. Test ten jest przenaczony do użycia jako pomoc w opiece klinicznej nad chorymi z przewlekłym zakażeniem wirusem HBV, poddawanymi terapii przeciwwirusowej. Oznaczenie można zastosować do zmierzenia wyjściowego poziomu DNA wirusa HBV oraz do powtórnego pomiaru podczas leczenia, co pomaga w ocenie odpowiedzi chorego na leczenie. Wyniki uzyskane za pomocą testu COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV, v2.0, należy interpretować w kontekście wszystkich istotnych objawów klinicznych oraz wyników badań laboratoryjnych. Test COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV, v2.0, nie jest przeznaczony do przesiewowego badania na obecność wirusa HBV we krwi lub produktach krwiopochodnych ani do stosowania jako test diagnostyczny, potwierdzający zakażenie wirusem HBV. PODSUMOWANIE I OBJAŚNIENIE TESTU Wirus zapalenia wątroby typu B (HBV) jest jednym z szeregu wirusów o znanej zdolności wywoływania wirusowego zapalenia wątroby. Przeszło dwa miliardy ludzi na całym świecie uległo zakażeniu wirusem HBV, a pośród nich ponad 350 milionów osób to przewlekle zakażeni nosiciele 1,2. Przewlekli nosiciele wykazują podwyższone ryzyko odległych powikłań zakażenia, w tym przewlekłego zapalenia i marskości wątroby oraz pierwotnego raka wątrobowokomórkowego 3,4,5. Markery serologiczne są powszechnie stosowane w roli diagnostycznych i/lub prognostycznych wskaźników ostrego lub przewlekłego zakażenia wirusem HBV. Najczęściej stosowanym markerem zakażenia wirusem HBV jest obecność jego antygenu powierzchniowego (HBsAg). Choć u nosicieli może dochodzić do eliminacji antygenu HBsAg oraz do wytwarzania przeciwciał skierowanych przeciwko niemu, okazuje się, że osoby te są obarczone ryzykiem rozwoju w późniejszym okresie życia poważnych powikłań dotyczących wątroby 6,7. Antygenu e wirusa HBV (HBeAg) używa się zazwyczaj jako markera wtórnego, wskazującego na czynną replikację HBV związaną z postępującą chorobą wątroby. Okazuje się, że niezdolność do eliminacji antygenu HBeAg zwiększa ryzyko wystąpienia krańcowych stadiów rozwoju choroby wątroby 8,9. Różne szczepy wirusa HBV mogą wytwarzać antygen HBeAg niemożliwy do wykrycia w surowicy albo tracić zdolność produkcji HBeAg nawet w obecności czynnej infekcji 10. Zatem wykorzystywanie tego markera do monitorowania postępu choroby może mieć ograniczoną użyteczność 11. Według doniesień możliwość wykrycia DNA wirusa HBV w surowicy posiada wartość prognostyczną, umożliwiającą rokowanie co do wyników leczenia ostrych i przewlekłych zakażeń wirusem HBV 12-15. Metoda ta może umożliwić wykrywanie DNA wirusa HBV po eliminacji antygenu HBsAg 16 lub wykrywanie HBV ubogiego w markery serologiczne 17. Jednak dotąd nie ustalono związku pomiędzy markerami serologicznymi a poziomami DNA wirusa HBV. Skuteczność leczenia przeciwwirusowego, stosowanego u pacjentów zakażonych wirusem HBV, można także oceniać na podstawie badania markerów serologicznych lub pomiarów aktywności enzymów wątrobowych. Jednak za najbardziej bezpośredni Część Informacje na temat wersji dokumentu znajduje się na końcu tego dokumentu. 05909813001-06PL 1 Doc Rev. 7.0

i rzetelny sposób pomiaru replikacji wirusa uważa się ilościową ocenę stężenia DNA HBV w surowicy lub osoczu 14,18-20. Wykazano, że szybki i trwały spadek poziomów DNA wirusa HBV u pacjentów otrzymujących alfa-interferon, lamiwudynę, gancyklowir lub dipiwoksyl adefowiru jest czynnikiem predykcyjnym pomyślnego wyniku leczenia 11,21-25. Monitorowanie poziomów DNA wirusa HBV pozwala przewidzieć rozwój jego oporności na lamiwudynę 26. Zatem ilościowy test służący do pomiaru stężenia DNA wirusa HBV jest cennym narzędziem, które można wykorzystywać w połączeniu z badaniami innych markerów serologicznych podczas leczenia zakażenia HBV. Ilościowe oznaczenie DNA wirusa HBV w osoczu i surowicy można przeprowadzić przy użyciu technik amplifikacji kwasów nukleinowych, takich jak reakcja łańcuchowej polimerazy (ang. Polymerase Chain Reaction, PCR) 27-29. w teście COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV, v2.0, wykorzystano technologię PCR do osiągnięcia maksymalnej czułości i dynamicznego zakresu ilościowych oznaczeń DNA wirusa HBV w osoczu z dodatkiem EDTA jako antykoagulanta i w surowicy. ZASADY PROCEDURY Test COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV, v2.0, jest testem opartym na amplifikacji kwasu nukleinowego, służącym do ilościowego oznaczania DNA wirusa zapalenia wątroby typu B (HBV) w ludzkim osoczu i surowicy. Test COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV, v2.0, jest oparty na dwóch głównych procesach: (1) przygotowaniu próbki w celu wyizolowania DNA wirusa HBV oraz (2) jednoczesnej amplifikacji PCR 27 docelowego DNA i detekcji rozszczepionej, podwójnie znakowanej sondy oligonukleotydowej, swoistej dla łańcucha docelowego. Test COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV, v2.0, umożliwia automatyczne przygotowanie próbki, a następnie automatyczną amplifikację PCR oraz detekcję docelowego DNA wirusa HBV i DNA standardu ilościowego HBV (ang. Quantitation Standard, QS). Odczynnik Master Mix zawiera pary primerów i sondy swoiste zarówno dla DNA wirusa HBV, jak i DNA standardu HBV QS. Odczynnik Master Mix opracowano w celu zapewnienia równoważnego oznaczenia ilościowego genotypów wirusa HBV od A do H. Detekcji amplifikowanego DNA dokonuje się przy użyciu swoistych dla sekwencji docelowych oraz swoistych dla standardu QS, podwójnie znakowanych sond oligonukleotydowych, umożliwiających niezależną identyfikację amplikonu wirusa HBV i amplikonu standardu HBV QS. Oznaczenie ilościowe DNA wirusa HBV wykonuje się za pomocą standardu HBV QS. Kompensuje on wpływ hamowania oraz kontroluje proces przygotowywania i amplifikacji, pozwalając uzyskać dokładniejsze oznaczenie ilościowe DNA wirusa HBV w każdej próbce. Jest to niezakaźny konstrukt DNA, zawierający sekwencje wirusa HBV o identycznych miejscach wiązania primerów, jak docelowe DNA HBV, a także charakterystyczne miejsce wiązania sondy, co umożliwia odróżnienie amplikonu standardu HBV QS od amplikonu wirusa HBV. Standard HBV QS jest dodawany do każdej próbki w znanej liczbie kopii i wraz z nią przechodzi przez kolejne etapy procesu przygotowania oraz jednoczesnej amplifikacji PCR i detekcji rozszczepionych, podwójnie znakowanych sond oligonukleotydowych. Analizator COBAS TaqMan lub analizator COBAS TaqMan 48 oblicza stężenie DNA wirusa HBV w badanych próbkach przez porównywanie sygnału HBV z sygnałem standardu HBV QS dla każdej próbki i kontroli. Wybór sekwencji docelowej Wyboru docelowej sekwencji DNA wirusa HBV dokonuje się w zależności od identyfikacji w obrębie genomu HBV regionów wykazujących maksymalny konserwatyzm spośród różnych genotypów HBV. Próbki DNA wirusa HBV oraz DNA standardu HBV QS przygotowuje się przy użyciu techniki wiązania kwasów nukleinowych na krzemionce, a jako primery w procesie amplifikacji DNA wirusa HBV i DNA standardu HBV QS wykorzystywane są określone oligonukleotydy. Podwójnie znakowane sondy oligonukleotydowe, swoiste dla sekwencji docelowej oraz swoiste dla standardu QS, umożliwiają niezależną identyfikację amplikonów: wirusa HBV oraz standardu HBV QS. Wobec tego właściwy wybór primerów oraz podwójnie znakowanej sondy oligonukleotydowej ma kluczowe znaczenie dla zdolności testu do amplifikacji i detekcji genotypów wirusa HBV. w teście COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV, v2.0, w reakcji PCR wykorzystano trzy primery. Generująca sygnał, podwójnie znakowana sonda ulega hybrydyzacji do nici komplementarnej i jest 05909813001-06PL 2 Doc Rev. 7.0

