UWARUNKOWANIA OBRONY ANTYOKSYDACYJNEJ U TROCI WĘDROWNEJ (SALMO TRUTTA TRUTTA) Z DORZECZA SŁUPI

S ł u p s k i e P r a c e B i o l o g i c z n e 6 2009 UWARUNKOWANIA OBRONY ANTYOKSYDACYJNEJ U TROCI WĘDROWNEJ (SALMO TRUTTA TRUTTA) Z DORZECZA SŁUPI DETERMINATIONS OF ANTIOXIDATIVE DEFENCE SYSTEM IN MIGRATORY BROWN TROUT (SALMO TRUTTA TRUTTA) FROM BASIN OF SŁUPIA RIVER Natalia Kurhalyuk 1, Magdalena Szornak 1, Katarzyna Pałczyńska 1, Halyna Tkachenko 2, Marcin Miller 3 1 Akademia Pomorska Zakład Fizjologii Zwierząt Instytut Biologii i Ochrony Środowiska ul. Arciszewskiego 22b, 76-200 Słupsk e-mail: kurhayluk@apsl.edu.pl 2 Lwowski Uniwersytet Medyczny im. Danyla Halickiego Zakład Higieny i Toksykologii ul. Pekarska 69, Lwów, Ukraina 3 Regionalna Dyrekcja Ochrony Środowiska ul. Chmielna 54/57, 80-748 Gdańsk ABSTRACT The aim of study was to analyze ecophysiological relationships between antioxidation balance parameters in the muscles from 80 juvenile migratory brown trout (Salmo trutta trutta) in the basin of river Słupia (central Pomerania, Northern Poland) and surrounding rivers (Skotawa, Glaźna, Kwacza, Kamienna). Fish-catching took place in exact co-operation from Landscape Park The valley of Słupia as well as the Board of Polish Angling Relationship in Słupsk. The high and positive correlations between glutathione reductase activity and lipid peroxidation in muscles of migratory brown trout from river Glaźna have been calculated. It suggests about activation of oxidative stress and increase of glutathione antioxidative system participation for inactivation of free radicals produced from anthropogenic sources in water. The high negative correlations between glutathione reductase activity and malonic dialdehyde level in muscles of migratory brown trout from river Kwacza were established. These data confirms considerable part of glutathione (especially GR) system in lowering the negative results of oxida- 97

tive stress. The negative correlation among glutathione peroxidase and superoxide dysmutase activity of brown trout from river Kamienna, and positive correlation among glutathione peroxidase and catalase of brown trout from river Skotawa was studied. Our results can testify about differentiation of oxidative stress intensification in individuals of migratory brown trout and their dependence on the type of river and occurrence of anthropogenic sources in water. Słowa kluczowe: troć wędrowna, Salmo trutta trutta, Słupia, intensywność procesów lipoperoksydacji, oksydacyjna modyfikacja białek, środowisko Key words: brown trout, Salmo trutta trutta, river Słupia, intensity of lipid peroxidation, oxidative modification of proteins, environment WPROWADZENIE Zaburzenia homeostazy prowadzące do zwiększenia stacjonarnych stęŝeń reaktywnych form tlenu RFT zostały określone jako,,stres oksydacyjny (Bartosz 2006). Jest to więc naruszenie równowagi pomiędzy pro- i antyoksydacyjnymi procesami w organizmie. Brak tej równowagi moŝe być wynikiem albo wzrostu reakcji katalizowanych przez RFT, albo spadku aktywności lub stęŝeń antyoksydantów. Stres oksydacyjny występuje w wielu sytuacjach, zazwyczaj