(86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: , PCT/US03/036126

PL 217296 B1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 217296 (21) Numer zgłoszenia: 377794 (13) B1 Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (22) Data zgłoszenia: 14.11.2003 (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: 14.11.2003, PCT/US03/036126 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego: 03.06.2004, WO04/045512 (51) Int.Cl. C07K 16/28 (2006.01) (54) Wyizolowane ludzkie przeciwciało monoklonalne, wytwarzająca je hybrydoma, kodujący to przeciwciało wektor ekspresyjny i zawierająca je kompozycja farmaceutyczna, immunokoniugat, bispecyficzna lub multispecyficzna cząsteczka obejmująca kwasy nukleinowe kodujące ciężki i lekki łańcuch transfektoma, ich zastosowania, zwłaszcza w medycynie, obejmująca te kwasy ex vivo eukariotyczna lub prokariotyczna komórka gospodarza oraz nie będące człowiekiem zwierzę transgeniczne lub roślina, sposób in vitro hamowania wzrostu i/lub proliferacji komórek wyrażających CD25 lub eliminowania komórek wyrażających CD25, sposób wykrywania w próbce obecności antygenu CD25 lub komórki wyrażającej CD25, zestaw diagnostyczny do wykrywania w próbce obecności antygenu CD25 lub komórki wyrażającej CD25 (30) Pierwszeństwo: 15.11.2002, US, 60/426,690 (43) Zgłoszenie ogłoszono: 20.02.2006 BUP 04/06 (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: 31.07.2014 WUP 07/14 (73) Uprawniony z patentu: GENMAB A/S, Kopenhaga, DK (72) Twórca(y) wynalazku: JANINE SCHUURMAN, Amsterdam, NL CATHARINA EMANUELE GERARDA HAVENITH, Bodegraven, NL PAUL PARREN, Odijk, NL JAN G. J. VAN DE WINKEL, Zeist, NL DENISE LEAH WILLIAMS, San Jose, US JØRGEN PETERSEN, Rungsted Kyst, DK OLE BAADSGAARD, Malmø, SE (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Agnieszka Żebrowska-Kucharzyk

2 PL 217 296 B1 Opis wynalazku Zgłoszenia pokrewne Niniejsze zgłoszenie zastrzega pierwszeństwo z tymczasowego zgłoszenia patentowego USA nr serii 60/426 690, złożonego 15 listopada 2002, którego ujawnienie włącza się niniejszym jako odnośnik literaturowy. Charakteryzujący się wysokim powinowactwem receptor dla interleukiny 2 (IL-2R) jest heterotrimerycznym receptorem umiejscowionym na powierzchni komórkowej, złożonym z łańcuchów polipeptydowych α, β i γ c (K D 10-11 M). Łańcuch α o 55 kda, znany również jako IL-2Rα, CD25, p55 i antygen Tac (aktywacji komórek T) jest unikatowy dla IL-2R. Łańcuchy β (CD122, P75) i γ c (CD132) są częścią nadrodziny receptorów cytokin (receptory dla hematopoetyny) i są funkcjonalnymi składnikami innych receptorów dla cytokin, takich jak IL-15R (Waldmann (1993) Immunol. Todzień 14 (6): 264-70, Ellery i wsp. (2002) Cytokine Growth Factor Rev. 13 (1): 27-40). Charakteryzujący się średnim powinowactwem receptor jest dimerem złożonym z łańcucha β i γ c (K D 10-9 M), podczas gdy receptor charakteryzujący się niskim powinowactwem składa się z monomerycznej podjednostki α, która nie posiada zdolności przekazywania sygnału (K D 10-8 M) (Waldmann (1993) Immunol. Today 14 (6): 264-70). Spoczynkowe komórki T, komórki B i monocyty wytwarzają niewiele cząsteczek CD25. Chociaż, po aktywacji receptor jest szybko transkrybowany i wytwarzany (Ellery i wsp. (2002) Cytokine Growth Factor Rev. 13 (1): 27-40, Morris i wsp. (2000) Ann. Rheum. Dis. 59 (Suppl. 1): 109-14). Komórki produkujące IL-2R o wysokim powinowactwie wytwarzają CD25 (podjednostkę CD25) w nadmiarze, co prowadzi do uzyskania profili wiązania IL-2, zarówno o wysokim powinowactwie, jak i niskim (Waldmann i wsp. (1993) Blood 82 (6): 1701-12, de Jong i wsp. (1996) J. Immunol.156 (4): 1339-48). CD25 jest wytwarzane na wysokim poziomie przez komórki T w niektórych chorobach autoimmunologicznych, takich jak reumatoidalne zapalenie stawów, twardzina skóry i zapalenie błony naczyniowej oka, jak również w chorobach skóry, np. łuszczycy i atopowym zapaleniu skóry i w różnych nowotworach limfoidalnych, np. białaczce limfatycznej z komórek T i w ziarnicy złośliwej (Waldmann (1993) Immunol. Todzień 14 (6): 264-70, Kuttler i wsp. (1999) J. Mol. Med. 77 (1): 226-9). Dodatkowo, wytwarzanie CD25 związane jest z odrzuceniem aloprzeszczepu i reakcjami przeszczepu przeciw gospodarzowi (Jones i wsp. (2002) J. Immunol. 168 (3): 1123-1130, Anasetti i wsp. (1994) Blood 84 (4): 1320-7). Zatem, CD25 jest ważnym miejscem docelowym dla terapii z wykorzystaniem przeciwciał, przykładowo w redukcji zapalenia w chorobach autoimmunologicznych, leczeniu nowotworów i zapobieganiu odrzucenia przeszczepu. Jednakże, pomimo, że uzyskane wyniki i badania kliniczne jasno wskazują na CD25 jako przydatne miejsce docelowe dla immunoterapii, pokazują one również, że dostępne obecnie przeciwciała mysie i chimeryczne nie stanowią idealnych czynników terapeutycznych. Zatem, istnieje zapotrzebowanie na dalsze przeciwciała terapeutyczne skierowane wobec CD25, które są skuteczne w zapobieganiu i/lub leczeniu szeregu chorób, w których zaangażowane są komórki wyrażające CD25. Wynalazek niniejszy ma na celu dostarczenie nowych leków z przeciwciał użytecznych do leczenia i/lub zapobiegania chorobom, w których zaangażowane są komórki wyrażające CD25, w tym odrzucenia przeszczepu narządu, tkanki i komórki, włączając odrzucenie aloprzeszczepu i heteroprzeszczepu, reakcję przeszczepu przeciw gospodarzowi, chorobom autoimmunologicznym, procesom zapalnym i nadmiernej proliferacji skóry oraz, pośród innych, nowotworom limfoidalnym. Przeciwciała objęte wynalazkiem są udoskonalone przez to, że są w pełni ludzkie, a zatem są potencjalnie mniej immunogenne u pacjentów. Przeciwciała są także korzystne dzięki ich nadrzędnym cechom funkcjonalnym (np. terapeutycznym). Jak przedstawiono w niniejszym opisie, przeciwciała ludzkie według wynalazku wiążą się z CD25 w badaniach testu ELISA lub cytometrii przepływowej. Przeciwciała ludzkie według wynalazku zazwyczaj wiążą się z CD25 ze stałą równowagi reakcji dysocjacji (K D ) równą w przybliżeniu 10-8 M lub mniej, jak 10-9 M, lub mniej, 10-10 M, lub mniej, lub 10-11 M, lub jeszcze mniej, wówczas, gdy wielkość ta jest określana za pomocą rezonansu plazmonów powierzchniowych (SPR) w urządzeniu BIAcore 3000, przy użyciu zrekombinowanego ludzkiego IL-2Ra jako liganda i przeciwciała jako składnika oznaczanego. Przeciwciała takie zazwyczaj nie reagują krzyżowo z pokrewnymi antygenami powierzchniowymi komórki i nie hamują zatem ich funkcji. Ponadto, przeciwciała ludzkie według niniejszego wynalazku hamują (np. blokują) oddziaływanie CD25 z jego ligandem, IL-2. Przykładowo, wiązanie może być zahamowane w około 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% lub 100%. Przykłady komórek, które wyrażają CD25 i których