rozszczepiana przez polimerazę DNA Z05 podczas wydłużania primerów. Amplikon genotypów A F oraz H składa się z sekwencji 145 nukleotydów. Natomiast amplikon genotypu G składa się z sekwencji 181 nukleotydów. Dodatkowe 36 zasad w obrębie jednoniciowego, wysoce konserwatywnego regionu przedrdzeniowego/rdzeniowego genomu wirusa HBV skutkuje dłuższym amplikonem w przypadku genotypu G 31. Przygotowanie próbki W teście COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV, v2.0, zastosowano automatyczne przygotowywanie próbek w aparacie COBAS AmpliPrep przy użyciu techniki wiązania kwasów nukleinowych na krzemionce. w procedurze używana jest objętość 500 µl osocza lub surowicy. Cząstki wirusa HBV zostają poddane lizie poprzez ich inkubację w podwyższonej temperaturze z proteazą oraz chaotropowym buforem lizującym/wiążącym, który powoduje uwolnienie kwasów nukleinowych i ochronę uwolnionego DNA HBV przed znajdującymi się w osoczu i surowicy DNazami. Do każdej próbki wraz z odczynnikiem lizującym i szklanymi cząsteczkami magnetycznymi wprowadzana jest proteaza oraz znana liczba cząsteczek DNA standardu HBV QS. Mieszanina poddawane jest następnie inkubacji, a DNA wirusa HBV oraz DNA standardu HBV QS ulegają związaniu na powierzchni szklanych cząsteczek. Substancje niezwiązane, takie jak sole, białka i inne zanieczyszczenia pochodzenia komórkowego, ulegają usunięciu poprzez przepłukiwanie szklanych cząsteczek magnetycznych. Po oddzieleniu cząsteczek szkła i zakończeniu procesu przepłukiwania adsorbowane kwasy nukleinowe ulegają wymywaniu przy użyciu roztworu wodnego w podwyższonej temperaturze. Tak przygotowana próbka, zawierająca szklane cząsteczki magnetyczne oraz uwolniony DNA wirusa HBV i DNA standardu HBV QS, jest dodawana do mieszaniny do amplifikacji i umieszczana w analizatorze COBAS TaqMan lub analizatorze COBAS TaqMan 48. Amplifikacja PCR Reakcję amplifikacji PCR przeprowadza się z użyciem termostabilnego, rekombinowanego enzymu polimerazy DNA Z05 Thermus specie (Z05). w obecności manganu (Mn 2+ ) i w odpowiednich warunkach układu buforowego Z05 wykazuje aktywność polimerazy DNA 32,33. Umożliwia to prowadzenie amplifikacji PCR równocześnie z detekcją amplikonu w czasie rzeczywistym. Przetworzone próbki dodaje się do mieszaniny amplifikacyjnej w probówkach do amplifikacji (K-tube), gdzie zachodzi amplifikacja PCR. w obecności jonów Mn 2+ i przy nadmiarze trójfosforanów dezoksyrybonukleotydów (ang. deoxynucleotide triphosphate, dntp), do których należą trójfosforany dezoksyadenozyny, dezoksyguanozyny, dezoksycytydyny i dezoksyurydyny, polimeraza DNA Z05 wydłuża przyłączone w wyniku hybrydyzacji primery, tworząc nić DNA. Amplifikacja sekwencji docelowej Zainstalowany w analizatorze COBAS TaqMan lub analizatorze COBAS TaqMan 48 termocykler podgrzewa mieszaninę reakcyjną w celu denaturacji dwuniciowego DNA i odsłonięcia sekwencji docelowych swoistych dla primerów w obrębie kolistego fragmentu genomu DNA wirusa HBV oraz DNA standardu HBV QS. Podczas schładzania mieszaniny primery hybrydyzują do DNA docelowego. Termostabilna polimeraza DNA Thermus specie Z05 (Z05) w obecności jonów Mn 2+ oraz nadmiaru trójfosforanów dezoksynukleotydów (dntp), do których należą: dezoksyadenozyna, dezoksyguanozyna, dezoksycytydyna i dezoksyurydyna (zamiast tymidyny), wydłuża przyłączone w wyniku hybrydyzacji primery wzdłuż docelowej matrycy, tworząc dwuniciową cząsteczkę DNA, zwaną amplikonem. Analizator COBAS TaqMan lub analizator COBAS TaqMan 48 automatycznie powtarza powyższy proces przez określoną liczbę cykli, w każdym z nich zmierzając do podwojenia ilości amplikonu DNA. Wymagana liczba cykli jest zaprogramowana w analizatorze COBAS TaqMan lub analizatorze COBAS TaqMan 48. Amplifikacja zachodzi wyłącznie w regionie genomu wirusa HBV, znajdującym się pomiędzy primerami; cały genom HBV nie ulega zwielokrotnieniu. 05909813001-06PL 3 Doc Rev. 7.0