spowodowanych ekspozycją komórek, tkanek czy organizmów na dodatkowe źródła RFT bądź zwiększeniem tempa endogennej produkcji RFT (Videla 2000). Z badań wielu autorów (Dawson i Bortolotti 1997a, b, c, Gómez i in. 2004, Kamiński i in. 2006a, b) wynika, Ŝe w środowiskach zanieczyszczonych metale toksyczne i organiczne pollutanty są, wskutek wzmoŝonej antropopresji, modulatorami aktywności najwaŝniejszych enzymów antyoksydacyjnych (dysmutazy ponadtlenkowej SOD, katalazy CAT, glutationperoksydazy GPx, glutationreduktazy GR). Jak podają Kamiński i in. (2006a), zmiany adaptacyjne w odpowiedzi na stres oksydacyjny odzwierciedlają ekofizjologiczne prawidłowości, zarówno na poziomie komórkowym, jak i w reakcjach populacyjnych. Do metabolicznych skutków stresu oksydacyjnego spowodowanego oddziaływaniem metali cięŝkich w środowisku zanieczyszczonym naleŝą przede wszystkim uszkodzenia wszystkich klas molekularnych składników komórek, a takŝe procesy peroksydacji lipidów, oksydacyjne uszkodzenia białek i DNA (Kurhalyuk i in. 2007). Ryby zaliczane są do bioindykatorów, poniewaŝ wykazują zróŝnicowaną wraŝliwość i charakterystyczną reakcję na działanie czynników środowiska. Pozwalają one ustalić stan czystości wód, a takŝe umoŝliwiają określenie stopnia oraz zasięgu i struktury zmian degradacyjnych środowiska. Dane z literatury świadczą, Ŝe w odpowiedzi na zmiany antropogeniczne zwierzęta wykazują często bardzo wyraźny stres, co wskazuje na osiągnięcie przez nie granic ich moŝliwości adaptacyjnych (Kaleta 2007). Znaczenie antyoksydacyjnego systemu obrony w odpowiedzi na stres powodo- 98

wany zanieczyszczeniem środowiska pozostaje bardzo waŝnym motywem dalszych poszukiwań moŝliwości adaptacyjnych organizmów. Celem naszej pracy była korelacyjna ocena ekofizjologicznych reakcji między wybranymi parametrami bilansu antyoksydacyjnego w tkance mięśniowej młodocianych osobników troci wędrownej (Salmo trutta trutta) w dorzeczu Słupi i jej zlewni (rzeki: Skotawa, Glaźna, Kwacza, Kamienna). TEREN, MATERIAŁ I METODY BADAŃ Materiał do badań pobrano od 80 młodocianych osobników troci wędrownej (Salmo trutta trutta) zasiedlających dopływy Słupi (Pomorze Środkowe, Polska północna). W skład dopływów stanowiących teren badań wchodzą cztery rzeki: Glaźna, Kwacza, Kamienna i Skotawa. Rzeki Glaźna (ryc. 1) i Skotawa (ryc. 4) naleŝą do prawobrzeŝnych dopływów Słupi, natomiast Kwacza (ryc. 2) i Kamienna (ryc. 3) do lewobrzeŝnych. Skotawa ma swój początek w małym jeziorku koło osady Soszyca, a do Słupi wpływa na jej 75 km. Glaźna przepływa przez wieś Krępa Słupska i wpada do Słupi przy zachodniej granicy tej wsi, powyŝej Słupska. Kwacza przepływa przez wieś Kwakowo, jej źródła znajdują się w miejscowości Sycewice, a ujście do Słupi następuje na 83 km. Źródła Kamiennej leŝą koło wsi Podwilczyn, a do Słupi uchodzi naprzeciwko Skotawy (Dębowski i in. 2000). Połowy ryb odbyły się w 2007 roku; pozyskano po 20 osobników z kaŝdej z wymienionych rzek, w ścisłej współpracy z dyrekcją Parku Krajobrazowego Dolina Słupi i Zarządem Okręgu Polskiego Związku Wędkarskiego w Słupsku. Do połowu ryb uŝyto agregatu prądotwórczego z przystawką