PL 217 296 B1 3 funkcje komórkowe mogą być zatem hamowane przez przeciwciała ludzkie według wynalazku obejmują między innymi komórki T, komórki B i monocyty. Przykładowo, jak opisano w niniejszym opisie, przeciwciała ludzkie według wynalazku mogą hamować wiązanie IL-2 z CD25. Takie hamowanie wiązania IL-2 z CD25 hamuje jednocześnie różne mechanizmy komórkowe indukowane przez wiązanie IL-2. Przeciwciała ludzkie według wynalazku, co również ujawniono w niniejszym opisie, mogą hamować proliferację komórek T indukowaną przeciwciałem anty-cd3 w sposób zależny od dawki. Jak wykazano niniejszym, przeciwciała ludzkie według wynalazku mogą hamować reakcję mieszanych limfocytów (MLR) w sposób zależny od dawki. Hamowanie proliferacji w takich doświadczeniach można monitorować przez obniżenie akumulacji masy komórkowej w pomiarach ELISA lub obniżenie inkorporacji BrdU do DNA komórkowego. W związku z powyższym, przedmiotem niniejszego wynalazku jest wyizolowane ludzkie przeciwciało monoklonalne, które wiąże ludzkie CD25 i hamuje wiązanie IL-2 z CD25, które to przeciwciało obejmuje regiony CDR1, CDR2 i CDR3 domeny V H i regiony CDR1, CDR2 i CDR3 domeny V L mające sekwencje aminokwasowe jak określono poniżej: (i) SEKW. NR ID.: 23, 24, 25, 26, 27 i 28; (ii) SEKW. NR ID.: 29, 30, 31, 32, 33 i 34; (ii) SEKW. NR ID.: 35, 36, 37, 38, 39 i 40; (iv) SEKW. NR ID.: 17, 18, 19, 20, 21 i 22. Korzystnie, przeciwciało to wiąże ludzkie CD25 i hamuje wiązanie IL-2 z CD25, które to przeciwciało obejmuje regiony zmienne ludzkiego łańcucha ciężkiego i ludzkiego łańcucha lekkiego kappa obejmujące sekwencje aminokwasowe przedstawione, odpowiednio, w SEKW. NR ID.: 10 i 8, SEKW. NR ID.: 14 i 16, SEKW. NR ID.: 2 i 4, SEKW. NR ID.: 10 i 12. W innym, korzystnym wykonaniu przeciwciało to jest kodowane przez kwasy nukleinowe ludzkiego łańcucha ciężkiego i ludzkiego łańcucha lekkiego kappa obejmujące sekwencje nukleotydowe ich regionów zmiennych przedstawione, odpowiednio, w SEKW. NR ID.: 5 i 7, SEKW. NR ID.: 13 i 15, SEKW. NR ID.: 1 i 3 lub SEKW. NR ID.: 9 i 11. Korzystnie, przeciwciało obejmuje: (i) sekwencję aminokwasową regionu zmiennego łańcucha ciężkiego pochodzącą z ludzkiej sekwencji zarodkowej V H 1-69/JH4b lub V H 1-69/JH5b i sekwencję aminokwasową regionu zmiennego łańcucha lekkiego pochodzącą z ludzkiej sekwencji zarodkowej A27/J K 4 lub A27/J K 5; lub (ii) sekwencję aminokwasową regionu zmiennego łańcucha ciężkiego pochodzącą z ludzkiej sekwencji zarodkowej V H 1-69/D7-27/JH4b lub V H 1-69/D7-27/JH5b i sekwencję aminokwasową regionu zmiennego łańcucha lekkiego pochodzącą z ludzkiej sekwencji zarodkowej A27/J K 4 lub A27/J K 5. W szczególnie korzystnej postaci przeciwciało wybrane jest z grupy składającej się z: przeciwciała IgG1, lgg2, lgg3, lgg4, IgM, IgA1, lga2, wydzielniczego IgA, IgD i IgE. Przeciwciało według wynalazku oddysocjowuje od ludzkiego CD25 ze stałą równowagi reakcji dysocjacji (K D ) około 10-8 M lub mniej, jak 10-9 M, lub mniej, 10-10 M, lub mniej, lub 10-11 M, lub jeszcze mniej, na podstawie badania rezonansu plazmonów powierzchniowych (SPR) w urządzeniu BIAcore 3000, przy użyciu ludzkich zrekombinowanych CD25 jako liganda i przeciwciała jako analitu. Korzystnie, przeciwciało według wynalazku posiada jedną lub więcej następujących cech: (a) swoistość wobec ludzkiego CD25, (b) hamuje wiązanie IL-2 z CD25, (c) eliminuje komórki T wytwarzające CD25, (d) przekształca komórki T w tolerancyjne, (e) hamuje proliferację komórek T wytwarzających CD25, (f) hamuje proliferację komórek T indukowaną przeciwciałem anty-cd3 z jednojądrowych komórek krwi obwodowej (PBMC), (g) hamuje reakcję mieszanych limfocytów (MLR), (h) zdolność internalizacji CD25 wytwarzanego na komórkach T. Przeciwciało według wynalazku korzystnie jest niezmienionym przeciwciałem wybranym z grupy składającej się z: niezmienionego przeciwciała IgG1, korzystnie niezmienionego przeciwciała IgG1, κ niezmienionego przeciwciała IgG1, λ, niezmienionego przeciwciała lgg2, korzystnie niezmienionego przeciwciała lgg2, K niezmienionego przeciwciała lgg2, λ, niezmienionego przeciwciała IgM, niezmienionego przeciwciała IgA1, niezmienionego przeciwciała lga2, niezmienionego przeciwciała wydzielniczego IgA, niezmienionego przeciwciała IgD i niezmienionego przeciwciała IgE, znamienne tym, że przeciwciało jest glikozylowane w komórce eukariotycznej.

4 PL 217 296 B1 W kolejnej korzystnej postaci wykonania przeciwciało według wynalazku jest fragmentem przeciwciała lub przeciwciałem o pojedynczym łańcuchu. Przeciwciało według wynalazku jest w korzystnej postaci immunoglobulinową fuzją białkową domeny wiążącej obejmującą: (i) region zmienny łańcucha ciężkiego lub region zmienny łańcucha lekkiego jak określono w zastrz. 1, który jest w fuzji z polipeptydowym regionem zawiasowym immunoglobuliny, (ii) immunoglobulinowy region stały CH2 łańcucha ciężkiego w fuzji z regionem zawiasowym i (iii) immunoglobulinowy region stały CH3 łańcucha ciężkiego w fuzji z regionem stałym CH2. Wynalazek niniejszy dotyczy również hybrydomy, która wytwarza ludzkie przeciwciało monoklonalne według wynalazku. Korzystnie, hybrydoma według wynalazku obejmuje komórkę B uzyskaną ze zwierzęcia transgenicznego nie będącego człowiekiem, w której w wyniku rearanżacji segmentów genów V-(D)-J uzyskano funkcjonalny transgen ludzkiego łańcucha ciężkiego i funkcjonalny transgen ludzkiego łańcucha lekkiego, w fuzji z unieśmiertelnioną komórką, która wytwarza w wykrywalnej ilości przeciwciało monoklonalne według wynalazku. Przedmiotem wynalazku jest także transfektoma obejmująca kwasy nukleinowe kodujące ludzki łańcuch ciężki i ludzki łańcuch lekki, która wytwarza wykrywalne ilości przeciwciał według wynalazku. Wynalazek dostarcza również ex vivo eukariotycznej lub prokariotycznej komórki gospodarza obejmującej kwasy nukleinowe kodujące ludzki łańcuch ciężki i ludzki łańcuch lekki, która wytwarza wykrywalne ilości przeciwciał według wynalazku. Kolejnym przedmiotem niniejszego wynalazku jest transgeniczne zwierzę nie będące człowiekiem lub roślina obejmujące kwasy nukleinowe kodujące ludzki łańcuch ciężki i ludzki łańcuch lekki, które wytwarzają w wykrywalnej ilości przeciwciało według wynalazku. Wynalazek dotyczy także wektora ekspresyjnego kodującego ludzkie przeciwciało monoklonalne według wynalazku. Przedmiotem wynalazku jest również kompozycja farmaceutyczna zawierająca przeciwciało według wynalazku lub wektor ekspresyjny według wynalazku i farmaceutycznie dopuszczany nośnik oraz, ewentualnie, zawierająca dodatkowy składnik terapeutyczny. W korzystnej postaci wykonania przeciwciało według wynalazku zawiera dodatkowo linker chelatorowy do przyłączania radioizotopu. W związku z powyższym, kolejnym przedmiotem niniejszego wynalazku jest immunokoniugat obejmujący przeciwciało według wynalazku połączone z czynnikiem cytotoksycznym, radioizotopem lub lekiem. Wynalazek dostarcza również bispecyficzną