Amplifikacja wybiórcza W teście COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV, v2.0, amplifikację wybiórczą docelowego kwasu nukleinowego z próbki osiąga się dzięki zastosowaniu enzymu AmpErase (uracylo-nglikozylaza) i trójfosforanu dezoksyurydyny (dutp). Enzym AmpErase rozpoznaje i katalizuje niszczenie nici DNA zawierających dezoksyurydynę 34, lecz nie łańcuchów DNA zawierających dezoksytymidynę. w DNA występującym w naturze nie ma dezoksyurydyny, natomiast jest ona zawsze obecna w amplikonie wskutek zastosowania trójfosforanu dezoksyurydyny jako jednego spośród trójfosforanów dezoksyrybonukleotydu (dntp) w odczynniku Master Mix. Dlatego dezoksyurydynę zawiera wyłącznie amplikon. Dezoksyurydyna warunkuje wrażliwość zanieczyszczającego amplikonu na rozkład przez enzym AmpErase przed amplifikacją docelowego DNA. Enzym AmpErase niszczy także wszystkie nieswoiste produkty reakcji powstałe po wstępnej aktywacji odczynnika Master Mix przez jony manganu. Enzym AmpErase, zawarty w odczynniku Master Mix, katalizuje rozkład DNA zawierającego dezoksyurydynę w miejscu reszt dezoksyurydynowych przez otwarcie łańcucha dezoksyrybozy w pozycji C1. Podczas ogrzewania w pierwszym cyklu termicznym łańcuch amplikonu DNA pęka w miejscu, gdzie znajduje się dezoksyurydyna, w ten sposób wykluczając dalszą amplifikację DNA. Gdy enzym AmpErase zostanie wystawiony na działanie temperatury powyżej 55 C, tj. w czasie trwania całego cyklu termicznego, ulega inaktywacji i dlatego nie niszczy docelowego amplikonu, utworzonego w trakcie amplifikacji. Detekcja produktów reakcji PCR w teście COBAS TaqMan W teście COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV, v2.0, wykorzystano technologię PCR 27,28 w czasie rzeczywistym (ang. real-time PCR). Zastosowanie sond podwójnie znakowanych barwnikiem fluorescencyjnym pozwala na detekcję w czasie rzeczywistym gromadzenia się produktu reakcji PCR przez monitorowanie intensywności emisji fluorescencyjnych barwników reporterowych, uwalnianych w trakcie procesu amplifikacji. Sondy składają się z oligonukleotydów swoistych dla HBV i standardu HBV QS, znakowanych barwnikiem reporterowym i wygaszaczem. w teście COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV, v2.0, sondy dla HBV i standardu HBV QS są oznakowane różnymi fluorescencyjnymi barwnikami reporterowymi. Gdy sondy są nienaruszone, fluorescencja barwnika reporterowego jest tłumiona bliskością wygaszacza, na zasadzie efektu przenoszenia energii typu Förstera. Podczas reakcji PCR sonda ulega hybrydyzacji z sekwencją docelową, a następnie rozszczepieniu pod wpływem posiadanej przez termostabilną polimerazę DNA Z05 aktywności 5' 3' nukleazy. Od chwili uwolnienia i rozdzielenia reportera i wygaszacza nie zachodzi już zjawisko wygaszania, a aktywność fluorescencyjna barwnika reporterowego nasila się. Amplifikację DNA wirusa HBV oraz DNA standardu HBV QS mierzy się niezależnie od siebie, wykorzystując różne długości fal. Proces ten powtarza się przez określoną liczbę cykli, w każdym zaś cyklu następuje efektywne zwiększenie intensywności emisji poszczególnych barwników reporterowych, co umożliwia niezależną identyfikację DNA wirusa HBV oraz DNA standardu HBV QS. Cykl PCR, w którym krzywa wzrostu rozpoczyna wzrost wykładniczy, zależy od ilości materiału startowego na początku reakcji PCR. Podstawy oceny ilościowej w teście COBAS TaqMan Test COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV, v2.0, zapewnia dokładność wyników oznaczeń ilościowych w bardzo szerokim zakresie dynamiki, ponieważ monitorowanie amplikonu przeprowadza się w trakcie wykładniczej fazy amplifikacji. Im wyższe jest miano HBV w badanej próbce, tym wcześniej fluorescencja barwnika reporterowego sondy HBV wzrasta powyżej wyjściowego poziomu fluorescencji (patrz rysunek 1). Ponieważ ilość DNA standardu HBV QS jest stała we wszystkich próbkach, fluorescencja barwnika reporterowego sondy HBV QS powinna pojawiać się w każdej próbce w tym samym cyklu (patrz rysunek 2). w próbkach, w których fluorescencja standardu QS jest nieprawidłowa, stężenie jest poddawane odpowiedniej modyfikacji. Pojawienie się swoistych sygnałów fluorescencyjnych jest rejestrowane jako krytyczna wartość progowa (Ct). Wartość Ct definiuje się jako liczbę cykli, po której fluorescencja barwnika reporterowego przekracza ustaloną wcześniej wartość progową (ustalony poziom fluorescencji) i zapoczątkowuje fazę wykładniczego wzrostu siły sygnału (patrz rysunek 3). Większa wartość Ct wskazuje na niższe miano początkowe docelowego wirusa HBV. 2-krotny wzrost miana koreluje ze zmniejszeniem wartości Ct docelowego DNA wirusa HBV o 1, natomiast 10-krotny wzrost miana koreluje ze zmniejszeniem Ct o 3,3. 05909813001-06PL 4 Doc Rev. 7.0

Rysunek 1 przedstawia krzywe wzrostu sekwencji docelowej w serii rozcieńczeń, obejmującej przedział 5-krotnej wartości log 10. w miarę wzrostu stężenia wirusów krzywe wzrostu przesuwają się w kierunku wcześniejszych cykli. Zatem krzywa wzrostu leżąca najdalej na lewo odzwierciedla najwyższy poziom miana wirusa, a krzywa wzrostu leżąca najdalej na prawo oznacza najniższy poziom miana wirusa. Rysunek 1 Krzywe wzrostu sekwencji docelowej w serii rozcieńczeń wirusa obejmującej zakres 5-krotnej wartości log 10 9,00 8,00 Normalizowana fluorescencja 7,00 6,00 5,00 4,00 3,00 2,00 1,00 Miano najwyższe Miano najniższe 0,00-1,00 0 10 20 30 40 50 Liczba cykli Rysunek 2 przedstawia krzywe wzrostu dla standardu Quantitation Standard w próbkach z serią rozcieńczeń wirusa, obejmującą zakres 5-krotnej wartości log 10. Ilość dodanego do każdej próbki preparatu Quantitation Standard jest stała dla każdej reakcji. Wartość Ct dla preparatu Quantitation Standard jest podobna, niezależnie od miana wirusa. Rysunek 2 Krzywe wzrostu standardu oznaczenia w serii rozcieńczeń wirusa obejmującej zakres 5-krotnej wartości log 10 35,00 Normalizowana fluorescencja 30,00 25,00 20,00 15,00 10,00 5,00 0,00 Miano najniższe Miano najwyższe -5,00 0 10 20 30 40 50 Liczba cykli 05909813001-06PL 5 Doc Rev. 7.0

Rysunek 3 przedstawia na przykładzie, w jaki sposób wartości fluorescencji w każdym cyklu są normalizowane dla każdej krzywej wzrostu. Liczbę cykli cząstkowych (Ct) oblicza się w chwili, gdy sygnał fluorescencyjny przekracza ustalony poziom fluorescencji. Rysunek 3 Wartości fluorescencji w każdym cyklu są normalizowane dla każdej krzywej wzrostu Normalizowana fluorescencja 1 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0-0,1 Ustalony poziom fluorescencji -0,2 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 Liczba cykli Wartość Ct = 27,1 Ocena ilościowa stężenia DNA wirusa HBV Test COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV, v2.0, służy do ilościowego oznaczania stężenia DNA wirusa HBV, z wykorzystaniem drugiej sekwencji docelowej (preparat HBV Quantitation Standard), którą w znanym stężeniu dodaje się do każdej próbki testowej. Standard HBV QS jest niezakaźnym konstruktem DNA, zawierającym fragmenty sekwencji HBV z obszarami wiązania primerów, które są identyczne z obszarami wiązania na docelowej sekwencji HBV. Standard HBV QS zawiera miejsca wiązania primerów HBV i daje produkt amplifikacji o takiej samej długości i składzie zasad jak w docelowym DNA wirusa HBV. Obszar wiązania sondy detekcyjnej w obrębie standardu HBV QS został zmodyfikowany, aby umożliwić odróżnienie amplikonu HBV QS od amplikonu docelowego wirusa HBV. Podczas fazy hybrydyzacji reakcji PCR w analizatorze COBAS TaqMan lub analizatorze COBAS TaqMan 48 próbki zostają oświetlone i wzbudzone światłem przefiltrowanym, a następnie rejestruje się wyniki emisji przefiltrowanej fluorescencji każdej próbki. Odczyty dotyczące poszczególnych próbek poddaje się korekcji w celu wyeliminowania zmienności wywołanej działaniem instrumentów. Aparat wprowadza odczyty fluorescencji do programu AMPLILINK i zapisuje w bazie danych. Stosuje się metodę odczytów wstępnych do określenia, czy DNA wirusa HBV oraz DNA standardu HBV QS reprezentują zestawy, które można uznać za ważne; w sytuacji gdy dane nie mieszczą się w ustalonych granicach, aparat opatruje je odpowiednimi oznaczeniami. Po ukończeniu i pomyślnej ocenie wszystkich odczytów wstępnych odczyty fluorescencji są następnie przetwarzane w celu obliczenia wartości Ct dla DNA wirusa HBV i DNA standardu HBV QS. Tablica swoistych dla danej serii stałych kalibracji, dołączona do testu COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV, v2.0, jest wykorzystywana do obliczania wartości miana próbek i kontroli na podstawie wartości Ct DNA wirusa HBV oraz DNA standardu HBV QS. Test COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV, v2.0, jest wystandaryzowany według międzynarodowego standardu WHO dla DNA wirusa zapalenia wątroby typu B do oznaczeń opartych na technologii kwasów nukleinowych NAT (WHO International Standard for Hepatitis B Virus DNA for Nucleic Acid Technology [NAT] Assays Testing) (NIBSC 97/746) 29, a wyniki miana są przedstawiane w jednostkach międzynarodowych (IU/ml). 05909813001-06PL 6 Doc Rev. 7.0

