Analiza enzymów proteolitycznych z soków z Ananasa jadalnego (Ananas comosus L.) i Aktinidii chińskiej (Actinidia chinensis) Natalia Pham

Analiza enzymów proteolitycznych z soków z Ananasa jadalnego (Ananas comosus L.) i Aktinidii chińskiej (Actinidia chinensis) Natalia Pham

STRESZCZENIE Badanymi obiektami były soki ze świeżych owoców ananasa jadalnego (Ananas comosus L.) i aktinidii chińskiej (Actinidia chinensis) oraz zawarte w nich enzymy proteolityczne. Na podstawie prędkości trawienia żelatyny wieprzowej, która została potraktowana sokami inkubowanymi w temperaturach od 4 O C do 9 O C, przez 2,5 oraz 5 minut, dokonano analizy aktywności enzymatycznej proteaz zawartych w sokach. Próbę kontrolną stanowiły probówki przechowywane w temperaturze pokojowej. Zbadano wpływ temperatur oraz czas inkubacji na pracę enzymów, aktynidyny z aktinidii chińskiej i bromeliny z ananasa jadalnego oraz porównano temperatury, w jakich zachodzi ich inaktywacja termiczna. Badania wykazały, że aktynidyna zawarta w soku z A. chinensis niepoddanym żadnej obróbce termicznej oraz w inkubowanym w temperaturze 4 O C i 5 O C przez 2,5 minuty wykazuje szybsze tempo trawienia żelatyny niż bromelina w soku z A. comosus. Uzyskane wyniki pokazują, że podczas inkubacji trwającej 2,5 minuty temperatura inaktywacji termicznej enzymów w obu sokach wynosi powyżej 9 O C. W przypadku inkubacji pięciominutowej wykazano, że proteazy z soku ananasa jadalnego charakteryzują się wyższą odpornością na wysokie temperatury niż z soku aktinidii chińskiej. WSTĘP W dzisiejszych czasach postęp w przemyśle farmaceutycznym jest bardzo wysoki. Dostępność leków i suplementów na niemal każde schorzenie jest ogromna, nie zawsze jednak z pożądanym skutkiem. Na rynku istnieje bardzo wiele specyfików sztucznego pochodzenia, które kupowane są bez sprawdzania składu. Sprzedaż suplementów w ostatnich czasach bardzo wzrosła. Jest to skutkiem naszego trybu życia, w którym ceną za sukcesy jest zdrowie. Daje to również złudne poczucie świadomości dbania o własny organizm. Natomiast kluczem do sukcesu są suplementy naturalnego pochodzenia i zdrowe odżywianie, ponieważ to czym się odżywiamy ma ogromne znaczenie dla naszego organizmu. Na przykład, aktinidia chińska, odznacza się, bardzo wysoką zawartością witaminy C, dzięki czemu stosowana jest jako środek przeciwdziałający szkorbutowi. Ponadto w owocu tym obficie występują witaminy B1, B2, prowitaminy A oraz duże ilości soli mineralnych wapnia, fosforu, magnezu, potasu, żelaza, dlatego roślina ta ma bardzo duże znaczenie w dietetyce. Poleca się ją szczególnie dzieciom, ludziom w podeszłym wieku oraz rekonwalescentom po infekcjach, chorym na arteriosklerozę oraz przy obniżonej odporności. [2] W owocach ananasa jadalnego znajdziemy również witaminę C, B1, B2, prowitaminę A, nieco białka i tłuszczu, sole potasu i miedzi oraz dużo błonnika. Owoc ten zaleca się przy upośledzeniach procesu trawienia, w schorzeniach żołądkowojelitowych. Sok z ananasa jadalnego podaje się również w schorzeniach wątroby, nerek, serca i naczyń krwionośnych. Enzymy zawarte w tej roślinie mogą pomóc w zwalczaniu nowotworów piersi, jajników, skóry, płuc, jelita grubego. Potwierdzają to badania biotechnologiczne, w których wykazano, że składniki enzymów pobudzają układ odpornościowy człowieka do niszczenia komórek nowotworowych lub mogą blokować ich namnażanie. [9] Fakty te są potwierdzeniem słuszności prowadzenia badań nad naturalnymi suplementami i preparatami uzupełniającymi codzienną dietę. [1, 2] Rycina 1. Probówka z żelatyną z zaaplikowanym sokiem z aktinidii chińskiej 2