lub multispecyficzną cząsteczkę obejmującą przeciwciało według wynalazku i charakteryzuje się specyficznością wiązania dla CD3, CD4, IL-15R, TNF-α związanego z błoną lub związanego z receptorem lub IL-15 związanej z błoną lub związanej z receptorem. Przedmiotem niniejszego wynalazku jest sposób in vitro hamowania wzrostu i/lub proliferacji komórek wyrażających CD25 lub eliminowania komórek wyrażających CD25 obejmujący stosowanie przeciwciała, kompozycji, immunokoniugatu, bispecyficznej lub multispecyficznej cząsteczki według wynalazku, w którym wzrost i/lub proliferacja komórek jest hamowana lub gdzie zachodzi zastopowanie wyrażania CD25 i w którym komórką wyrażającą CD25 jest opcjonalnie aktywowana komórka T. Zgodnie z niniejszym wynalazkiem przedmiotem wynalazku są także przeciwciało, kompozycja, immunokoniugat, bispecyficzna lub multispecyficzna cząsteczka, lub wektor ekspresyjny według wynalazku do stosowania jako lek. Wynalazek dostarcza ponadto przeciwciało, kompozycję, immunokoniugat, bispecyficzną lub multispecyficzną cząsteczkę lub wektor ekspresyjny według wynalazku do stosowania w leczeniu lub zapobieganiu odrzucenia przeszczepu, reakcji przeszczep przeciw gospodarzowi, chorobie immunologicznej, autoimmunologicznej lub zapalnej, zapaleniu lub zaburzeniu nadmiernej proliferacji komórek skóry, zaburzenia hematologicznego, nowotworu, w którym jest korzystne zahamowanie naciekających regulatorowych komórek T CD25+ i nowotworu limfoidalnego, gdzie: (i) odrzucenie przeszczepu jest odrzuceniem aloprzeszczepu lub heteroprzeszczepu, u pacjentów przechodzących przeszczepienie narządu lub tkanki, jak przeszczep serca, płuca, łącznie sercapłuca, tchawicy, nerki, wątroby, trzustki, przełyku, jelita, skóry, kończyny, pępowiny, komórki macierzystej układu krwiotwórczego, komórki wyspy trzustkowej;

PL 217 296 B1 5 (ii) reakcja przeszczepu przeciw gospodarzowi jest wybrana z grupy składającej się z: reakcji przeszczepu przeciw gospodarzowi przy transfuzji krwi i reakcji przeszczepu przeciw gospodarzowi przy przeszczepie szpiku; (iii) choroba immunologiczna, autoimmunologiczna lub zapalna jest wybrana z grupy składającej się z: reumatoidalnego zapalenia stawów, zesztywniającego zapalenia stawów kręgosłupa, artropatii łuszczycowej, cukrzycy typu 1, cukrzycy typu 2 wymagającej insuliny, stwardnienia rozsianego, układowego tocznia rumieniowatego, miastenii ciężkiej, choroby zapalnej jelita, choroby Crohna, zapalenia okrężnicy wrzodziejącego, akrodynii, zespołu Sjögrena, zapaleń tętnicy, w tym zapalenia tętnicy skroniowej olbrzymiokomórkowego, niedokrwistości aplastycznej, astmy, twardzicy skóry i zapalenia błony naczyniowej oka; (iv) zapalenie lub zaburzenie nadmiernej proliferacji komórek skóry jest wybrane z grupy składającej się z: łuszczycy, w tym łuszczycy płytkowej, dłoniowo-stopowej łuszczycy krostkowej (PPP), liszaja płaskiego z nadżerkami, pęcherzycy pęcherzowej, pęcherzycy z oddzieleniem naskórka, kontaktowego zapalenia skóry i atopowego zapalenia skóry; (v) zaburzenie hematologiczne jest wybrane z grupy składającej się z: białaczki/chłoniaka dojrzałych komórek T, chłoniaka z anaplastycznymi komórkami dużymi, białaczki Iimfoblastycznej przewlekłej (CLL)/białaczki Iimfoblastycznej z komórkami małymi (SLL), chłoniaka z obwodowych komórek T i wtórnej skrobiawicy; (vi) nowotwór Iimfoidalny jest wybrany z grupy składającej się z: białaczki komórek T, choroby Hodgkina, białaczki kosmatokomórkowej lub chłoniaka skóry z limfocytów T, w tym ziarniniaka grzybiastego i zespołu Sezaryego; (vii) nowotwór, w którym jest korzystne zahamowanie naciekających regulatorowych komórek T CD25+ jest wybrany z grupy składającej się z raka żołądka, raków przełyku, czerniaka złośliwego, raka jelita grubego, raka trzustki, raka piersi, raka płuca małokomórkowego, raka płuca niemałokomórkowego, raka szyjki macicy, raka jajnika i raka komórek nerkowych. Korzystnie, to przeciwciało, kompozycja, immunokoniugat, bispecyficzna lub multispecyficzną cząsteczka lub wektor ekspresyjny stosuje się w leczeniu, które obejmuje oddzielne stosowanie u osobnika innego czynnika terapeutycznego i/lub terapii. Zgodnie z korzystną postacią wykonania kompozycja, przeciwciało, immunokoniugat, bispecyficzną lub multispecyficzną cząsteczka lub wektor ekspresyjny obejmują czynnik terapeutyczny, który jest: (i) czynnikiem immunosupresyjnym wybranym z grupy składającej się z: cyklosporyny, azatiopryny, kwasu mykofenolowego, mykofenolanu mofetylu, kortykosteroidów, takich jak prednizon, metotreksat, soli złota, sulfasalazyny, czynników przeciwmalarycznych, brekwinaru, leflunomidu, mizorybiny, 15-deoksyspergaliny, 6-merkaptopuryny, cyklofosfamidu, rapamycyny, takrolimusa (FK-506), OKT3 i globuliny przeciwtymocytowej; (ii) czynnikiem przeciwzapalnym wybranym z grupy składającej się z: leku steroidowego, NSAID (niesteroidowy lek przeciwzapalny) i DMARD, takie jak metotreksat, hydroksychlorochina, sulfasalazyna, leflunomid, czynników blokujących receptory dla IL-1, np. anakinra i czynników blokujących TNF-α, np. etanerceptu, infliksimabu i adalimumabu, przeciwciał anty-il-6r, CTLA4lg i przeciwciał anty-il-15; (iii) czynnikiem lub terapią do leczenia stanów zapalnych lub zaburzeń nadmiernej proliferacji skóry, wybranym z grupy składającej się z: smoły pogazowej, witaminy A, antraliny, kalcipotrienu, tarazotenu, kortykosteroidów, metotreksatu, retinoidów, np. acitretyny, cyklosporyny, etanerceptu, alefaceptu, efaluzimabu, 6-tioguaninu, mykofenoianu mofetylu, takrolimusu (FK-506), hydroksymocznika i fototerapii takiej jak UVB (promieniowanie ultrafioletowe typu B szerokopasmowe i wąskopasmowe), UVA (promieniowanie ultrafioletowe typu A) i PUVA (metoksalen psoralenu z promieniowaniem ultrafioletowym typu A); (iv) wybrany z grupy składającej się z: doksorubicyny, cisplatyny, bleomycyny, karmustyny, chlorambucylu i cyclofosfamidu. Kolejnym przedmiotem wynalazku jest przeciwciało, kompozycja, immunokoniugat, bispecyficzna lub multispecyficzna cząsteczka, lub wektor ekspresyjny według wynalazku do stosowania w leczeniu lub zapobieganiu: (a) odrzuceniu przeszczepu, reakcji przeszczep przeciw gospodarzowi, chorobie immunologicznej, autoimmunologicznej lub zapalnej, zapaleniu, lub zaburzeniu nadmiernej proliferacji komórek skóry i nowotworu limfoidalnego, gdzie:

6 PL 217 296 B1 (i) odrzucenie przeszczepu jest odrzuceniem aloprzeszczepu lub heteroprzeszczepu, u pacjentów przechodzących przeszczepienie narządu lub tkanki, jak przeszczep serca, płuca, łącznie sercapłuca, tchawicy, nerki, wątroby, trzustki, przełyku, jelita, skóry, kończyny, pępowiny, komórki macierzystej układu krwiotwórczego, komórki wyspy trzustkowej; (ii) reakcja przeszczepu przeciw gospodarzowi jest wybrana z grupy składającej się z: reakcji przeszczepu przeciw gospodarzowi przy transfuzji krwi i reakcji przeszczepu przeciw gospodarzowi przy przeszczepie szpiku; (iii) choroba immunologiczna, autoimmunologiczna lub zapalna jest wybrana z grupy składającej się z: reumatoidalnego zapalenia stawów, zesztywniającego zapalenia stawów kręgosłupa, artropatii łuszczycowej, cukrzycy typu 1, cukrzycy typu 2 wymagającej insuliny, stwardnienia rozsianego, układowego tocznia rumieniowatego, miastenii ciężkiej, choroby zapalnej jelita, choroby Crohna, zapalenia okrężnicy wrzodziejącego, akrodynii, zespołu Sjögrena, zapaleń tętnicy, w tym zapalenia tętnicy skroniowej olbrzymiokomórkowego, niedokrwistości aplastycznej, astmy, twardzicy skóry i zapalenia błony naczyniowej oka; (iv) zapalenie lub zaburzenie nadmiernej proliferacji komórek skóry jest wybrane z grupy składającej się z: łuszczycy, w tym łuszczycy płytkowej, dłoniowostopowej łuszczycy krostkowej (PPP), liszaja płaskiego z nadżerkami, pęcherzycy pęcherzowej, pęcherzycy z oddzieleniem naskórka, kontaktowego zapalenia skóry i atopowego zapalenia skóry; (v) nowotwór Iimfoidalny jest wybrany z grupy składającej się z: białaczki komórek T, choroby Hodgkina, białaczki kosmatokomórkowej lub chłoniaka skóry z limfocytów T, w tym ziarniniaka grzybiastego i zespołu Sezaryego; (vi) nowotworowi, w którym jest korzystne zahamowanie naciekających regulatorowych komórek T CD25+ i który jest wybrany z grupy składającej się z: raka żołądka, raków przełyku, czerniaka złośliwego, raka jelita grubego, raka trzustki, raka piersi, raka płuca małokomórkowego, raka płuca nie małokomórkowego, raka szyjki macicy, raka jajnika i raka komórek nerkowych lub (vii) zaburzeniu hematologicznemu wybranemu z grupy składającej się z: białaczki/chłoniaka dojrzałych komórek T, chłoniaka z anaplastycznymi komórkami dużymi, białaczki Iimfoblastycznej przewlekłej (CLL)/białaczki Iimfoblastycznej z komórkami małymi (SLL), chłoniaka z obwodowych komórek T i wtórnej skrobiawicy. Przedmiotem wynalazku jest dodatkowo sposób wykrywania w próbce obecności antygenu CD25 lub komórki wyrażającej CD25, który obejmuje: - kontaktowanie próbki z przeciwciałem określonym w dowolnym spośród zastrz. 1-10 w warunkach pozwalających na tworzenie kompleksu pomiędzy przeciwciałem i CD25 i - wykrywanie tworzenia kompleksu. Wynalazek dostarcza również zestaw diagnostyczny do wykrywania w próbce obecności antygenu CD25 lub komórki wyrażającej CD25, który obejmuje przeciwciało według wynalazku, przy czym przeciwciało jest ewentualnie połączone z wykrywalnym znacznikiem oraz instrukcje jego stosowania. Kolejnym przedmiotem wynalazku jest przeciwciało antyidiotypowe wiążące przeciwciało według wynalazku. Korzystnie, przeciwciało to wiąże się do przeciwciała, które ma regiony zmienne ludzkiego łańcucha ciężkiego i ludzkiego łańcucha lekkiego kappa obejmujące sekwencje aminokwasowe przedstawione, odpowiednio, w SEKW. NR ID.: 2 i 4, SEKW. NR ID.: 6 i 8, SEKW. NR ID.: 10 i 12, SEKW. NR ID.: 14 i 16. Wynalazek dotyczy ponadto zastosowania przeciwciała antyidiotypowego według wynalazku do wykrywania w próbce poziomu ludzkiego przeciwciała monoklonalnego wobec CD25. Jeszcze kolejnym przedmiotem wynalazku jest wyizolowane ludzkie przeciwciało monoklonalne, które wiąże się z epitopem na ludzkim CD25, jak przeciwciało zdefiniowane przez regiony zmienne ludzkiego ciężkiego łańcucha i ludzkiego lekkiego łańcucha kappa obejmujące sekwencje aminokwasowe przedstawione odpowiednio w SEKW. NR ID.: 6 i 8, SEKW. NR ID.: 14, SEKW. NR ID.: 2 i 4, SEKW. NR ID.: 10 i 12. 16. Jak zaznaczono powyżej, przeciwciała według wynalazku obejmują przeciwciała IgG1 (np. IgG1, K i IgG1,λ) i lgg4 (np. lgg4, K i lgg4, λ ). Jednakże, w niniejszym opisie ujawnione są także i inne izotypy przeciwciał, w tym lgg2, lgg3, IgM, IgA1, lga2, wydzielnicze IgA, IgD i IgE. W praktycznej realizacji wynalazku przeciwciała te mogą być całymi przeciwciałami lub ich fragmentami wiążącymi antygen, w tym przykładowo fragmentami Fab, Fab', F(ab) 2, F(ab') 2, Fv, pojedynczym łańcuchem Fv (scfv) lub przeciwciałami bispecyficznymi. Ponadto, fragmenty wiążące antygen obejmują immuno-

PL 217 296 B1 7 globulinowe fuzje białkowe domeny wiążącej obejmujące: (i) polipeptyd domeny wiążącej (taki jak region zmienny łańcucha ciężkiego lub region zmienny łańcucha lekkiego) w fuzji z peptydem regionu zawiasowego immunoglobuliny, (ii) stały region CH2 łańcucha ciężkiego immunoglobuliny w fuzji z regionem zawiasowym oraz (iii) stały region CH3 łańcucha ciężkiego immunoglobuliny w fuzji ze stałym regionem CH2. Takie immunoglobulinowe fuzje białkowe domeny wiążącej są ponadto ujawnione w opisach patentowych USA nr 2003/0 118 592 i 2003/0 133 939. Konkretne przeciwciała ludzkie obejmują te określone jako AB1, AB7, AB11 i AB12, kodowane przez kwasy nukleinowe ludzkiego łańcucha ciężkiego i ludzkiego łańcucha lekkiego kappa, obejmujące sekwencje nukleotydowe ich regionów zmiennych przedstawione, odpowiednio, w SEKW. NR ID.: 1, 5, 9 lub 13 i SEKW. NR ID.: 3, 7, 11 lub 15 oraz ich konserwatywne modyfikacje sekwencji. Przeciwciała ludzkie charakteryzują się posiadaniem ludzkiego łańcucha ciężkiego i regionów zmiennych ludzkiego łańcucha lekkiego kappa, obejmujących sekwencje aminokwasowe przedstawione, odpowiednio, w SEKW. NR ID.: 2, 6, 10 lub 14 i SEKW. NR ID.: 4, 8, 12 lub 16 oraz ich konserwatywne modyfikacje sekwencji. Zgodnie z niniejszym opisem określenie tolerancyjne", oznacza, że komórki T nie są zdolne do reakcji z antygenem po ponownej prowokacji tym antygenem. Ludzkie przeciwciała anty-cd25 według niniejszego wynalazku można przekształcać w pochodne, łączyć lub wspólnie wytwarzać z innymi właściwościami wiążącymi. W szczególnym wykonaniu, przeciwciała są połączone z jedną lub większą liczbą miejsc wiążących inny docelowy antygen, taki jak antygen na komórce efektorowej. Zgodnie z jednym aspektów niniejszy wynalazek dostarcza sposobu wykrywania in vitro lub in vivo obecności CD25 w próbce lub u osobnika, np. do diagnozowania chorób związanych z CD25, korzystnie we wczesnym stadium. Może być to także przydatne w monitorowaniu choroby i wpływu leczenia za pomocą przeciwciała anty-cd25 oraz w określaniu i dobieraniu dawki przeciwciała, jaka powinna być podana. W jednym wykonaniu, wykrywanie obecności CD25 w próbce odbywa się przez kontaktowanie badanej próbki, ewentualnie wraz z próbką kontrolną, z ludzkim przeciwciałem monoklonalnym według wynalazku w warunkach pozwalających na powstawanie kompleksu pomiędzy przeciwciałem i CD25. Następnie, wykrywane jest tworzenie kompleksu (np. przy użyciu ELISA, cytometrii przepływowej lub hybrydyzacji typu Western blot). Wówczas, gdy z badaną próbką stosowana jest próbka kontrolna, kompleks jest wykrywany w obu próbkach i statystycznie istotna różnica w powstawaniu kompleksu pomiędzy próbkami