ODCZYNNIKI COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV Test, v2.0 (P/N: 04894570 190) HBV2 CS1 (Kaseta odczynników ze szklanymi cząsteczkami magnetycznymi do oznaczeń HBV) Szklane cząsteczki magnetyczne 93% izopropanol Xi 93% (wagowo) izopropanol HBV V2.0 72 testy 1 x 72 testy 1 x 7,0 ml Produkt drażniący F 93% (wagowo) izopropanol Produkt wysoce łatwopalny HBV2 CS2 (Kaseta odczynników lizujących do oznaczeń HBV) Cytrynian sodu dwuwodny 42,5% tiocyjanian guanidyny < 5% polidokanol 0,9% ditiotreitol Xn 42,5% (wagowo) tiocyjanian guanidyny 1 x 72 testy 1 x 78 ml Produkt szkodliwy N < 5% (wagowo) polidokanol Produkt niebezpieczny dla środowiska HBV2 CS3 Kaseta wieloodczynnikowa do oznaczeń HBV, zawierająca: Pase (Roztwór proteinazy) Bufor Tris < 0,05% EDTA Chlorek wapnia Octan wapnia 7,8% proteinaza Glicerol Xn 7,8% (wagowo) proteinaza 1 x 72 testy 1 x 3,8 ml Produkt szkodliwy 05909813001-06PL 7 Doc Rev. 7.0

EB, v2.0 (Bufor do elucji, v2.0) Bufor Tris-base 0,2% metyloparaben 1 x 8,1 ml HBV2 CS4 Kaseta odczynników swoistych dla testu do oznaczeń HBV, zawierająca: HBV QS, v2.0 (Standard ilościowy HBV Quantitation Standard, v2.0) Bufor Tris-HCl EDTA < 0,005% Poly ra RNA (syntetyczny) < 0,001% niezakaźny, linearyzowany, dwuniciowy plazmid DNA, zawierający wstawione sekwencje wiążące primer HBV i unikatowy region wiążący sondę 0,05% azydek sodu HBV MMX, v2.0 (Odczynnik HBV Master Mix, v2.0) Bufor Tricine Octan potasu Wodorotlenek potasu 0,09% azydek sodu Glicerol < 0,04% datp, dctp, dgtp, dutp < 0,003% primery sensowne i antysensowne HBV < 0,003% aptamer oligonukleotydowy < 0,003% znakowane barwnikami fluorescencyjnymi sondy oligonukleotydowe, swoiste dla HBV, oraz standard oznaczenia HBV Quantitation Standard < 0,05% polimeraza DNA Z05 (bakteryjna) < 0,1% enzym AmpErase (uracylo-n-glikozylaza) (bakteryjny) HBV Mn 2+ (Roztwór manganu) < 0,5% octan manganu Kwas octowy lodowaty 0,09% azydek sodu HBV H(+)C, v2.0 (Kontrola HBV wysoko dodatnia, v2.0) < 0,001% linearyzowany, dwuniciowy, plazmidowy DNA zawierający sekwencje HBV Ujemne osocze ludzkie, niereaktywne w testach na obecność przeciwciał przeciwko HCV, przeciwciał przeciwko HIV-1/2, antygenu HIV p24 oraz antygenu HBsAg; RNA HIV-1, RNA HCV i DNA HBV niewykrywalne przy użyciu metod PCR 0,1% substancja konserwująca ProClin 300 Xi (3:1) mieszanina 5-chloro-2-metylo-2H-izotiazolo-3-onu i 2-metylo-2H-izotiazolo-3-onu 1 x 72 testy 1 x 3,6 ml 1 x 3,4 ml 1 x 19,8 ml 6 x 1,0 ml Produkt drażniący R36/38: Działa drażniąco na oczy i skórę. R43: Może powodować uczulenie w kontakcie ze skórą. 05909813001-06PL 8 Doc Rev. 7.0

HBV L(+)C, v2.0 (Kontrola HBV nisko dodatnia, v2.0) < 0,001% linearyzowany, dwuniciowy, plazmidowy DNA zawierający sekwencje HBV Ujemne osocze ludzkie, niereaktywne w testach na obecność przeciwciał przeciwko HCV, przeciwciał przeciwko HIV-1/2, antygenu HIV p24 oraz antygenu HBsAg; RNA HIV-1, RNA HCV i DNA HBV niewykrywalne przy użyciu metod PCR 0,1% substancja konserwująca ProClin 300 Xi (3:1) mieszanina 5-chloro-2-metylo-2H-izotiazolo-3-onu i 2-metylo-2H-izotiazolo-3-onu 6 x 1,0 ml Produkt drażniący R36/38: Działa drażniąco na oczy i skórę. R43: Może powodować uczulenie w kontakcie ze skórą. CTM ( ) C [Kontrola ujemna COBAS TaqMan (osocze ludzkie)] Ujemne osocze ludzkie, niereaktywne w testach na obecność przeciwciał przeciwko HCV, przeciwciał przeciwko HIV-1/2, antygenu HIV p24 oraz antygenu HBsAg; RNA HIV-1, RNA HCV i DNA HBV niewykrywalne przy użyciu metod PCR 0,1% substancja konserwująca ProClin 300 Xi (3:1) mieszanina 5-chloro-2-metylo-2H-izotiazolo-3-onu i 2-metylo-2H-izotiazolo-3-onu 6 x 1,0 ml Produkt drażniący R36/38: Działa drażniąco na oczy i skórę. R43: Może powodować uczulenie w kontakcie ze skórą. HBV H(+)C, v2.0 Clip (Klips z kodem kreskowym dla kontroli HBV wysoko dodatniej, v2.0) HBV L(+)C, v2.0 Clip (Klips z kodem kreskowym dla kontroli HBV nisko dodatniej, v2.0) HBV ( ) C Clip (Klips z kodem kreskowym dla kontroli HBV ujemnej) 1 x 6 klipsy 1 x 6 klipsy 1 x 6 klipsy COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan Wash Reagent Odczynnik płuczący COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan (P/N: 03587797 190) PG WR (Odczynnik płuczący COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan ) Cytrynian sodu dwuwodny < 0,1% N-metyloizotiazolon-HCl PG WR 1 x 5,1 l 05909813001-06PL 9 Doc Rev. 7.0