na prąd stały. Materiał badawczy został przetransportowany do laboratorium Zakładu Fizjologii Zwierząt Instytutu Biologii i Ochrony Środowiska Akademii Pomorskiej w Słupsku. Uzyskana tkanka mięśniowa (1:10) została zhomogenizowania w schłodzonym buforze (2-4 C), zawierającym 0,1M Tris-HCl (ph 7,2). Przygotowany homogenat (13 tys. obr./min, 45 s) stanowił właściwy materiał badawczy, poddawany dalszym analizom. Intensywność procesów stresu oksydacyjnego wyznaczono poprzez pomiar poziomu malonodialdehydu (MDA), który jest ostatecznym produktem zmian lipidowych wywołanych stresem oksydacyjnym. Barwny produkt tej reakcji oznaczono przez pomiar aktywności substancji reaktywnych kwasu 2-tiobarbiturowego (TBARS) w tkance mięśniowej według metody Kamyshnikova (2004). Metoda ta polega na oznaczeniu barwnych produktów kompleksu trimetynowego z kwasem 2-tiobarbiturowym, którego intensywność odczytano przy długości fali λ = 532 nm. Aktywność glutationreduktazy zbadano według metody Prohorovej (1982). Zasada tej metody polega na tym, Ŝe glutationreduktaza katalizuje redukcję utlenionego glutationu, wykorzystując jako ekwiwalent NADPH 2. Zmniejszenie stęŝenia NADPH 2 w badanej próbie oznaczono na spektrofotometrze przy długości fali λ = 340 nm. Aktywność glutationperoksydazy (GPx) oznaczono według Moina (1986). Za miarę aktywności GPx przyjmuje się stopień utleniania glutationu pod wpływem tretbutylhydroperoxydu. StęŜenie zredukowanego glutationu przed i po inkubacji 99

Ryc. 1. Rzeka Glaźna (prawobrzeŝny dopływ rzeki Słupia, płn. Polska) Fig. 1. River Glaźna (the right-bank tributary of river Słupia, N Poland) Ryc. 2. Rzeka Kwacza (lewobrzeŝny dopływ rzeki Słupia, płn. Polska) Fig. 2. River Kwacza (the left-bank tributary of river Słupia, N Poland) 100

Ryc. 3. Rzeka Kamienna (lewobrzeŝny dopływ rzeki Słupia, płn. Polska) Fig. 3. River Kamienna (the left-bank tributary of river Słupia, N Poland) Ryc. 4. Rzeka Skotawa (prawobrzeŝny dopływ rzeki Słupia, płn. Polska) Fig. 4. River Skotawa (the right-bank tributary of river Słupia, N Poland) 101

oznaczono spektrofotometrycznie przy długości fali λ = 412 nm. Aktywność dysmutazy ponadtlenkowej (SOD) oznaczono metodą Kostyuk (Kostyuk i in. 1990). Metoda ta opiera się na zdolności utleniania kwercetyny w płynach biologicznych, zawierających SOD. Oznaczenie enzymu przeprowadzono na spektrofotometrze przy długości fali λ = 406 nm. Aktywność katalazy oznaczono według Korolyuka (Korolyuk i in. 1988). Zasadą tej metody jest zdolność do tworzenia nadtlenku wodoru H 2 O 2 z solami molibdenianu trwale zabarwionych kompleksów przy długości fali λ = 410 nm. Badane parametry przeliczano na białko, stosując metodę Bradforda (Bradford 1976). Otrzymane wyniki badań poddano analizie statystycznej (Zar 1999) przy pomocy pakietu STATISTICA (firmy StatSoft Polska, v. 8.0). Dla wszystkich badanych zmiennych sprawdzano typ rozkładu (rozkład chi-kwadrat). Związki pomiędzy poszczególnymi parametrami zbadano, stosując test korelacyjny Pearsona i wyliczając odpowiednie współczynniki korelacji (r) oraz regresję prostą. Oceniając siłę związku, przyjęto za Staniszem (2000) następującą