Celem niniejszego doświadczenia była analiza aktywności enzymatycznej proteaz zawartych w sokach ze świeżych owoców Ananas comosus L. i Actinidia chinensis oraz wpływu temperatur na ich aktywność proteolityczną, a także sprawdzenie, w jakich temperaturach zachodzi inaktywacja termiczna enzymów w nich obecnych. Do przeprowadzenia takich badań skłoniły mnie możliwości praktycznego wykorzystania naturalnych preparatów na bazie soków lub ekstraktów z wymienionych roślin w dietetyce, lecznictwie naturalnym oraz przemyśle żywieniowym. MATERIAŁY I METODY Materiałem badawczym były soki z owoców aktinidii chińskiej i ananasa jadalnego. A. chinensis to roślina rosnąca osiągająca przeciętnie 8 m długości na plantacjach. Pędy są rudo owłosione, liście mają ząbkowany brzeg i też są pokryte rudawymi włoskami. Jest to roślina dwupienna. Kwitnie od 3 do 4 lat po założeniu plantacji. Owocostan A. comosus również uzyskuje się z plantacji, ale jest rośliną wieloletnią zielną. Rozmnożony z sadzonek już w drugim roku po zasadzeniu daje owoce złożone na szczycie pędu głównego, który osiąga około 1 m wysokości. Liście pędu głównego są długie, rynienkowate, zebrane w rozetkę. [2] Doświadczenia laboratoryjne przeprowadzono w laboratorium Katedry Biotechnologii i Mikrobiologii na wydziale Biologiczno Rolniczym Uniwersytetu Rzeszowskiego w Rzeszowie. W doświadczeniu wykorzystano osiem owoców aktinidii chińskiej oraz dwa owocostany ananasa jadalnego. Owoce A. chinensis pochodziły od jednego producenta i A. comosus również od jednego. Wszystkie owoce były w podobnym stopniu dojrzałe. Wybrano te gatunki ze względu na ich łatwą dostępność w sklepach ze zdrową żywnością, w opozycji do innych roślin zawierających enzymy proteolityczne. Roztwór, który przygotowano do wyznaczenia prędkości trawienia proteazami, to 1% roztwór żelatyny spożywczej wieprzowej. Został on sporządzony z wykorzystaniem wody destylowanej, poprzez rozpuszczenie 1 gramów żelatyny w niewielkiej ilości wody, po czym dopełniono roztwór do ml objętości. Następnie rozlano roztwór do probówek o stożkowatym, długim dnie, o średnicy 12 mm, w ilości 7 ml do każdej, po czym ustawiono probówki w statywie i pozostawiono je w lodówce na noc, gdzie panowała temperatura 4 O C. Osiem owoców aktinidii chińskiej obrano ze skórki 3 Rycina 2. Probówki z sokami z ananasa jadalnego (po prawej) i z aktinidii chińskiej (po lewej) podczas inkubacji w cieplarce w temperaturze 4 o C i rozdrobniono, po czym wyciśnięto z homogenatu sok. Przeciśnięto go następnie przez cztery warstwy gazy. Z kolei sok z ananasa jadalnego otrzymano z dwóch fragmentów w kształcie klina wyciętych każdy z jednego owocu i obranych ze skórki. Następnie rozdrobniono wycięte części i wyciśnięto z nich sok, który przeciśnięto również przez cztery warstwy gazy. Soki były przygotowywane rano, na kilka godzin przed rozpoczęciem badań. W celu usunięcia fragmentów stałych z soków, w laboratorium poddano je wirowaniu przez 1 min w 5 rpm i temperaturze 18 O C, dzięki czemu uzyskano klarowny supernatant, oczyszczony z elementów komórkowych. Soki rozlewano do probówek o stożkowatym dnie za pomocą pipety automatycznej po 1,5 ml do każdej i szczelnie zakręcano. Pierwsza część pierwszej serii badań polegała na inkubacji probówek z sokami przez czas 2,5 minut w temperaturach 4 O C, 5 O C, 6 O C,