OSTRZEŻENIA I ŚRODKI OSTROŻNOŚCI A. DO STOSOWANIA W DIAGNOSTYCE IN VITRO. B. Ten test służy do stosowania z ludzką surowicą lub osoczem ludzkim EDTA jako antykoagulanta. C. Nie pipetować za pomocą ust. D. Nie jeść, nie pić ani nie palić w obszarach roboczych laboratorium. Posługując się próbkami i odczynnikami z zestawów, stosować jednorazowe rękawice, fartuchy laboratoryjne oraz odpowiednią ochronę oczu. Dokładnie umyć ręce po pracy z próbkami i odczynnikami testowymi. E. Przy pobieraniu materiałów z fiolek kontroli unikać skażenia odczynników bakteriami lub rybonukleazą. F. Zaleca się używanie jałowych jednorazowych pipet oraz końcówek pipet niezawierających DNazy. G. Nie mieszać kontroli pochodzących z różnych serii lub różnych fiolek tej samej serii. H. Nie mieszać ze sobą kaset odczynników lub kontroli pochodzących z różnych zestawów. I. Nie otwierać kaset COBAS AmpliPrep; nie wymieniać, nie mieszać, nie usuwać ani nie dodawać butelek do kasety. J. Wyrzucić wszystkie niezużyte odczynniki, odpady i próbki, postępując zgodnie z przepisami krajowymi, federalnymi, stanowymi i lokalnymi. K. Nie używać zestawu po upływie daty ważności. L. Karty charakterystyki substancji niebezpiecznych (MSDS, ang. Material Safety Data Sheet) są na żądanie dostępne w miejscowym przedstawicielstwie firmy Roche. M. Z próbkami oraz kontrolami należy obchodzić się jak z materiałem zakaźnym, stosując bezpieczne procedury laboratoryjne, przedstawione w Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories 35 oraz w CLSI Document M29-A3 36. Dokładnie oczyścić i odkazić wszystkie powierzchnie robocze świeżo przygotowanym roztworem 0,5% podchlorynu sodu w wodzie dejonizowanej lub destylowanej. Uwaga: Dostępny w handlu płynny domowy wybielacz zawiera zazwyczaj podchloryn sodu w stężeniu 5,25%. Rozcieńczenie domowego wybielacza w stosunku 1:10 pozwoli uzyskać 0,5% roztwór podchlorynu sodu. N. PRZESTROGA: Odczynniki CTM ( ) C, HBV L(+)C, v2.0, oraz HBV H(+)C, v2.0, zawierają ludzkie osocze otrzymane z krwi ludzkiej. Materiał źródłowy został przebadany i uznany za niereaktywny pod względem obecności antygenu powierzchniowego wirusa zapalenia wątroby typu B (HBsAg), przeciwciał przeciwko HIV-1/2 oraz HCV, a także antygenu HIV p24. Badanie ujemnego osocza ludzkiego (Negative Human Plasma) przy zastosowaniu metod PCR nie wykazało wykrywalnej obecności RNA wirusa HIV-1, RNA wirusa HCV ani DNA wirusa HBV. Nie ma znanych metod testowych mogących zapewnić całkowitą pewność, że produkty pochodzące z krwi ludzkiej nie przenoszą czynników zakaźnych. Dlatego każdy materiał pochodzenia ludzkiego należy traktować jako potencjalnie zakaźny. z odczynnikami CTM ( ) C, HBV L(+)C, v2.0, oraz HBV H(+)C, v2.0, należy obchodzić się tak jak z materiałem zakaźnym, stosując bezpieczne procedury laboratoryjne, takie jak przedstawione w wytycznych Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories 35 oraz w dokumencie CLSI M29-A3 36. Dokładnie oczyścić i odkazić wszystkie powierzchnie robocze świeżo przygotowanym roztworem 0,5% podchlorynu sodu w wodzie dejonizowanej lub destylowanej. 05909813001-06PL 10 Doc Rev. 7.0

O. Odczynniki HBV QS, v2.0, HBV Mn 2+ oraz HBV MMX, v2.0, zawierają azydek sodu. Azydek sodu może reagować z instalacjami wodno-kanalizacyjnymi wykonanymi z ołowiu lub miedzi, tworząc silnie wybuchowe azydki metali. Usuwając roztwory zawierające azydek sodu przez wylewanie ich do zlewów laboratoryjnych, należy spłukać je dużą ilością wody, aby zapobiec gromadzeniu się azydków. P. Podczas pracy z jakimkolwiek odczynnikiem należy używać osłon na oczy oraz fartuchów laboratoryjnych i rękawic jednorazowych. Unikać kontaktu wymienionych materiałów ze skórą, oczami i błonami śluzowymi. Jeżeli dojdzie do kontaktu, natychmiast spłukać dużą ilością wody. Jeżeli nie zostaną podjęte odpowiednie środki, może dojść do oparzeń. w razie rozlania wspomnianych odczynników należy przed wytarciem plam rozcieńczyć je wodą. Q. Nie dopuszczać do kontaktu HBV2 CS2 i odpadów płynnych z aparatu COBAS AmpliPrep, zawierających tiocyjanian guanidyny, z roztworem podchlorynu sodu (wybielaczem). Takie mieszaniny mogą spowodować powstanie silnie toksycznego gazu. R. Podczas utylizacji zużytych zestawów do przetwarzania próbek COBAS AmpliPrep Sample Processing Units (SPU), zawierających tiocyjanian guanidyny, należy unikać ich kontaktu z roztworem podchlorynu sodu (wybielaczem). Takie mieszaniny mogą spowodować powstanie silnie toksycznego gazu. WYMAGANIA DOTYCZĄCE PRZECHOWYWANIA I UŻYTKOWANIA A. Nie zamrażać odczynników ani kontroli. B. Odczynniki HBV2 CS1, HBV2 CS2, HBV2 CS3 oraz HBV2 CS4 przechowywać w temperaturze 2 8 C. Nieużywane odczynniki zachowują stabilność do podanej daty ważności. Po otwarciu odczynniki zachowują stabilność przez 63 dni w temperaturze 2 8 C lub do upływu daty ważności, zależnie od tego, co nastąpi wcześniej. Odczynniki HBV2 CS1, HBV2 CS2, HBV2 CS3 oraz HBV2 CS4 można stosować maksymalnie przez łączny okres 64 godzin pracy w aparacie COBAS AmpliPrep. Pomiędzy kolejnymi cyklami pracy odczynniki należy przechowywać w temperaturze 2 8 C. C. Odczynniki HBV H(+)C, v2.0, HBV L(+)C, v2.0, oraz CTM ( ) C należy przechowywać w temperaturze 2 8 C. Kontrole te zachowują stabilność do upływu podanej daty ważności. Po otwarciu opakowania niewykorzystane do badania odczynniki należy wyrzucić. D. Klipsy z kodem kreskowym [HBV H(+)C, v2.0 Clip, HBV L(+)C, v2.0 Clip oraz HBV ( ) C Clip] należy przechowywać w temperaturze 2 30 C. E. Odczynnik PG WR przechowywać w temperaturze 2 30 C. PG WR zachowuje stabilność do upływu podanej daty ważności. Po otwarciu odczynnik zachowuje stabilność przez 28 dni w temperaturze 2 30 C lub do upływu daty ważności, zależnie od tego, co nastąpi wcześniej. MATERIAŁY DOSTARCZANE A. COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV Test, v2.0 (P/N: 04894570 190) HBV V2.0 HBV2 CS1 (Kaseta zawierająca szklane cząsteczki magnetyczne do oznaczeń HBV) HBV2 CS2 (Kaseta odczynników lizujących do oznaczeń HBV) HBV2 CS3 (Kaseta wieloodczynnikowa do oznaczeń HBV) HBV2 CS4 (Kaseta odczynników swoistych dla testu do oznaczeń HBV) HBV H(+)C, v2.0 (Kontrola HBV wysoko dodatnia, v2.0) 05909813001-06PL 11 Doc Rev. 7.0