skalę: r = 0 zmienne nie są skorelowane; 0 < r < 0.1 korelacja nikła; 0.1 r < 0.3 korelacja słaba; 0.3 r < 0.5 korelacja przeciętna; 0.5 r < 0.7 korelacja wysoka; 0.7 r < 0.9 korelacja bardzo wysoka; 0.9 r < 1.0 korelacja prawie pełna. WYNIKI I DYSKUSJA Troć wędrowna (Salmo trutta trutta) jest najpowszechniej występującym gatunkiem ryb łososiowatych w dorzeczu Słupi, który rozwija się zarówno w środowisku słono-, jak i słodkowodnym. Stanowi doskonały i ewidentny wskaźnik czystości wód, przy czym negatywne zmiany stanu środowiska mają ogromny wpływ na prze- Ŝywalność i liczebność populacji tego gatunku (Łukjanienko 1974). W naszych badaniach do oceny związku między poszczególnymi parametrami bilansu antyoksydacyjnego wykorzystano test korelacyjny, wyliczono odpowiednie współczynniki korelacji i regresję prostą, które są przedstawione na rycinach 5-7. Stosunkowo wysoka dodatnia korelacja (r = 0,55, p < 0,05) pomiędzy aktywnością glutationreduktazy (GR) i intensywnością procesów lipoperoksydacji w tkankach troci wędrownej z rzeki Glaźna dowodzi moŝliwości występowania objawów stresu oksydacyjnego i natęŝenia funkcjonowania systemu glutationu dla inaktywacji produkcji wolnych rodników pod wpływem źródeł antropogenicznych w wodzie (ryc. 5A, B). Potwierdzają to równieŝ wyniki przeciętnej korelacji dla enzymów antyoksydacyjnych systemu glutationu, tj. GR i GPx, w omówionych wyŝej warunkach (rzeka Glaźna, r = 0,43, p < 0,05). Wiadomo, Ŝe u organizmów wodnych (m.in. u ryb) parametry fizjologiczne pozostają w prostej zaleŝności od czynników wewnętrznych i zewnętrznych oraz biotycznych i abiotycznych, działających na organizm. Są wyrazem wielu funkcji organizmu ryb, który rozwija się w prawidłowych warunkach środowiskowych, lub jest odpowiedzią adaptacyjną bądź obronną, będącą reakcją na czynniki, m.in. chemiczne i infekcyjne, zanieczyszczające środowisko wodne. Reakcje ryb na niezadowalający stan czystości środowiska (m.in. działanie substancji chemicznych, metali 102

Ryc. 5. Korelacyjna analiza parametrów intensywności procesów lipoperoksydacji (zawartość MDA) i aktywności glutationreduktazy (GR) (y = -15,44 + 6,8751 x; r = 0,545; p < 0,05; ryc. A) oraz aktywności glutationperoksydazy (GPx) i aktywności glutationreduktazy (GR) (y = -2,779 + 0,11376 x; r = 0,434; p < 0,05; ryc. B) w tkance mięśniowej troci wędrownej z rzeki Glaźna (płn. Polska) Fig. 5. Correlative analysis of lipid peroxidation products (MDA content) and glutathione reductase (GR) activity (y = -15.44 + 6.8751x; r = 0.545; p < 0.05; fig. A), glutathione peroxidase (GPx) and glutathione reductase (GR) activities (y = -2.779 + 0.11376 x; r = 0.434; p < 0.05; fig. B) in muscular tissue of migratory brown trout (Salmo trutta trutta) from river Glaźna (N Poland) 103

