ZJAWISKO APOPTOZY W CHOROBACH ALERGICZNYCH APOPTOSIS IN ALLERGIC DISEASES

Nowiny Lekarskie 2007, 76, 1, 48-54 JOANNA RUTKOWSKA ZJAWISKO APOPTOZY W CHOROBACH ALERGICZNYCH APOPTOSIS IN ALLERGIC DISEASES Katedra Biologii i Ochrony Środowiska Uniwersytet Medyczny im. Karola Marcinkowskiego w Poznaniu Kierownik Katedry: prof. dr hab. n. med. Krzysztof Wiktorowicz Streszczenie Programowana śmierć komórki (apoptoza) jest mechanizmem, dzięki któremu organizm kontroluje ilość i jakość komórek. Może być uruchomiona przez wiele czyników. Apoptoza zachodzi w warunkach fizjologicznych i jej celem jest eliminacja zbędnych komórek. Indukcja apoptozy w komórkach układu immunologicznego jest jednym z podstawowych mechanizmów zakończenia odpowiedzi immunologicznej. W patogenezie alergii istotną rolę odgrywa nadmierna produkcja przeciwciał klasy IgE swoistych wobec alergenu. W regulacji produkcji IgE uczestniczą głównie interleukiny 4 i 13, produkowane przez limfocyty Th2. Większa wrażliwość komórek Th1 na apoptozę przywraca równowagę zaburzoną nasiloną odpowiedzią Th2. U pacjentów niealergicznych odpowiedź na białka alergenów wytłumiona jest przez limfocyty T regulatorowe. Dysproporcja w subpopulacjach limfocytów Th2 i Treg wpływa na brak tolerancji alergenu. SŁOWA KLUCZOWE: apoptoza, choroba alergiczna, limfocyty T. Summary Programmed cell death (apoptosis) can be initiated by various factors. An important mechanism of signal transduction involves a system connected with the activation of caspases, enzymes belonging to the group of cystein proteases. Apoptosis is a physiologic process aimed to eliminate the unnecessary cells. Induction of apoptosis in the immune cells is one of the basic mechanisms switching the immune reaction off. Excessive production of allergen-specific antibodies class IgE plays a key role in the allergy pathogenesis. Synthesis of IgE, in majority, is regulated by the interleukin 4 and 13, produced by Th2 lymphocytes. The balance shifted towards Th2 is also caused by higher sensitivity of Th1 cells to apoptosis. In non-allergic patients a response to the allergen is suppressed by the regulatory T cells. Disproportion between Th2 and Treg lymphocyte subpopulations results in a non-sufficient tolerance to allergen. Properly regulated apoptosis should maintain the balance within the immune system. KEY WORDS: apoptosis, allergy, lymphocytes T. Przeżycie organizmów żywych zależy od prawidłowego i skoordynowanego działania różnych typów komórek. Przejawem tego w początkowych stadiach rozwojowych jest zachowanie odpowiednich komórek w różnych tkankach i dalsze ich różnicowanie, natomiast eliminacja zbędnych [1]. Śmierć komórek może zachodzić na drodze dwóch różnych procesów: nekrozy (martwicy) i apoptozy, określanej jako programowana śmierć komórki (programmed cell death-pcd). Te dwa rodzaje śmierci charakteryzują się cechami, pozwalającymi na ich precyzyjne odróżnienie. Apoptoza jest wynikiem realizacji programu genetycznego, niezależnego od czynnika prawidłowego czy patologicznego, który go zapoczątkował. Jest to proces zasadniczo różniący się od nekrozy, podczas której dochodzi do obrzmienia komórki, przerwania błony i wylania się jej zawartości, co nieuchronnie prowadzi do rozwoju zapalenia. W apoptozie