HBV L(+)C, v2.0 (Kontrola HBV nisko dodatnia, v2.0) CTM ( ) C [Kontrola ujemna COBAS TaqMan (osocze ludzkie)] HBV H(+)C, v2.0 Clip (Klips z kodem kreskowym dla kontroli HBV wysoko dodatniej, v2.0) HBV L(+)C, v2.0 Clip (Klips z kodem kreskowym dla kontroli HBV nisko dodatniej, v2.0) HBV ( ) C Clip (Klips z kodem kreskowym dla kontroli HBV ujemnej) B. COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan Wash Reagent Odczynnik płuczący COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan (P/N: 03587797 190) PG WR PG WR (Odczynnik płuczący COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan ) MATERIAŁY WYMAGANE, LECZ NIEDOSTARCZANE Aparatura i oprogramowanie Aparat COBAS AmpliPrep Analizator COBAS TaqMan lub analizator COBAS TaqMan 48 Opcjonalnie: Stacja dokująca Opcjonalnie: Aparat cobas p 630 Program AMPLILINK w wersji serii 3.2 lub serii 3.3 Stacja robocza z drukarką do programu AMPLILINK Podręczniki programu AMPLILINK w wersji serii 3.2 lub 3.3: Instrukcja obsługi aparatu COBAS AmpliPrep, współpracującego z analizatorem COBAS TaqMan, analizatorem COBAS TaqMan 48, analizatorem COBAS AMPLICOR lub aparatem cobas p 630 oraz programem AMPLILINK w wersji serii 3.2 i 3.3 Instrukcja obsługi analizatora COBAS TaqMan (z opcjonalną stacją dokującą) do użytku z podręcznikiem programu AMPLILINK w wersji serii 3.2 i 3.3 Instrukcja obsługi analizatora COBAS TaqMan 48 do użytku z podręcznikiem programu AMPLILINK w wersji serii 3.2 i 3.3 Podręcznik programu AMPLILINK w wersji serii 3.2 do użytku z aparatem COBAS AmpliPrep, analizatorem COBAS TaqMan, analizatorem COBAS TaqMan 48 i analizatorem COBAS AMPLICOR lub Podręcznik programu AMPLILINK w wersji serii 3.3 do użytku z aparatem COBAS AmpliPrep, analizatorem COBAS TaqMan, analizatorem COBAS TaqMan 48, analizatorem COBAS AMPLICOR i aparatem cobas p 630 Opcjonalnie: Podręcznik użytkownika aparatu cobas p 630, oprogramowanie w wersji 2.2 05909813001-06PL 12 Doc Rev. 7.0

Materiały jednorazowe Jednostki SPU (Sample Processing Unit) Probówki wejściowe na próbki (ang. S-tube input) z klipsami z kodem kreskowym Statywy z końcówkami K Opakowanie zawierające probówki K 12 x 96 INNE MATERIAŁY WYMAGANE, LECZ NIEDOSTARCZANE Statyw na próbki (statyw SK24) Statyw na odczynnik Statyw na SPU Nośnik K Transporter nośników K Statyw na nośniki K Pipetory z barierą aerozolową lub końcówkami dodatniego wypierania niezawierającymi DNazy (pojemność 1000 µl)* Rękawice jednorazowe bezpudrowe Mieszadło wibracyjne * Dokładność pipetorów musi mieścić się w zakresie 3% podanej objętości. Tam gdzie jest to wymagane, należy używać pozbawionych DNazy końcówek z barierą aerozolową lub końcówek dodatniego wypierania w celu zapobieżenia skażeniu krzyżowemu między próbką i amplikonem. POBIERANIE, TRANSPORT I PRZECHOWYWANIE PRÓBEK Uwaga: Ze wszystkimi próbkami i kontrolami należy obchodzić się jak z materiałem potencjalnie zakaźnym. Uwaga: Test ten został zatwierdzony do badania wyłącznie ludzkiej surowicy lub ludzkiego osocza pobranego na EDTA jako antykoagulant. Badanie innych rodzajów próbek może dawać nieprawidłowe wyniki. A. Pobieranie próbek Test COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV, v2.0, jest przeznaczony do stosowania z próbkami osocza lub surowicy. Krew powinna być zbierana w probówkach do separacji surowicy SST lub w sterylnych probówkach z EDTA (lawendowa nakrętka) jako antykoagulantem. Krew pełną należy przechowywać w temperaturze 2 25 C nie dłużej niż 24 godziny. Oddzielić osocze lub surowicę od krwi pełnej w ciągu 24 godzin od pobrania, odwirowując próbkę (800 1600 x g przez 20 minut) w temperaturze pokojowej (15 30 C). Przenieść osocze lub surowicę do jałowej probówki polipropylenowej. Na rysunkach 4 i 5 przedstawiono dane dotyczące stabilności próbek, pochodzące z badań nad stabilnością próbek, przeprowadzonych z użyciem testu COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV, v2.0. 05909813001-06PL 13 Doc Rev. 7.0

3,0 Rysunek 4 Stabilność wirusa HBV we krwi pełnej (przechowywanej w probówkach na osocze z dodatkiem EDTA) Log 10 miana (IU/ml) 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Próbka 2-8 C <1 h 25-30 C 24 h 2-8 C 24 h Log 10 miana (IU/ml) 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 Rysunek 5 Stabilność wirusa HBV we krwi pełnej (przechowywanej w probówkach Serum Separator Tubes) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Próbka 2-8 C <1 h 25-30 C 24 h 2-8 C 24 h B. Transport próbek Transport krwi pełnej, osocza lub surowicy musi przebiegać zgodnie z przepisami krajowymi, federalnymi, państwowymi i lokalnymi dotyczącymi transportu czynników etiologicznych 37. Krew pełną należy transportować w temperaturze 2 25 C i odwirować w ciągu 24 godzin od pobrania. Osocze lub surowica mogą być transportowane w temperaturze 2 8 C lub zamrożone do temperatury od 20 C do 80 C. 05909813001-06PL 14 Doc Rev. 7.0

C. Przechowywanie próbek Próbki osocza lub surowicy można przechowywać w temperaturze 25 30 C do 3 dni, w temperaturze 2 8 C do 7 dni lub zamrożone w temperaturze od 20 C do 80 C co najmniej przez sześć tygodni. Zaleca się przechowywać próbki w porcjach 800 900 µl w sterylnych, polipropylenowych, zakręcanych probówkach o pojemności 2,0 ml (np. Sarstedt 72.694.006). Na rysunkach 6 i 7 przedstawiono dane dotyczące stabilności próbek, pochodzące z badań nad przechowywaniem próbek, przeprowadzonych z użyciem testu COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV, v2.0. 3,0 Rysunek 6 Stabilność wirusa HBV w osoczu z dodatkiem EDTA Log 10 miana (IU/ml) 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Próbka 2-8 C, 2 h 25-30 C, 3 dni 2-8 C, 7 dni -20 C, 6 tyg. -70 C, 6 tyg. Log 10 miana (IU/ml) 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 Rysunek 7 Stabilność wirusa HBV w surowicy 0,0 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Próbka 2-8 C, 2 h 25-30 C, 3 dni 2-8 C, 7 dni -20 C, 6 tyg. -70 C, 6 tyg. 05909813001-06PL 15 Doc Rev. 7.0

Próbki osocza i surowicy można zamrażać i rozmrażać do pięciu razy bez utraty DNA wirusa HBV. Na rysunkach 8 i 9 przedstawiono dane pochodzące z badań nad zamrażaniem i rozmrażaniem próbek, przeprowadzonych z użyciem testu COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV, v2.0 Rysunek 8 Wyniki oznaczania wirusa HBV po zastosowaniu do pięciu cykli zamrażania i rozmrażania (Z-R) próbki (osocze z dodatkiem EDTA) 3,0 Log 10 miana (IU/ml) 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 Próbka 0x Zamrażanie/rozmrażanie 3x Zamrażanie/rozmrażanie 5x Zamrażanie/rozmrażanie 3,0 Rysunek 9 Wyniki oznaczania wirusa HBV po zastosowaniu do pięciu cykli zamrażania i rozmrażania (Z-R) próbki (surowica) Log 10 miana (IU/ml) 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 Próbka 0x Zamrażanie/rozmrażanie 3x Zamrażanie/rozmrażanie 5x Zamrażanie/rozmrażanie 05909813001-06PL 16 Doc Rev. 7.0