104 Ryc. 6. Korelacyjna analiza parametrów intensywności procesów lipoperoksydacji (zawartość MDA) i aktywności glutationreduktazy (GR) (y = 65,562 7,554 x; r = -0,5121; p < 0,05; ryc. A) w tkance mięśniowej troci wędrownej z rzeki Kwaczej oraz aktywności glutationperoksydazy (GPx) i dysmutazy ponadtlenkowej (SOD) (y = 323,90 0,4998 x; r = -0,4026; p < 0,05; ryc. B) w tkance mięśniowej troci wędrownej z rzeki Kamiennej (płn. Polska) Fig. 6. Correlative analysis of lipid peroxidation products (MDA content) and glutathione reductase (GR) activity (y = 65.562 7.554 x; r = -0.5121; p < 0.05; fig. A) in muscular tissue of migratory brown trout (Salmo trutta trutta) from river Kwacza and glutathione peroxidase (GPx) and superoxide dysmutase activity (SOD) (y = 323.90 0.4998 x; r = -0.4026; p < 0.05; fig. B) in muscular tissue of migratory brown trout (Salmo trutta trutta) from river Kamienna (N Poland)

Ryc. 7. Korelacyjne zaleŝności pomiędzy aktywnością katalazy (CAT) i aktywnością glutationperoksydazy (GPx) (y = 0,53157 + 0,00410 x; r = 0,463; p < 0,05) w tkance mięśniowej troci wędrownej z rzeki Skotawa Fig. 7. Correlative analysis between catalase (CAT) and glutathione peroxidase (GPx) activities (y = 0.53157 + 0.00410 x; r = 0.463; p < 0.05) in muscular tissue of migratory brown trout (Salmo trutta trutta) from river Skotawa cięŝkich) przejawia się przede wszystkim rozwojem odpowiedzi ekofizjologicznej (stresowej), a w efekcie najczęściej zmianami funkcjonowania narządów i tkanek, a takŝe niewydolnością mechanizmów wszelkich układów wewnętrznych (Stosik i Deptuła 2001). Istnienie wyraźnych róŝnic funkcjonowania systemu obrony antyoksydacyjnej w tkankach troci wędrownej z rzeki Kwaczej (w porównaniu z wynikami badań ryb z rzeki Glaźna) wykazuje korelacyjna analiza przedstawiona na ryc. 6A. Wynika z niej wysoka ujemna korelacja pomiędzy aktywnością GR i poziomem MDA w tkankach ryb z Kwaczej (r = - 0,51, p < 0,05). Te dane potwierdzają znaczną rolę systemu glutationu (GR) w obniŝeniu negatywnych skutków oksydacyjnego stresu w organizmach młodych ryb. Metodą korelacji stwierdzono przeciętną ujemną korelację pomiędzy GPx i SOD (r = -0,40, p < 0,05) w tkankach ryb z rzeki Kamiennej (rycinie 6B) i dodatnią, teŝ przeciętną korelację pomiędzy GPx i katalazą (CAT) (r = 0,46, p < 0,05) w tkankach troci ze Skotawy (ryc. 7). Uzyskane korelacyjne róŝnice mogą świadczyć o róŝnym stopniu nasilenia objawów stresu oksydacyjnego u osobników troci wędrownej, zaleŝne od typu rzeki i występowania źródeł antropogenicznych w wodzie, intensyfikujących procesy lipoperoksydacji i eliminację wolnych rodników w tkankach tego gatunku ryb. W badaniach przeprowadzonych przez Gabryelak (1996) stwierdzono wpływ metali cięŝkich i wybranych czynników środowiska na aktywność enzymów antyok- 105

sydacyjnych u leszczy i karpi. Kurhayluk, Hetmański i in. (2007) wykazali natomiast w swoich badaniach na gołębiach, Ŝe metale cięŝkie mają właściwości zwiększające natęŝenie stresu oksydacyjnego organizmów oraz Ŝe enzymy antyoksydacyjne to odpowiednie wskaźniki efektów oddziaływań metali. Zresorbowane metale cięŝkie i inne pollutanty kumulują się w glebie, wodzie gruntowej, a następnie trafiają do organizmów roślinnych, zwierzęcych i poprzez łańcuch pokarmowy do organizmu człowieka (Arabi i Alaeddini 2005). W zaleŝności od stęŝenia w organizmie mają znaczny wpływ na zakłócenie homeostazy, co daje moŝliwość wzrostu liczby wolnych rodników i innych reaktywnych form tlenu (ROS) (Britton