7 O C, 8 O C, 9 O C w cieplarkach. Próbę kontrolną stanowiły próbki przechowywane w temperaturze pokojowej (22 O C). Druga część badań różniła się od pierwszej jedynie czasem inkubacji, który wynosił 5 minut. Druga seria badań polegała na wyznaczeniu temperatury inaktywacji enzymów, na podstawie przybliżonych temperatur inaktywacji otrzymanych w pierwszym etapie badań. Do probówek ze stężałą żelatyną zaaplikowano pipetą automatyczną po 1,5 ml soku wcześniej inkubowanego w odpowiedniej temperaturze i przez odpowiedni czas, po czym szczelnie je zakręcano i na ściance probówki zaznaczano granicę sok żelatyna. Następnie każdą probówkę dokładnie opisano, zaznaczając jaki rodzaj soku zawiera, jak długo sok był inkubowany i w jakiej temperaturze. Trawienie żelatyny proteazami obecnymi w sokach zachodziło w temperaturze 22 O C. Tak przygotowane probówki odstawiono na godzinę, po czym zaznaczono na probówkach kolejny poziom granicy faz. Następnie za pomocą suwmiarki zmierzono różnicę między poziomami. Jeśli stwierdzono brak różnicy odstawiano te probówki na jeszcze jedną godzinę, po czym mierzono różnicę jeszcze raz. W przypadku, gdy nie stwierdzono po tym czasie żadnych zmian uznawano to za denaturację enzymu zawartego w soku. Na podstawie zmierzonych różnic obliczono masę strawionej żelatyny. Do obliczeń przyjęto π 3,14159 oraz wszystkie działania wykonywano w programie Microsoft Excel 7. Całe doświadczenie powtórzono 3 razy. Na podstawie danych z powtórzeń obliczono odchylenie standardowe wyników, które przedstawiono na wykresach formie słupków błędów. Rycina 3. Schemat przeprowadzonego doświadczenia WYNIKI Zaobserwowano wyraźny spadek prędkości trawienia żelatyny wraz ze wzrostem temperatury inkubacji soków z obu owoców. Jak pokazuje Wykres 1, po inkubacji proteaz zawartych w sokach przez 2,5 minuty temperatura inaktywacji termicznej wynosi powyżej 9 O C. Natomiast z Wykresu 2 można odczytać, iż temperatura ta dla enzymów zawartych w soku z ananasa jadalnego mieści się w przedziale 7 O C 8 O C, w przypadku enzymów obecnych w soku z aktinidii chińskiej jest to zakres od 6 O C 7 O C. Należy również zwrócić uwagę na fakt, iż na Wykresie 1 różnice w prędkości trawienia żelatyny w temperaturach od 22 O C do 5 O C jest bardzo niewielka dla obydwu soków. Podobnie na Wykresie 2 prędkość ta w temperaturach 22 O C 4 O C jest podobna dla soku z ananasa jadalnego i aktinidii chińskiej. Warto też zauważyć, że enzymy z soku z A. chinensis przy inkubacji trwającej 2,5 minuty w temperaturach 22 O C 5 O C wykazują nieznacznie wyższą aktywność proteolityczną niż sok z A. comosus. Podczas inkubacji trwającej 5 minut, enzymy te odznaczały się również niewiele wyższą aktywnością niż A. comosus, ale w temperaturach od 22 O C 4 O C. W obydwu inkubacjach aktywność enzymów z aktinidii chińskiej spada gwałtowniej w wyższych temperaturach, natomiast enzymy z ananasa jadalnego wykazują prawie jednostajny spadek. 4

Prędkość trawienia żelatyny [mg/h] Prędkość trawienia żelatyny [mg/h] Prędkość trawienia żelatyny [mg/h] Prędkość trawienia żelatyny [mg/h] 7 6 5 4 3 kontrolna 4 5 6 7 8 9 Temperatura inkubacji [ o C] Ananas jadalny Aktinidia chińska Wykres 1. Prędkość trawienia żelatyny sokami z ananasa jadalnego i aktinidii chińskiej w zależności od temperatury po inkubacji trwającej 2,5 minuty 7 6 5 4 3 kontrolna 4 5 6 7 8 9 Temperatura inkubacji [ o C] Ananas jadalny Aktinidia chińska Wykres 2. Prędkość trawienia żelatyny sokami z ananasa jadalnego i aktinidii chińskiej w zależności od temperatury po inkubacji trwającej 5 minut Wykresy 3 i 4 bardziej szczegółowo pokazują zależność