INSTRUKCJA UŻYTKOWANIA Uwaga: Szczegółowe instrukcje obsługi, szczegółowy opis możliwych konfiguracji, drukowanych wyników oraz interpretacji znaczników, komentarzy i komunikatów błędów można znaleźć w (1) Podręczniku aparatu COBAS AmpliPrep, współpracującego z analizatorem COBAS TaqMan, analizatorem COBAS TaqMan 48, analizatorem COBAS AMPLICOR lub aparatem cobas p 630 oraz programem AMPLILINK w wersji serii 3.2 i 3.3; (2) Podręczniku obsługi analizatora COBAS TaqMan (z opcjonalną stacją dokującą) do użytku z Podręcznikiem programu AMPLILINK w wersji serii 3.2 i 3.3; (3) Podręczniku analizatora COBAS TaqMan 48 do użytku z Podręcznikiem programu AMPLILINK w wersji serii 3.2 i 3.3; (4) Podręczniku programu AMPLILINK w wersji serii 3.2, współpracującego z aparatem COBAS AmpliPrep, analizatorem COBAS TaqMan, analizatorem COBAS TaqMan 48 i analizatorem COBAS AMPLICOR, lub Podręczniku programu AMPLILINK w wersji serii 3.3 do użytku z aparatem COBAS AmpliPrep, analizatorem COBAS TaqMan, analizatorem COBAS TaqMan 48, analizatorem COBAS AMPLICOR i aparatem cobas p 630; (5) Opcjonalnie: Podręcznik użytkownika aparatu cobas p 630, oprogramowanie w wersji 2.2. Wielkość serii Każdy zestaw zawiera odczynniki wystarczające do 72 testów, które można przeprowadzać w seriach liczących 12 24 testów. Każda seria musi obejmować co najmniej jedną kontrolę [CTM ( ) C, HBV L(+)C, v2.0 oraz HBV H(+)C, v2.0] (patrz rozdział Kontrola jakości ). Przebieg pracy Przebieg pracy analizatora COBAS TaqMan lub analizatora COBAS TaqMan 48 należy rozpocząć w ciągu 120 minut od zakończenia przygotowywania próbki i kontroli. Uwaga: Przetworzonych próbek i kontroli nie zamrażać ani nie przechowywać. Przygotowanie próbki i kontroli Uwaga: W przypadku stosowania próbek zamrożonych należy je pozostawić w temperaturze pokojowej (15 30 C) do całkowitego rozmrożenia i przed użyciem wymieszać na mieszadle wibracyjnym przez 3 5 sekund. Przed użyciem należy wyjąć kontrole z miejsca przechowywania o temperaturze 2 8 C i pozostawić do ogrzania się do temperatury pokojowej. Przygotowanie aparatu COBAS AmpliPrep Część A. Konserwacja i płukanie A1. Aparat COBAS AmpliPrep w trybie oczekiwania (stnad by) jest gotowy do pracy. A2. Włącz stację roboczą programu AMPLILINK za pomocą przycisku ON. Przygotuj stację roboczą do pracy w następujący sposób: a. Zaloguj się do systemu operacyjnego Windows XP. b. Dwukrotnie kliknij ikonę programu AMPLILINK. c. Zaloguj się do programu AMPLILINK, wprowadzając przydzielony identyfikator użytkownika i hasło. A3. Skontroluj stan odczynnika PG WR na ekranie Status i w razie potrzeby wymień go. A4. Wykonaj wszystkie czynności konserwacyjne wyszczególnione w zakładce Due. Aparat COBAS AmpliPrep automatycznie przepłucze system. 05909813001-06PL 17 Doc Rev. 7.0

Część B. Ładowanie kaset odczynników Uwaga: Wszystkie kasety odczynników należy wyjąć z miejsca przechowywania o temperaturze 2 8 C, natychmiast załadować do aparatu COBAS AmpliPrep i pozostawić do ogrzania się do temperatury pokojowej wewnątrz aparatu co najmniej przez 30 minut przed rozpoczęciem przetwarzania pierwszej próbki. Nie dopuszczać do ogrzania się kaset z odczynnikami do temperatury pokojowej poza aparatem ze względu na możliwość skraplania pary na etykietach z kodem kreskowym. w przypadku pojawienia się skroplonej pary nie ścierać jej z etykiet z kodem kreskowym. B1. Umieść kasetę HBV2 CS1 w statywie na odczynniki. Umieść kasety HBV2 CS2, HBV2 CS3 i HBV2 CS4 w osobnym statywie na odczynniki. B2. Włóż statyw na odczynniki zawierający HBV2 CS1 na pozycję A w aparacie COBAS AmpliPrep. B3. Włóż statyw na odczynniki zawierający HBV2 CS2, HBV2 CS3 i HBV2 CS4 na pozycję B, C, D lub E w aparacie COBAS AmpliPrep. (Dodatkowe informacje zamieszczono w tabeli 1.) Część C. Ładowanie materiałów jednorazowych Uwaga: Określ liczbę potrzebnych kaset odczynników COBAS AmpliPrep, jednostek SPU, probówek wejściowych próbki (S-tube), końcówek K oraz probówek K. Każda próbka lub kontrola wymaga użycia jednej jednostki SPU, jednej probówki wejściowej S, jednej końcówki K i jednej probówki K. Aparat COBAS AmpliPrep, współpracujący z analizatorem COBAS TaqMan lub analizatorem COBAS TaqMan 48, charakteryzuje się wieloma możliwościami ustawień przebiegu pracy. Szczegółowe informacje patrz tabela 1, poniżej. w zależności od wybranego ustawienia przebiegu pracy załaduj odpowiednią liczbę statywów z kasetami odczynników, statywów na próbki z probówkami wejściowymi S, statywów z jednostkami SPU, statywów z końcówkami K, statywów z probówkami K oraz nośników K w statywach na nośniki K na odpowiednie pozycje w aparacie COBAS AmpliPrep (dodatkowe informacje, patrz tabela 1). C1. Umieść jednostkę(-tki) SPU w statywie(-ach) i załaduj statyw(-y) na odpowiednie pozycje J, K lub L w aparacie COBAS AmpliPrep. C2. W zależności od wybranego ustawienia przebiegu pracy włóż pełny(-e) statyw(-y) probówek K na pozycje M, N, O lub P w aparacie COBAS AmpliPrep. C3. Załaduj pełny(-e) statyw(-y) z końcówkami K na pozycje M, N, O lub P w aparacie COBAS AmpliPrep. C4. W przypadku wybranego przebiegu pracy nr 3 analizatora COBAS TaqMan 48 włóż nośniki K do statywu(-ów) na nośniki K w miejsca M & N lub O & P w aparacie COBAS AmpliPrep. 05909813001-06PL 18 Doc Rev. 7.0

Tabela 1 Możliwości ustawień przebiegu pracy aparatu COBAS AmpliPrep z analizatorem COBAS TaqMan lub analizatorem COBAS TaqMan 48 1 2 3 Przebieg pracy Aparat COBAS AmpliPrep plus stacja dokująca plus analizator COBAS TaqMan Aparat COBAS AmpliPrep plus analizator COBAS TaqMan Aparat COBAS AmpliPrep plus analizator (analizatory) COBAS TaqMan 48 Sposób przeniesienia do analizatora COBAS TaqMan lub analizatora COBAS TaqMan 48 Automatyczne przenoszenie nośnika K Ręczne przenoszenie probówek K w statywie(-ach) na próbki do analizatora COBAS TaqMan Ręczne przenoszenie nośnika K za pomocą statywu(-ów) na nośniki K do analizatora COBAS TaqMan 48 Statywy, zasobniki i materiały jednorazowe Probówki K w pełnych statywach na probówki K Końcówki K w pełnych statywach na końcówki K Probówki wejściowe S zawierające próbki oraz kontrole w statywach na próbki Jednostki SPU w statywach na zestawy SPU Odczynnik CS1 w statywie na kasety Odczynniki CS2, CS3, CS4 w statywie na kasety Probówki K w pełnych statywach na probówki K Końcówki K w pełnych statywach na końcówki K Probówki wejściowe S zawierające próbki oraz kontrole w statywach na próbki Jednostki SPU w statywach na zestawy SPU Odczynnik CS1 w statywie na kasety Odczynniki CS2, CS3, CS4 w statywie na kasety Po zakończeniu przetwarzania próbki: Probówki K w statywach na próbki (gotowe do przeniesienia ręcznego) Probówki K w statywach na próbki Końcówki K w pełnych statywach na końcówki K Probówki wejściowe S zawierające próbki oraz kontrole w statywach na próbki Jednostki SPU w statywach na zestawy SPU Odczynnik CS1 w statywie na kasety Odczynniki CS2, CS3, CS4 w statywie na kasety Puste nośniki K z kodem kreskowym w statywie na nośniki K Po zakończeniu przetwarzania próbki: Probówki K w nośniku K w statywie na zasobniki Pozycja w aparacie COBAS AmpliPrep M P M P F H J L A B E M P M P F H J L A B E Jak powyżej (F H) F H M P F H J L A B E M P Jak powyżej (M P) 05909813001-06PL 19 Doc Rev. 7.0