i in. 2002). Wynikiem oddziaływania metali cięŝkich i pollutantów na materiał genetyczny są mutacje, które prowadzą do zaburzeń funkcjonowania organizmu, zakłócając równieŝ określone funkcje i procesy oraz wprowadzając komórkę w stan apoptozy (Stohs i Bagchi 1995). PODSUMOWANIE I WNIOSKI Odpowiednie współczynniki korelacji, przedstawiające ocenę związku pomiędzy poszczególnymi parametrami bilansu antyoksydacyjnego, wykazały stosunkowo wysoką, dodatnią korelację pomiędzy aktywnością glutationreduktazy (GR) i intensywnością procesów lipoperoksydacji (MDA) w tkankach troci wędrownej z rzeki Glaźna oraz przeciętną korelację dla enzymów antyoksydacyjnych systemu glutationu GR i GPx. Wskazuje to na moŝliwość występowania objawów stresu oksydacyjnego i natęŝenie funkcjonowania systemu glutationu dla inaktywacji produkcji wolnych rodników pod wpływem źródeł antropogenicznych w wodzie. Stwierdzono równieŝ wysoką ujemną korelację pomiędzy aktywnością GR i poziomem MDA w tkankach ryb z Kwaczej. Te dane potwierdzają znaczną rolę systemu glutationu w obniŝaniu negatywnych skutków stresu oksydacyjnego w organizmach młodych ryb. Wykazano takŝe przeciętną ujemną korelację pomiędzy glutationperoksydazą i dysmutazą ponadtlenkową w tkankach ryb z Kamiennej i dodatnią przeciętną korelację pomiędzy GPx i CAT w tkankach ryb ze Skotawy. Opisane korelacyjne róŝnice mogą świadczyć o róŝnym stopniu nasilania objawów stresu oksydacyjnego u zbadanych osobników troci wędrownej, zaleŝne od typu rzeki i występowania źródeł antropogenicznych w wodzie, które intensyfikują procesy lipoperoksydacji i eliminację wolnych rodników w tkankach ryb. PODZIĘKOWANIA Dziękujemy za wyraŝenie zgody na badania Dyrekcji Parku Krajobrazowego Dolina Słupi i Zarządowi Polskiego Związku Wędkarskiego w Słupsku. Dziękujemy za pomoc w przeprowadzeniu badań Wojewódzkiemu Funduszowi Ochrony Środowiska i Gospodarki Wodnej w Gdańsku, firmie Wodociągi Słupsk Sp. z o.o. i Urzędowi Miejskiemu w Słupsku. 106

LITERATURA Arabi M., Alaeddini M.A. 2005. Metal-ion-mediated oxidative stress in the gill homogenate of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss): antioxidant potential of manganese, selenium and albumin. Biol. Trace Elem. Res., 108: 155-168. Bartosz G. 2006. Druga twarz tlenu. Wyd. Nauk. PWN, Warszawa. Bradford M.M. 1976. Rapid and sensitive method for the quantitation of protein using the principle of protein dye binding. Annal. Biochem., 72: 248-254. Britton R.S., Leicester K.L., Bacon B.R. 2002. Iron toxicity and chelation therapy. Int. J. Hematol., 76: 219-228. Dawson R.D., Bortolotti G.R. 1997a. Are avian hematocrits indicative of condition? American kestrels as a model. J. Wildl. Manage, 61: 1297-1306. Dawson R.D., Bortolotti G.R. 1997b. Total plasma protein level as an indicator of condition in wild American kestrels (Falco sparverius). Can. J. Zool., 75: 680-686. Dawson R.D., Bortolotti G.R. 1997c. Variation in hematocrit and total plasma proteins of nestling American kestrels (Falco sparverius) in the wild. Comp. Biochem. Physiol. Part A, 117: 383-390. Dębowski P., Grochowski A., Miller M., Radtke G. 2000. Ichtiofauna