wskazuje na obecność CD25 w badanej próbce. Sposób in vivo można prowadzić przy użyciu techniki wizualizacji takich jak PET (ang. positron emission tomography) lub SPECT (ang. single photon emission computed tomography). Przeciwciała antyidiotypowe według wynalazku można stosować jako narzędzie immunodiagnostyczne do wykrywania i ilościowego oznaczania poziomów ludzkich przeciwciał monoklonalnych przeciw CD25 w laboratorium lub próbkach od pacjenta. Może to być przydatne do egzaminowania farmakokinetyki przeciwciała anty-cd25 lub określania i dobierania dawki przeciwciała anty-cd25 oraz monitorowania choroby i wpływu leczenia na pacjenta. Mysie przeciwciała antyidiotypowe można wytwarzać np. za pomocą immunizacji myszy Balb/C ludzkimi przeciwciałami monoklonalnymi według wynalazku i wytwarzania hybrydoma ze śledzion tych myszy przez fuzję z komórkami szpiczaka, takimi jak NSl przy użyciu standardowych technik. Jak opisano przykładowo w niniejszym opisie, przeciwciała ludzkie według wynalazku można uzyskać bezpośrednio z hybrydoma, które wytwarzają przeciwciało lub można sklonować (np. z hybrydoma lub faga, który prezentuje części przeciwciał wiążące antygen) i wytworzyć za pomocą technik rekombinacji w komórce gospodarza (np. komórce CHO (komórki jajowe chomika chińskiego)). Dalszymi przykładami komórek gospodarza są mikroorganizmy, takie jak E. coli i grzyby, takie jak drożdże. Alternatywnie, można je wytworzyć za pomocą technik rekombinacji w transgenicznym zwierzęciu nie będącym człowiekiem lub w roślinie. Zatem, w innym aspekcie, niniejszy wynalazek dostarcza sposobów wytwarzania ludzkich przeciwciał monoklonalnych, które wiążą się z ludzkim CD25. W jednym z wykonań, sposób obejmuje immunizację transgenicznego zwierzęcia nie będącego człowiekiem, np. transgeniczną mysz, jak opisano wcześniej (np. posiadającą genom obejmujący transgen ludzkiego łańcucha ciężkiego i transgen ludzkiego łańcucha lekkiego kodujący całe przeciwciało anty-cd25 według wynalazku lub jego część), oczyszczonym antygenem CD25 lub preparatem wzbogaconym w ludzki antygen CD25 i/lub komórkami wyrażającymi ludzki CD25. Następnie, ze zwierzęcia uzyskiwane są komórki B (np. komórki B ze śledziony) i poddawane fuzji z komórkami szpiczaka w celu utworzenia unieśmiertelnionych komórek hybrydom, które wydzielają ludzkie przeciwciała monoklonalne przeciw CD25.

8 PL 217 296 B1 Konkretne cechy i korzyści wynikające z niniejszego wynalazku staną się bardziej zrozumiałe dla specjalisty w dziedzinie po zapoznaniu z poniższym opisem i zastrzeżeniami. Krótki opis rysunku Na fig. 1 przedstawiono sekwencje aminokwasowe regionów VJ łańcucha lekkiego (kappa) ludzkich przeciwciał monoklonalnych AB1, AB7, AB11 i AB12 (SEKW. NR ID.: 4, 8, 12, i 16, odpowiednio) z zaprojektowanymi odcinkami CDR. Na fig. 2 przedstawiono sekwencje aminokwasowe regionów VDJ łańcucha ciężkiego ludzkich przeciwciał monoklonalnych AB1, AB7, AB11 i AB12 (SEKW. NR ID.: 2, 6, 10 i 14, odpowiednio) z zaprojektowanymi odcinkami CDR. Na fig. 3 przedstawiono sekwencję aminokwasową (SEKW. NR ID.: 2) i odpowiadającą sekwencję nukleotydową (SEKW. NR ID.: 1) regionu VDJ łańcucha ciężkiego ludzkiego przeciwciała monoklonalnego AB1 z zaprojektowanymi odcinkami CDR. Na fig. 4 przedstawiono sekwencję aminokwasową (SEKW. NR ID.: 4) i odpowiadającą sekwencję nukleotydową (SEKW. NR ID.: 3) regionu VJ łańcucha lekkiego (kappa) ludzkiego przeciwciała monoklonalnego AB1 z zaprojektowanymi odcinkami CDR. Na fig. 5 przedstawiono sekwencję aminokwasową (SEKW. NR ID.: 6) i odpowiadającą sekwencję nukleotydową (SEKW. NR ID.: 5) regionu VDJ łańcucha ciężkiego ludzkiego przeciwciała monoklonalnego AB7 z zaprojektowanymi odcinkami CDR. Na fig. 6 przedstawiono sekwencję aminokwasową (SEKW. NR ID.: 8) i odpowiadającą sekwencję nukleotydową (SEKW. NR ID.: 7) regionu VJ łańcucha lekkiego (kappa) ludzkiego przeciwciała monoklonalnego AB7 z zaprojektowanymi odcinkami CDR. Na fig. 7 przedstawiono sekwencję aminokwasową (SEKW. NR ID.: 10) i odpowiadającą sekwencję nukleotydową (SEKW. NR ID.: 9) regionu VDJ łańcucha ciężkiego ludzkiego przeciwciała monoklonalnego AB11 z zaprojektowanymi odcinkami CDR. Na fig. 8 przedstawiono sekwencję aminokwasową (SEKW. NR ID.: 12) i odpowiadającą sekwencję nukleotydową (SEKW. NR ID.: 11) regionu VJ łańcucha lekkiego (kappa) ludzkiego przeciwciała monoklonalnego AB11 z zaprojektowanymi odcinkami CDR. Na fig. 9 przedstawiono sekwencję aminokwasową (SEKW. NR ID.: 14) i odpowiadającą sekwencję nukleotydową (SEKW. NR ID.: 13) regionu VDJ łańcucha ciężkiego ludzkiego przeciwciała monoklonalnego AB12 z zaprojektowanymi odcinkami CDR. Na fig. 10 przedstawiono sekwencję aminokwasową (SEKW. NR ID.: 16) i odpowiadającą sekwencję nukleotydową (SEKW. NR ID.: 15) regionu VJ łańcucha lekkiego (kappa) ludzkiego przeciwciała monoklonalnego AB12 z zaprojektowanymi odcinkami CDR. Na fig. 11 przedstawiono wykres przedstawiający hamowanie wiązania IL-2 z jego receptorem, CD25, przez supernatanty z ludzkimi przeciwciałami monoklonalnymi AB1, AB7, AB11 i AB12, w porównaniu z hamowaniem wiązania IL-2 przez Zenapax (daclizumab, zrekombinowane, humanizowane anty-cd25 przeciwciało IgG1, Roche). Na fig. 12 przedstawiono wykres przedstawiający hamowanie wiązania Zenapax z CD25 przez ludzkie przeciwciała monoklonalne AB1, AB7, AB11 i AB12. Na fig. 13 przedstawiono wykres przedstawiający hamowanie proliferacji komórek T indukowanej przeciwciałem anty-cd3 (przy użyciu PBMC) przez ludzkie przeciwciała monoklonalne AB1, AB7, AB12, w porównaniu z hamowaniem przez przeciwciało kontrolne (hlgg1/κ) i Zenapax. Na fig. 14 przedstawiono wykres przedstawiający hamowanie MLR przez ludzkie przeciwciała monoklonalne AB1, AB7, AB12, w porównaniu z hamowaniem przez przeciwciało kontrolne (hlggl/κ) i Zenapax. Na fig. 15 przedstawiono fotografie z membraną FITC obrazujące internalizację CD25 przez AB12 wyznakowane FITC. Fig. 15A przedstawia wynik dla komórek blastycznych T preinkubowanych z AB12 wyznakowanym FITC po 18 godz. inkubacji w 37C i fig. 15B przedstawia wynik dla komórek blastycznych T hodowanych przez 18 godz. w 37ºC w obecności AB12 wyznakowanego FITC. Dla porównania, fig. 15C przedstawia wynik dla komórek blastycznych T hodowanych przez 18 godz. w 37ºC w obecności izotypowego przeciwciała kontrolnego (anty-khl) wyznakowanego FITC. Na fig. 16 przedstawiono internalizację CD25 przez AB12 wyznakowane FITC mierzone w cytometrze przepływowym, gdzie poziom średniej siły fluorescencji (MFI) powyżej 1 wskazuje, że zaszła internalizacja. Fig. 16A przedstawia wynik dla komórek blastycznych T preinkubowanych z AB12 wyznakowanym FITC AB12, odpowiednio, w 4ºC i 37ºC i fig. 16B przedstawia wynik dla komórek blastycznych T hodowanych w obecności AB12 wyznakowanego FITC, odpowiednio, w 4ºC i 37ºC.