spadku aktywność enzymatycznej od temperatury. Na podstawie wyników pokazanych na Wykresie 2 przeprowadzono drugą serię badań, w której dokładniej wyznaczono przedziały inaktywacji termicznej enzymów. Wykresy te obrazują przybliżoną wartość temperatury inaktywacji termicznej enzymów zawartych w sokach. Jak można odczytać, przy inkubacji trwającej 5 minut dla soku z ananasa jadalnego jest to zakres 76 O C 78 O C. Natomiast dla soku z aktinidii chińskiej jest to przedział 68 O C 7 O C. 3 35 25 15 3 25 15 5 5 7 72 74 76 78 8 Temperatura inkubacji [ o C] 6 62 64 66 68 7 Temperatura inkubacji [ o C Wykres 3. Prędkość trawienia żelatyny sokiem z ananasa jadalnego po inkubacji trwającej 5 minut 5 Wykres 4. Prędkość trawienia żelatyny sokiem z aktinidii chińskiej po inkubacji trwającej 5 minut

DYSKUSJA Temperatura jest ważnym czynnikiem wpływającym na przebieg reakcji enzymatycznych. Jej podwyższenie zwiększa energię kinetyczna cząsteczek. Natomiast wzrost energii kinetycznej cząsteczek powoduje przyspieszenie ich ruchu, a w konsekwencji rośnie częstość ich zderzeń. Dużo częstsze zderzenia, a przy tym z większą energią i większą efektywnością, wpływają na wzrost szybkości przebiegu reakcji enzymatycznej. Natomiast zbyt wysoka temperatura, może odprowadzić to denaturacji enzymu i gwałtownego spowolnienia zachodzącej reakcji. [5] Wyniki przeprowadzonych badań wskazują na obecność w sokach z ananasa jadalnego oraz aktinidii chińskiej enzymów trawiących białka, które powodowały spadek poziomu żelatyny w probówkach. Enzymami tymi są, w soku z A. comosus bromelina owocowa, natomiast w soku z A. chinensis aktynidyna. Oba te enzymy należą do grupy proteaz cysteinowych, które mają zdolność do rozrywania wiązania peptydowego w łańcuchu białkowym za aminokwasem cysteiną. [3, 7] Bromelina owocowa znajduje się w miąższu owocostanu ananasa jadalnego. Jest to enzym o masie cząsteczkowej 23 kda i punkcie izoelektrycznym wynoszącym 4,6. Enzym ten spełnia swoje funkcje w zakresie ph 4, 8,, zaś optymalne ph, w którym wykazuje największą aktywność wynosi 4,5 5,5. Warto wspomnieć, że w łodydze ananasa jadalnego występuje również bromelina łodygowa, która ma wyższy punkt izoelektryczny i ma większą masę, niż bromelina owocowa. Owoc ten zawiera jeszcze inne enzymy, takie jak ananaina, której masa wynosi 23,46 kda i komosaina ważąca 24,5 kda. [3, 8] Aktynidyna pochodząca aktinidii chińskiej to Rycina 4. Soki poddane wirowaniu w porównaniu z nieodwirowanymi. Po lewej sok z aktinidii chińskiej (odwirowany po lewej), po prawej sok z ananasa jadalnego (odwirowany po lewej) enzym, który można znaleźć zarówno w tej odmianie, jak i w aktinidii smakowitej (Actinidia deliciosa) oraz w ich mieszańcach. Jest to proteaza o masie cząsteczkowej równej 3 kda i punkcie izoelektrycznym 3,5-4. Białko to najlepiej swą funkcję spełnia w ph 5-7. W owocu tym, występują dodatkowo inne białka, lecz aktynidyna obecna jest w nim w największej ilości i jest główną proteazą tej rośliny. Najmniejsze stężenie tego enzymu występuje w liściach i nasionach, natomiast największe w owocach. [4, 6, 7] Przedstawione na wykresach wyniki, pokazują, ze tempo trawienia żelatyny spada wraz ze wzrostem temperatury inkubacji soków z owoców. Należy zauważyć, że wpływ mają na to również czasy inkubacji. Przy dłuższej inkubacji, czyli trwającej 5 minut obserwujemy bardziej gwałtowny spadek tej prędkości w porównaniu do inkubacji trwającej 2,5 minuty. Wyjaśnieniem tego jest większy stopień denaturacji enzymów, zawartych w badanych