dorzecza Słupi. Roczniki Naukowe PZW, 13: 109-136. Gabryelak T. 1996. Wpływ metali cięŝkich i wybranych czynników środowiska na aktywność enzymów antyoksydacyjnych u ryb. Wyd. Uniwersytetu Łódzkiego, Łódź. Gómez G., Baos R., Gómara B., Jimenez B., Benito V., Montoro R., Hiraldo F., Gonzalez M.J. 2004. Influence of a mine tailing accident near Donana National Park (Spain) on heavy metals and arsenic accumulation in 14 species of waterfowl (1998 to 2000). Arch. Environ. Contam. Toxicol., 47: 521-529. Kaleta T. 2007. Wpływ niektórych antropogenicznych zmian środowiskowych na zachowanie się zwierząt. śycie Weterynaryjne, 5: 375-379. Kamiński P., Kurhalyuk N., Kasprzak M., Szady-Grad M., Jerzak L. 2006a. Element-element interactions in the blood of white stork (Ciconia ciconia) chicks from polluted SW Poland environments. W: The white stork in Poland: studies in biology, ecology and conservation. P. Tryjanowski, T.H. Sparks, L. Jerzak (red.). Bogucki Wyd. Nauk., Poznań: 471- -480. Kamiński P., Kurhalyuk N., Kasprzak M., Szady-Grad M., Jerzak L. 2006b. Dynamics of chemical elements in the blood of white stork Ciconia ciconia chicks from polluted environments in Western Poland. W: The white stork in Poland: studies in biology, ecology and conservation. P. Tryjanowski, T.H. Sparks, L. Jerzak (red.). Bogucki Wyd. Nauk., Poznań: 201-221. Kamyshnikov V.S. 2004. Reference Book on Clinic and Biochemical Researches and Laboratory Diagnostics. MEDpress-uniform, Moscow. Korolyuk M.A., Ivanova L.I., Maiorova I.G., Tokarev V.E. 1988. A method for measuring catalase activity. Lab. Manuals., 1: 16-19. Kostyuk V.A., Popovich A.I., Kovaleva Z.I. 1990. Easy and sensitive method of superoxide dismutase determination based on quercetine oxidation. Vopr. Med. Chem., 4: 88-91. Kurhalyuk N., Tkachenko H., Kamiński P., Pałczyńska K., Szornak M., Mach A. 2007. Parametry antyoksydacyjnego bilansu we krwi młodych osobników bociana białego (Ciconia ciconia) z róŝnych środowisk Polski. Słupskie Prace Biologiczne, 4: 53-61. Kurhalyuk N., Hetmański T., Antonowicz J., Kasprzak M., Kaleniecka A., Tkachenko H., Mielewczyk M. 2007. Ocena antyoksydacyjnego bilansu we krwi gołębi (Columba livia) z róŝnych środowisk północnej Polski. Słupskie Prace Biologiczne, 4: 43-51. 107

Łukjanienko W.I. 1974. Toksykologia ryb. Państwowe Wydawnictwo Rolnicze i Leśne, Warszawa: 5-8. Moin V.M. 1986. A simple specific method for assays of red cell glutathione peroxidase activity. Lab. Manuals, 8: 724-727. Prohorova M.I. 1982. Methods of biochemical issue. Moscow, 181-183. Stanisz A. 2000. Przystępny kurs statystyki z wykorzystaniem programu STATISTICA PL na przykładach z medycyny, t. II. Statsoft Polska sp. z o.o, Kraków. Stohs S.J., Bagchi D. 1995. Oxidative mechanisms in the toxicity of metal ions. Free Radic. Biol. Med., 18: 321-336. Stosik M., Deptuła W. 2001. Immunologia ryb. Wyd. Uniwersytetu Szczecińskiego, Szczecin: 82. Videla L.A. 2000. Energy metabolism, thyroid calorigenesis and oxidative stress: functional and cytotoxic consequences. Redox Rep., 5: 265-275. Zar J.H. 1999. Biostatistical analysis. Prentice Hall, New Jersey. 108