Część D. Tworzenie zleceń i ładowanie próbek D1. Przygotuj statywy na próbki w sposób opisany poniżej. Do każdej pozycji statywu na próbki, gdzie zostanie umieszczony materiał próbki (probówka S), przymocuj klips opatrzony etykietą z kodem kreskowym. Do każdej pozycji statywu na próbki, gdzie zostanie umieszczony materiał kontroli (probówka S), przymocuj odpowiedni klips opatrzony etykietą z kodem kreskowym dla danej kontroli [CTM ( ) C, HBV L(+)C, v2.0, oraz HBV H(+)C, v2.0]. CTM ( ) C należy umieścić w statywie na próbki za ostatnią próbką kliniczną lub kontrolą dodatnią [HBV L(+)C, v2.0 lub HBV H(+)C, v2.0] w każdej serii 12 24 testów. Klipsy z kodami kreskowymi dla kontroli powinny mieć takie same numery serii jak numery serii fiolek kontroli w zestawie. Zwróć uwagę, aby odpowiednie kontrole umieścić na pozycjach z odpowiednim klipsem z kodem kreskowym kontroli. Na każdej pozycji oznaczonej klipsem z kodem kreskowym umieść jedną probówkę wejściową S. D2. Utwórz zlecenia dla poszczególnych próbek i kontroli przy pomocy programu AMPLILINK w oknie Orders w zakładce Sample. Wybierz odpowiedni plik definicji testu i zakończ procedurę poprzez zapisanie. D3. W oknie Orders w zakładce Sample Rack przypisz zlecenia dla próbek i kontroli do pozycji statywów na próbki. Należy wprowadzić numer statywu na próbki dla statywu przygotowanego w punkcie D1. D4. Wydrukuj raport Sample Rack Order, który będzie służyć jako arkusz roboczy. D5. Przygotuj statywy na próbki i kontrole w miejscu pracy wyznaczonym do dodawania próbek i kontroli, jak opisano poniżej. Zworteksuj każdą próbkę i kontrolę [CTM ( ) C, HBV L(+)C, v2.0, oraz HBV H(+)C, v2.0] przez 3 5 sekund. Unikaj zanieczyszczenia rękawic podczas manipulacji próbkami i kontrolami. D6. Przenieś 650 µl każdej próbki i kontroli [CTM ( ) C, HBV L(+)C, v2.0, oraz HBV H(+)C, v2.0] do odpowiedniej, oznaczonej kodem kreskowym probówki wejściowej S-tube za pomocą mikropipetora z barierą aerozolową lub końcówkami dodatniego wypierania wolnych od DNazy. Unikaj przenoszenia cząstek stałych i/lub skrzepów fibrynowych z oryginalnej próbki do probówki wejściowej S. Próbki i kontrole należy przenieść na pozycje probówek zgodnie z przygotowanym i zapisanym w punkcie D4 arkuszem roboczym. Klipsy z kodami kreskowymi dla kontroli powinny mieć takie same numery serii jak numery serii fiolek kontroli w zestawie. Przypisz odpowiednie kontrole do właściwych pozycji z odpowiednim klipsem z kodem kreskowym kontroli. Unikaj zanieczyszczenia górnej części probówek S materiałem próbki lub kontroli. D7. W przypadku używania aparatu cobas p 630 informacje na temat przygotowywania próbek można znaleźć w Podręczniku użytkownika aparatu cobas p 630. D8. W przypadku przebiegów pracy 1 i 2 (tab. 1) statyw(-y) na próbki, wypełnione probówkami wejściowymi S, umieść na pozycjach F, G lub H w aparacie COBAS AmpliPrep. D9. W przypadku przebiegu pracy 3 (tab. 1) z użyciem analizatora COBAS TaqMan 48 statyw(-y) na próbki z probówkami wejściowymi S oraz probówkami K (po jednej dla każdej z probówek wejściowych S, umieszczonej w prawym położeniu i sąsiadującej z probówką wejściową S) umieść na pozycjach F, G lub H w aparacie COBAS AmpliPrep. Część E. Rozpoczęcie przebiegu pracy aparatu COBAS AmpliPrep E1. Przy użyciu programu AMPLILINK uruchom aparat COBAS AmpliPrep. 05909813001-06PL 20 Doc Rev. 7.0

Część F. Zakończenie przebiegu pracy aparatu COBAS AmpliPrep i transfer do analizatora COBAS TaqMan lub analizatora COBAS TaqMan 48 (dotyczy wyłącznie przebiegu pracy nr 2 i 3) F1. Sprawdź, czy nie pojawiły się oflagowania lub komunikaty o błędzie. F2. Usuń z aparatu COBAS AmpliPrep przetworzone próbki i kontrole, znajdujące się w statywach na próbki (w przypadku analizatora COBAS TaqMan bez stacji dokującej) lub w statywach na nośniki K (w przypadku analizatora COBAS TaqMan 48), w zależności od ustawienia przebiegu pracy (szczegółowe informacje przedstawiono w części G). F3. Usuń odpady z aparatu COBAS AmpliPrep. Uwaga: Przetworzonych próbek i kontroli po zakończeniu ich przygotowywania nie należy wystawiać na działanie światła. Amplifikacja i detekcja Konfiguracja analizatora COBAS TaqMan lub analizatora COBAS TaqMan 48 Przebieg pracy analizatora COBAS TaqMan lub analizatora COBAS TaqMan 48 należy rozpocząć w ciągu 120 minut od zakończenia przygotowywania próbki i kontroli w aparacie COBAS AmpliPrep. Uwaga: Przetworzonych próbek i kontroli nie zamrażać ani nie przechowywać. Część G. Ładowanie przetworzonych próbek G1. W zależności od wybranej konfiguracji przebiegu pracy aparatu wykonaj odpowiednie czynności w celu przeniesienia probówek K do analizatora COBAS TaqMan lub analizatora COBAS TaqMan 48. Przebieg pracy 1: Przebieg pracy 2: Przebieg pracy 3: Automatyczne przenoszenie nośnika K przez stację dokującą do analizatora COBAS TaqMan. Interwencja ręczna jest niepotrzebna. Ręczne przenoszenie probówek K w statywie(-ach) na próbki do analizatora COBAS TaqMan. Ręczne przenoszenie nośnika K w statywie(-ach) na nośniki K do analizatora COBAS TaqMan 48. Ręczne przenoszenie nośników K do analizatora COBAS TaqMan 48 przy użyciu transportera nośników K. Część H. Rozpoczęcie przebiegu pracy analizatora COBAS TaqMan lub analizatora COBAS TaqMan 48 H1. Uruchom analizator COBAS TaqMan lub analizator COBAS TaqMan 48 przy użyciu jednej z poniższych opcji, zależnie od wybranych konfiguracji przebiegu pracy. Przebieg pracy 1: Nie ma potrzeby przeprowadzania żadnych operacji. Przebieg pracy 2: Automatyczny start pracy analizatora COBAS TaqMan po załadowaniu statywu(-ów) na próbki. Przebieg pracy 3: Jeśli w nośniku K jest mniej niż 6 probówek K, wypełnij nośnik pustymi probówkami K. Wypełnianiem steruje oprogramowanie AMPLILINK. Otwórz pokrywę termocyklera, załaduj nośnik K i zamknij pokrywę. Rozpocznij przebieg pracy analizatora COBAS TaqMan 48. 05909813001-06PL 21 Doc Rev. 7.0