ekstraktach. Zarówno w soku z aktinidii chińskiej jak i z ananasa jadalnego temperatura inaktywacji termicznej podczas inkubacji trwającej 5 minut mieści się w dużo niższych przedziałach niż dla inkubacji trwającej 2,5 minuty. Fakt ten jest empirycznym potwierdzeniem zależności, iż dłuższa inkubacja w wysokiej temperaturze spowoduje denaturację większej liczby cząsteczek białka niż inkubacja krótsza w tej samej temperaturze. Należy również zwrócić uwagę, na to że aktynidyna charakteryzuje się wyższą aktywnością enzymatyczną w optymalnych temperaturach niż bromelina owocowa. Można domniemywać, że wynika to z wyższego optymalnego ph, w jakim aktynidyna wykazuje najwyższą aktywność w porównaniu do 6

bromeliny owocowej. Optymalne ph (około 5) dla enzymu z soku z ananasa jadalnego jest niższe niż ph żelatyny w doświadczeniu (około 7). Głównym wynikiem tego doświadczenia jest temperatura inaktywacji enzymów. Znajomość tych temperatur ma ogromne znaczenie, ponieważ wpływa to na właściwości lecznicze roślin. Jak pokazują wyniki przeprowadzonych badań, nawet krótkotrwałe poddawanie soków wysokiej temperaturze może spowodować całkowitą lub częściową denaturację białka. Szczególnie ma to znaczenie w przypadku soku z ananasa jadalnego, którego enzymy podaje się chorym z zaburzeniami żołądkowo-jelitowymi w postaci świeżego soku, aby proteazy wspomogły procesy trawienne. [2] Jeśli natomiast enzymy te zostaną unieczynnione w procesach przetwarzania ekstraktu i produkcji preparatów leczniczych na bazie ananasa jadalnego, wówczas środki te będą nieskuteczne. Dlatego też tak ważna jest znajomość temperatur inaktywacji enzymów. Z drugiej strony znajomość temperatury w jakiej zachodzi unieczynnienie enzymu może być przydatne w przemyśle żywieniowym. Możliwe byłoby wykorzystanie tej wiedzy do tworzenia nowych produktów lub półproduktów na bazie naturalnych soków. Umożliwiłoby to również przetwarzanie badanych owoców w taki sposób, aby zawarte w nich enzymy proteolityczne straciły swą aktywność, jednocześnie nie wpływając na walory smakowe. Pozwoliłoby to na łączenie składników pokarmowych w formie dotąd niemożliwej. Na przykład, można by wytworzyć koktajle naturalne mleczne w połączeniu z sokiem z ananasa jadalnego lub aktinidii chińskiej, ponieważ na chwilę obecną napoje te stają się gorzkie po dodaniu do nich soków z enzymami. PIŚMIENNICTWO 1. Czikow P., Łaptiew J. (1998) Rośliny lecznicze i bogate w witaminy PWRiL, Warszawa. 2. Lamer Zarawska E. (213) Owoce egzotyczne Astrum, Wrocław. 3. Maurer H. R. (1) Bromelain: biochemistry, pharmacology and medical use Berlin. 4. Miraghaee S. S., Mostafaie A., Kiani S., Kahrizi D. (211) Investigation on Protein Pattern in Kiwifruit (Actinidia deliciosa) Kermanshah. 5. Murray R. K., Granner D. K., Rodwell V. W (8) Ilustrowana biochemia Harpera Wydawnictwo Lekarskie PZWL, Warszawa. 6. Pastorello Elide A., Conti A., Pravettoni V., Farioli A., Rivolta F., Ansaloni R., M. Ispano, Incorvaia C., Giuffrida M. G., Ortolani C. (1998) Identification of actinidin as the major allergenof kiwi fruit Mediolan, Turyn. 7. Podivinsky E. (1991) Molecular Studies on Acfinidin, A Cysteine Protease from Kiwifruit Auckland. 8. Sree Padma Priya S., Jayakumar. K., Vijay Mathai, Chintu. S., Sarath Babu.K. (212) Immobilization and Kinetic Studies of Bromelain: A Plant Cysteine Protease From Pineapple (Ananas comosus) Plant Parts Kulasekaram. 9. Tochi B. N., Wang Z., Xu S., Zhang W. (8) Therapeutic Application of Pineapple Protease (Bromelain) Kilifi. 7