PL 217 296 B1 9 Szczegółowy opis wynalazku Niniejszy wynalazek dostarcza terapii opartych na przeciwciałach do leczenia i diagnozowania różnych zaburzeń chorobowych, w które zaangażowane są komórki wyrażające CD25. Terapie według wynalazku wykorzystują ludzkie przeciwciała monoklonalne, które swoiście wiążą się z epitopem obecnym na CD25. Przeciwciała takie obejmują wszystkie znane izotypy, np. przeciwciała IgA, lgg1-4, IgE, IgM i IgD. W jednym z wykonań przeciwciałem jest IgG1, w szczególności izotypy IgG1, κ lub IgG1, λ. W innym wykonaniu przeciwciałem jest lgg3, w szczególności izotypy lgg3, κ lub lgg3, λ. W jeszcze innym wykonaniu przeciwciałem jest lgg4, w szczególności izotypy lgg4, κ lub lgg4, λ. W kolejnym innym wykonaniu przeciwciałem jest IgA1 lub lga2. W jeszcze dalszym wykonaniu przeciwciałem jest IgM. W jednym z wykonań, ludzkie przeciwciała są wytwarzane w zwierzęciu transgenicznym nie będącym człowiekiem, np. myszy transgenicznej, zdolnej do wytwarzania wielu izotypów ludzkich przeciwciał monoklonalnych przeciw CD25) dzięki rekombinacji V-D-J i zmianie izotypu. Takim zwierzęciem transgenicznym może być także królik wytwarzający przeciwciała poliklonalne, jak ujawniono w patencie USA nr 2003/0 017 534. Zatem, wynalazek także obejmuje ludzkie przeciwciała monoklonalne, które swoiście wiążą się z CD25. Zatem, aspekty według wynalazku obejmują nie tylko przeciwciała, fragmenty przeciwciał i ich kompozycje farmaceutyczne, lecz także zwierzęta transgeniczne nie będące człowiekiem, komórki B, transfektomy komórek gospodarza i hybrydomy, które wytwarzają przeciwciała monoklonalne. Dostarczane są także sposoby użycia przeciwciał według wynalazku do blokowania lub hamowania komórek wytwarzających CD25 i są one przydatne w leczeniu zaburzeń związanych z CD25. Wynalazek obejmuje sposoby użycia przeciwciał według wynalazku do wykrywania komórek wyrażających CD25. W celu łatwiejszego zrozumienia niniejszego wynalazku zdefiniowane zostaną pewne terminy. Dodatkowe definicje przedstawione są w szczegółowym opisie. Terminy CD25" i antygen CD25" są tu używane wymiennie i obejmują dowolne warianty, izoformy i homologi gatunkowe ludzkiego CD25, które są naturalnie wytwarzane przez komórki lub są wytwarzane na komórkach transfekowanych genem CD25. Specjaliści znają synonimy CD25, w tym antygen CD25, p55 i antygen Tac (aktywacji komórek T). Wiązanie przeciwciała według wynalazku z antygenem CD25 hamuje i/lub blokuje wiązanie CD25 z ligandem, IL-2, a tym samym jego funkcje w komórkowe. Przykładowo, w jednym z wykonań, przeciwciała ludzkie według wynalazku hamują proliferację komórek T indukowaną przeciwciałem anty-cd3. W innym wykonaniu, ludzkie przeciwciała monoklonalne hamują MLR. W użytym tu znaczeniu, termin hamuje wzrost" (np. w odniesieniu do komórek) obejmuje jakiekolwiek możliwe do zmierzenia obniżenie wzrostu komórek, kiedy są kontaktowane przeciwciałem anty-cd25 w porównaniu ze wzrostem tych samych komórek bez kontaktu z przeciwciałem anty- CD25, np. hamowanie wzrostu komórek o co najmniej około 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 99% lub 100%. W użytym tu znaczeniu, terminy hamuje wiązanie" i blokuje wiązanie" (np. w odniesieniu do hamowania/blokowania wiązania IL-2 z CD25) są stosowane wymiennie i obejmują zarówno częściowe, jak całkowite hamowanie/blokowanie. Hamowanie/blokowanie wiązania IL-2 z CD25 korzystnie redukuje lub zmienia normalny poziom lub typ przekazywania sygnału komórkowego, który występuje, kiedy IL-2 wiąże się z CD25 bez hamowania lub blokowania. Hamowanie i blokowanie obejmują także jakiekolwiek możliwe do zmierzenia obniżenie powinowactwa wiązania IL-2 z CD25, kiedy jest kontaktowany z przeciwciałem anty-cd25 w porównaniu z ligandem, który nie jest kontaktowany z przeciwciałem anty-cd25, np. blokowanie wiązania IL-2 z CD25 o co najmniej około 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 99% lub 100%. Termin przeciwciało" w użytym tu znaczeniu obejmuje niezmienione przeciwciała i ich dowolny fragment wiążący antygen (tzn. część wiążącą antygen") lub pojedynczy łańcuch. Przeciwciało" odnosi się do glikoproteiny obejmującej co najmniej dwa łańcuchy ciężkie (H) i dwa łańcuchy lekkie (L) połączone wewnętrznie za pomocą mostków dwusiarczkowych lub jej części wiążącej antygen. Każdy łańcuch ciężki składa się z regionu zmiennego łańcucha ciężkiego (w skrócie oznaczonego tu jako V K ) i regionu stałego łańcucha ciężkiego. Każdy łańcuch lekki składa się z regionu zmiennego łańcucha lekkiego (w skrócie oznaczonego tu jako V L ) i regionu stałego łańcucha lekkiego. Regiony V H i V L można dalej podzielić na regiony hiperzmienne, zwane regionami determinującymi dopasowanie (CDR), rozmieszczone pomiędzy regionami bardziej konserwowanymi, zwanymi regionami zrębowymi (FR). Każdy V H i V L składa się z trzech regionów CDR i czterech FR, ułożonych od końca aminowego

10 PL 217 296 B1 do karboksylowego w następującym porządku: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Regiony zmienne łańcuchów ciężkiego i lekkiego zawierają domenę wiążącą, która oddziałuje z antygenem. Regiony stałe przeciwciał mogą pośredniczyć w wiązaniu immunoglobulin do tkanek lub czynników gospodarza, w tym do różnych komórek systemu odpornościowego (np. komórek efektorowych) i pierwszego składnika (Clq) klasycznego układu dopełniacza. Termin część przeciwciała wiążąca antygen" (lub po prostu część przeciwciała") w użytym tu znaczeniu, odnosi się do jednego lub większej liczby fragmentów przeciwciała, które zachowują zdolność swoistego wiązania antygenu (np. CD25). Pokazano, że funkcja przeciwciała wiązania antygenu może być pełniona przez fragmenty niezmienionego przeciwciała lub przeciwciała o pełnej długości. Przykłady fragmentów wiążących objęte terminem część przeciwciała wiążąca antygen" obejmują: (i) fragment Fab, jednowalentny fragment składający się z domen V L, V H, C L i C H1, (ii) fragment F (ab') 2, biwalentny fragment obejmujący dwa fragmenty Fab połączone mostkiem dwusiarczkowym w regionie zawiasowym, (iii) fragment Fd składający się z domen V H i C H1, (iv) fragment Fv składający się z domeny V L i V H, (v) fragment dab (Ward i wsp., (1989) Nature 341: 544-546), składający się z domeny V H, (vi) wyizolowany region determinujący dopasowanie (CDR) i (vii) kombinację dwóch lub większej liczby wyizolowanych regionów CDR, które mogą być ewentualnie połączone syntetycznym łącznikiem. Ponadto, pomimo, że obie domeny fragmentu Fv, V L i V H, są kodowane przez oddzielne geny można je połączyć przy użyciu technik rekombinacji, przez syntetyczny łącznik, który umożliwia utworzenie z nich pojedynczego łańcucha białkowego, w którym pary regionów V L i V H tworzą monowalentne cząsteczki (znane jako pojedynczy łańcuch Fv (scfv), patrz np. Bird i wsp. (1988) Science 242: 423-426, i Huston i wsp. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883). Takie przeciwciała o pojedynczym łańcuchu są także objęte terminem część przeciwciała wiążąca antygen". Dalszym przykładem są immunoglobulinowe fuzje białkowe domeny wiążącej obejmujące (i) polipeptydową domenę wiążącą w fuzji z polipeptydowym regionem zawiasowym immunoglobuliny, (ii) region stały CH2 łańcucha ciężkiego immunoglobuliny w fuzji z regionem zawiasowym oraz (iii) region stały CH3 łańcucha ciężkiego immunoglobuliny w fuzji z regionem stałym CH2. Polipeptydową domeną wiążącą może być region zmienny łańcucha ciężkiego lub region zmienny łańcucha lekkiego. Fuzje białkowe domeny wiążącej są dalej ujawnione w patentach USA nr 2003/0 118 592 i 2003/0 133 939. Te fragmenty przeciwciał są uzyskane przy użyciu klasycznych technik znanych specjalistom i są przebadane pod kątem tego czy ich użyteczność jest taka sama jak niezmienionych przeciwciał. Termin epitop" oznacza determinantę białkową zdolną do swoistego wiązania przeciwciała. Epitopy zazwyczaj składają się z chemicznie aktywnych powierzchniowych zgrupowań cząsteczek, takich jak aminokwasowe lub cukrowe łańcuchy boczne i zazwyczaj charakteryzują się specyficzną strukturą trójwymiarową, jak również specyficznym ładunkiem. Epitopy mogą być konformacyjne i niekonforrnacyjne, rozróżniane ma podstawie tego, że następuje utrata zdolności wiązania z tymi pierwszymi, lecz nie z tymi drugimi, po działaniu rozpuszczalnikami denaturującymi. Termin cząsteczka bispecificzna" obejmuje dowolny czynnik, np. białko, peptyd, lub kompleks białkowy czy peptydowy, który posiada dwie różne swoistości wiązania. Przykładowo, cząsteczka może wiązać się z lub oddziaływać z (a) antygenem powierzchniowym komórki i (b) receptorem dla fragmentu Fe na powierzchni komórki efektorowej. Termin cząsteczka multispecyficzna" lub cząsteczka heterospecyficzna" obejmuje dowolny czynnik, np. białko, peptyd lub kompleks białkowy, czy peptydowy, który posiada dwie różne swoistości wiązania. Przykładowo, cząsteczka może wiązać się z lub oddziaływać z (a) antygenem powierzchniowym komórki i (b) receptorem dla fragmentu Fc na powierzchni komórki efektorowej oraz (c) co najmniej jednym innym składnikiem. Zatem, wynalazek obejmuje, przy czym nie jest do nich ograniczony, bispecyficzne, trój specyficzne, tetraspecyficzne i inne multispecyficzne cząsteczki skierowane przeciw CD25 i innym miejscom docelowym, takim jak receptory dla fragmentu Fc na komórkach receptorowych. Termin przeciwciała bispecyficzne" obejmuje także diciała (ang. diabodies). Diciała są biwalentnymi, bispecyficznymi przeciwciałami, w których domeny V H i V L są wytwarzane na pojedynczym łańcuchu polipeptydowym, lecz przy użyciu takiego łącznika, który jest zbyt krótki, aby mogło następować parowanie pomiędzy dwiema domenami tego samego łańcucha, co forsuje parowanie domen komplementarnych z różnych łańcuchów i powstawanie dwóch miejsc wiążących antygen (patrz, np. Holliger, P. i wsp. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448, Poljak, R. J. i wsp. (1994) Structure 2: 1121-1123).

PL 217 296 B1 11 Termin pochodne ludzkiego przeciwciała" dotyczy dowolnej zmodyfikowanej formy przeciwciała, np. koniugatu przeciwciała i innego czynnika lub przeciwciała. Termin ludzkie przeciwciało" w użytym tu znaczeniu obejmuje przeciwciała posiadające region zmienny i stały z sekwencji ludzkich immunoglobulin linii zarodkowej. Przeciwciała ludzkie według wynalazku mogą także obejmować reszty aminokwasowe nie kodowane przez sekwencje ludzkich immunoglobulin linii zarodkowej (np. mutacje wprowadzone przez losową lub ukierunkowaną mutagenezę in vitro lub mutacje somatyczne in vivo). Chociaż termin ludzkie przeciwciało" w użytym tu znaczeniu nie obejmuje przeciwciał, w których do sekwencji ludzkiego zrębu zostały wszczepione sekwencje CDR pochodzące z linii zarodkowej innych gatunków ssaków, takich jak mysz. Terminy przeciwciało monoklonalne" lub kompozycja przeciwciała monoklonalnego" w użytym tu znaczeniu dotyczy preparatu cząsteczek przeciwciał o jednej kompozycji molekularnej. Kompozycja przeciwciała monoklonalnego wykazuje pojedynczą specyficzność wiązania i powinowactwo do określonego epitopu. Zatem, termin ludzkie przeciwciało monoklonalne" dotyczy przeciwciał wykazujących pojedynczą specyficzność wiązania, które posiadają region zmienny i stały pochodzący z sekwencji ludzkich immunoglobulin linii zarodkowej. W jednym z wykonań, ludzkie przeciwciała monoklonalne są wytwarzane przez hybrydomę, która obejmuje komórkę B uzyskaną z transgenicznego lub transchromosomalnego zwierzęcia nie będącego człowiekiem, np. transgenicznej myszy, posiadającego genom obejmujący transgen ludzkiego łańcucha ciężkiego i transgen łańcucha lekkiego w fuzji z unieśmiertelnioną komórką. Termin zrekombinowne przeciwciało ludzkie", w użytym tu znaczeniu, obejmuje wszystkie ludzkie przeciwciała, które są przygotowane, wytworzone, stworzone lub wyizolowane technikami rekombinacji, takie jak (a) przeciwciała wyizolowane ze zwierzęcia (np. myszy), które jest transgeniczne lub transchromosomalne pod względem ludzkich genów immunoglobulinowych lub z utworzonej z nich hybrydomy (opisane dalej w sekcji I, poniżej), (b) przeciwciała wyizolowane z komórki gospodarza stransformowanej w celu wytwarzania przeciwciała, np. z transfektomy, (c) przeciwciała wyizolowane ze zrekombinowanej, kombinatorycznej biblioteki ludzkich przeciwciał oraz (d) przeciwciała przygotowane, wytworzone, stworzone lub wyizolowane dowolnymi sposobami z udziałem składania sekwencji genów ludzkich immunoglobulin z innymi sekwencjami DNA. Takie zrekombinowane przeciwciała ludzkie posiadają region zmienny i stały pochodzący z sekwencji ludzkich immunoglobulin linii zarodkowej. Jednakże w pewnych wykonaniach, takie zrekombinowane ludzkie przeciwciała można poddać mutagenezie in vitro (lub kiedy stosowane jest zwierzę transgeniczne dla sekwencji ludzkich Ig, mutagenezie somatycznej in vivo) i w związku z czym sekwencje aminokwasowe regionów V H i V L zrekombinowanych przeciwciał są sekwencjami, które pomimo, że pochodzą od i są pokrewne sekwencjom V L i V H ludzkiej linii zarodkowej, mogą nie występować naturalnie wśród zestawu ludzkich immunoglobulin linii zarodkowej in vivo. Termin transfektoma" w użytym tu znaczeniu