powstałe ciałka i komórki apoptotyczne usuwane są poprzez proces fagocytozy, gdzie biorące w nim udział makrofagi nie produkują prozapalnych cytokin, natomiast wzrasta produkcja cytokin przeciwzapalnych [2]. Śmierć nekrotyczna jest przypadkowa, spowodowana przez duże uszkodzenie i dotyczy zwykle grupy komórek w danej tkance. Apoptoza może być indukowana lub programowana i zachodzić w pojedynczej komórce [3]. W przeciwieństwie do nekrozy, która jest procesem biernym i degeneracyjnym, apoptoza zachodzi w warunkach fizjologicznych [1]. W rozwoju organizmów wielokomórkowych apoptoza pełni szereg funkcji związanych z wybiórczym usuwaniem komórek nieprawidłowych, niefunkcjonalnych, błędnie umiejscowionych, zainfekowanych, uszkodzonych, czyli ogólnie takich, które stanowią zagrożenie dla organizmu. Przykładem tego może być usuwanie z populacji limfocytów linii T i B komórek niewytwarzających funkcjonalnych receptorów lub rozpoznających antygeny własnych tkanek, co mogłoby doprowadzić do reakcji autoimmunologicznych [4]. Mechanizmy apoptozy Największy wpływ na zrozumienie procesu apoptozy miała identyfikacja genów kodujących białka odpowiedzialne za inicjację i przebieg a także uczestniczące w samym procesie śmierci. Wiedza o genetycznych podstawach apoptozy w komórkach ssaków pochodzi w większości z obserwacji nicienia Caenorhabditis elegans. U hermafrodyty C. elegans spośród 1090 komórek somatycznych, które wytwarzane są podczas rozwoju, 131 ulega apoptozie. Śmierć tych komórek zależy

Zjawisko apoptozy w chorobach alergicznych 49 od aktywności co najmniej trzech genów oznaczonych: ced-3, ced-4 i ced-9 [5]. Dwa z nich, ced-3 i ced-4 są niezbędne, aby zaszła apoptoza, podczas gdy trzeci, ced- 9, chroni komórki przed apoptozą indukowaną aktywacją (activation induced cell death- AICD). Co ciekawe, istnieje znaczna homologia pomiędzy tymi genami u obleńców i ssaków, w tym także u człowieka, co wykazano podczas klonowania tych genów [5]. Eksperymenty polegające na transfekcji genów potwierdziły, że ced-3 może wywoływać śmierć w wyniku aktywacji komórek ssaków, podczas gdy ekspresja ludzkiego bcl-2 może zahamować śmierć komórek obleń ców. Wynika z tego, że geny kontrolujące śmierć i przeżycie komórek ssaków funkcjonują w komórkach obleń-ców i odwrotnie, a mechanizm AICD jest regulowany przez wyspecjalizowane cząsteczki [5]. Kaspazy są enzymami zaangażowanymi w wewnątrzkomórkowej kaskadzie reakcji prowadzących do apoptozy [7]. Aktywacja kaspaz jest niemal zawsze związana z nieodwracalnym uruchomieniem programowanej śmierci [6]. Na etapie regulacji (ryc. 2.) mogą jeszcze działać mechanizmy i białka, które zabezpieczają przed uruchomieniem nieodwracalnej fazy wykonawczej i równoważą działanie genów prowadzących do apoptozy. U ssaków białka te tworzą dużą rodzinę, która obejmuje co najmniej 14 składowych. Wszystkie one wykazują wysoki stopień swoistości, co jest istotne w wywoływaniu śmierci apoptotycznej, ponieważ proces ten obejmuje proteolizę poszczególnych grup białek. W wielu przypadkach cięcie białek przez kaspazy powoduje inaktywację białek docelowych. Jednakże kaspazy mogą również aktywować białka odcinając od nich domeny inhibitorowe lub inaktywując podjednostkę, która reguluje aktywność enzymu. Kaspazy są