obejmuje zrekombinowane komórki eukariotycznego gospodarza wytwarzające przeciwciało, takie jak komórki CHO, komórki NS/0, komórki HEK293, komórki roślinne lub grzybowe, w tym komórki drożdży. W użytym tu znaczeniu przeciwciało heterologiczne" jest określone w odniesieniu do nie będącego człowiekiem organizmu transgenicznego wytwarzającego takie przeciwciało. Termin ten dotyczy przeciwciała posiadającego sekwencję aminokwasową lub kodowanego przez odpowiadającą sekwencję nukleotydową znalezioną w organizmie, który nie jest transgenicznym zwierzęciem nie będącym człowiekiem i zazwyczaj pochodzącą z gatunku innego niż transgeniczne zwierzę nie będące człowiekiem. Wyizolowane przeciwciało" w użytym tu znaczeniu odnosi się do przeciwciała, które jest zasadniczo wolne od innych przeciwciał posiadających odmienne antygenowe swoistości (np. wyizolowane przeciwciało, które swoiście wiąże CD25 jest zasadniczo wolne od przeciwciał, które swoiście wiążą antygeny inne niż CD25). Wyizolowane przeciwciało, które swoiście wiąże epitop, izoformę lub wariant ludzkiego CD25 może, jednakże, reagować krzyżowo z innymi pokrewnymi antygenami, np. z innych gatunków (np. homologami gatunkowymi CD25). Ponadto, wyizolowane przeciwciało może być zasadniczo wolne od innego materiału komórkowego i/lub związków chemicznych. W jednym z wykonań według wynalazku, kombinacja wyizolowanych" przeciwciał monoklonalnych posiadających różne swoistości jest połączona w dobrze zdefiniowaną kompozycję. W użytym tu znaczeniu wiązanie swoiste" dotyczy wiązania przeciwciała do określonego antygenu. Zazwyczaj, przeciwciało wiąże się z powinowactwem odpowiadającym K D o około 10-8 M lub mniej, jak około 10-9 M, lub mniej, około 10-10 M, lub mniej lub około 10-11 M, lub jeszcze mniej, kiedy

12 PL 217 296 B1 jest określana za pomocą rezonansu plazmonów powierzchniowych (SPR) w urządzeniu BIAcore 3000 przy użyciu zrekombinowanego IL-2Ra jako liganda i przeciwciała jako składnika oznaczanego i wiąże się z określonym antygenem z powinowactwem odpowiadającym K D, która jest co najmniej 10 razy niższa, korzystnie co najmniej 100 razy niższa, niż jej powinowactwo wiązania z niespecyficznym antygenem (np. BSA, kazeina) innym niż określony antygen lub blisko spokrewniony antygen. Zwroty przeciwciało rozpoznające antygen" i przeciwciało swoiste wobec antygenu" są stosowane tu zamiennie z terminem przeciwciało, które wiąże swoiście antygen". Termin k d " (sec -1 ) w użytym tu znaczeniu odnosi się do stałej szybkości równowagi reakcji dysocjacji dla określonej reakcji przeciwciało-antygen. Omawiana wartość jest także określana jako wartość k off. Termin k a " (M -1 x sec -1 ) w użytym tu znaczeniu odnosi się do stałej szybkości równowagi reakcji asocjacji dla określonej reakcji przeciwciało-antygen. Termin K D " (M) w użytym tu znaczeniu stałej odnosi się do stałej równowagi reakcji dysocjacji dla określonej reakcji przeciwciało-antygen. Termin K A " (M -1 ) w użytym tu znaczeniu odnosi się do stałej równowagi reakcji asocjacji dla określonej reakcji przeciwciało-antygen i jest uzyskiwana przez podzielenie k a przez k d. W użytym tu znaczeniu, izotyp" odnosi się do klasy przeciwciała (np. IgM lub IgG1), która jest kodowana przez geny regionu stałego łańcucha ciężkiego. W użytym tu znaczeniu zmiana izotypu" odnosi się do zjawiska, dzięki któremu klasa lub izotyp przeciwciała zmienia się z jednej klasy Ig w inne klasy Ig. W użytym tu znaczeniu nie zmieniony izotyp" odnosi się do klasy izotypowej łańcucha ciężkiego, która jest wytwarzana, kiedy nie zachodzi zmiana izotypu, gen CH kodujący nie zmieniony izotyp jest zazwyczaj pierwszym genem CH bezpośrednio poniżej funkcjonalnie przereanżowanego genu VDJ. Zmiana izotypu może być klasyczną i nie klasyczną zmianą izotypu. Klasyczna zmiana izotypu pojawia się dzięki zdarzeniom rekombinacji, które wymagają co najmniej jednego regionu sekwencji przełącznikowej biorącego udział w przestawieniu w transgenie. Nie klasyczna zmiana izotypu może, przykładowo, pojawić się dzięki rekombinacji homologicznej pomiędzy ludzką σ μ i ludzką ε μ (delecja związana z δ). Alternatywnie, mogą wystąpić mechanizmy nie klasycznej zmiany, takie jak, między innymi, rekombinacja intertransgenowa i/lub interchromosomowa i spowodować zmianę izotypu. W użytym tu znaczeniu termin sekwencja biorąca udział w zmianie" dotyczy sekwencji DNA odpowiedzialnych za rekombinację dających zmianę. Sekwencją donorową zmiany", zazwyczaj region zmiany μ, będzie sekwencja 5' (tzn. powyżej) regionu konstruktu, który ma ulec delecji podczas rekombinacji. Region akceptorowy zmiany" będzie pomiędzy regionem konstruktu, który ma ulec delecji i regionem stałym do wymiany (np. γ, ε, etc.). W użytym tu znaczeniu wzór glikozylacji" określony jest jako wzór jednostek węglowodanowych, które są kowalencyjnie połączone z białkiem, bardziej konkretnie białkiem immunoglobuliny (przeciwciała). Wzór glikozylacji przeciwciała heterologicznego można scharakteryzować jako zasadniczo podobny do wzorów glikozylacji, które występują naturalnie na przeciwciałach wytwarzanych przez gatunek zwierzęcia transgenicznego nie będącego człowiekiem, gdzie specjalista w dziedzinie zauważy, że wzór glikozylacji przeciwciała heterologicznego przypomina bardziej wzór glikozylacji dla gatunku zwierzęcia transgenicznego nie będącego człowiekiem niż dla gatunku, z którego pochodzą geny CH transgenu. Termin występujący naturalnie" w użytym tu znaczeniu zastosowanym wobec przedmiotu odnosi się do faktu, że przedmiot można znaleźć w przyrodzie. Przykładowo, naturalnie występującą jest sekwencja polipeptydowa lub polinukleotydowa obecna w organizmie (także w wirusach), którą można wyizolować z naturalnego źródła i która nie została w sposób zamierzony zmodyfikowana przez człowieka w laboratorium. Termin przerearanżowany" w użytym tu znaczeniu odnosi się do konfiguracji locus łańcucha ciężkiego i łańcucha lekkiego immunoglobuliny, w którym segment V leży w miejscu bezpośrednio przylegającym do segmentu D-J lub J w konformacji kodującej, odpowiednio, zasadniczo całą domenę V H lub V L. Przerearanżowany locus genu immunoglobuliny (przeciwciała) będzie zidentyfikowany przez porównanie z DNA linii pierwotnej, przerearanżowany locus będzie posiadał co najmniej jeden zrekombinowany heptamerowy/nonamerowy element homologiczny. Termin nieprzerearanżowany" lub konfiguracja linii pierwotnej" w użytym tu znaczeniu w odniesieniu do segmentu V określa konfigurację, w której segment V nie uległ rekombinacji tak, aby bezpośrednio przylegać do segmentu D lub J.