początkowo obecne jako nieaktywne proenzymy prokaspazy. Prokaspazy same też mogą być aktywowane przez proteolizę. Wystawienie prokaspazy na działanie innej aktywnej cząsteczki kaspazy jest sposobem jej aktywacji. Ten proces został nazwany kaskadą kaspaz i aktywuje leżące poniżej w procesie przemian kaspazy efektorowe: 3, 5 i 7. Te 3 kaspazy o krótkich prodomenach uważane są za główny czynnik apoptotycznej śmierci komórki i są w ten proces bardziej zaangażowane niż należące do tej samej rodziny kaspazy o długich prodomenach [5]. Ryc. 1. Programy śmierci komórkowej (PCD) u robaków i człowieka. Sygnały śmierci inicjują tory przemian bezpośrednio hamując akcję genów anty-apoptotycznych (ced-9 u C. elegans i Bcl-2 u człowieka) albo aktywując czynniki, które są zdolne do supresji działania tych białek (tak jak Egl-1 i BAD). Zahamowanie ced-9 lub Bcl-2 prowadzi do wyzwolenia następnego etapu śmierci, a następowa aktywacja ced-4 albo Apaf-1 programuje nieodwracalną fazę wykonawczą ced-3 albo kaspaz (proteazy cysteinowe). Badania Horovitza i wsp. [5] nad C. elegans doprowadziły do identyfikacji szeregu genów, które wpływają na różne aspekty śmierci komórki. Jednym z najistotniejszych genów w tym procesie jest gen ced- 3, który koduje enzym nazywany kaspazą. Jest on homologiczny do kaspaz w komórkach ssaków, które mogą bezpośrednio uczestniczyć w procesie śmierci [6]. Ryc. 2. Cztery etapy przebiegu apoptozy wg Morita i Tilly [5]. Pierwszy etap obejmuje różne bodźce uszkadzające komórkę. Na drugim etapie aktywowane są wczesne cząsteczki sygnałowe (w tabeli podane są przykładowe sygnały). Na trzecim etapie sygnał ten jest porównywany z sygnałami anty-apoptotycznymi. Jeżeli induktory śmierci przeważą, komórka popełnia samobójstwo: wchodzi w czwarty i ostateczny etap, w którym aktywacja cząsteczek efektorowych prowadzi do jej śmierci. Wykaz skrótów w tabeli: Fas-L ligand Fas; TNF-α czynnik martwicy nowotworu (tumour necrosis factor); TNFR receptor błonowy TNF; p53 białko kodowane przez gen TP53; Bcl-2 białko onkogenu białaczki (oncogene B cell leukemia), Bax,

50 Joanna Rutkowska Bad, Bid białka błonowe z rodziny Bcl, CAD enzym DN-aza aktywowany przez kaspazy (caspase activated DN-ase) Czynniki wywołujące śmierć komórki indukują apoptozę przez aktywację specyficznych receptorów, które należą do nadrodziny TNF/NGF. Łańcuchy tych receptorów charakteryzują się szczególną wewnątrzkomórkową domeną śmierci (death domain DD), która jest kluczowa dla apoptozy przekazywanej przez te ligandy. Związanie ligandów prowadzi do trymeryzacji receptorów, w związku z tym funkcjonalne, rozpuszczalne formy ligandu Fas albo TNF-α również występują jako trymery [5]. Najlepiej scharakteryzowanym receptorem śmierci jest Fas (CD95, Apo-1), i to właśnie z jego udziałem najczęściej dochodzi do AICD [8]. Fas jest białkiem transbłonowym typu II, glikoproteiną typową dla błon komórek układu immunologicznego, m.in. limfocytów cytotoksycznych [4]. Cząsteczka ta posiada 157 aminokwasową domenę zewnątrzkomórkową, 17 aminokwasową hydrofobową domenę transbłonową oraz 145 aminokwasowy karboksylowy koniec cytoplazmatyczny. Właśnie w tym wewnątrzkomórkowym odcinku zawarta jest 68- aminokwasowa domena śmierci (DD), która jest wspólna dla kilku innych przedstawicieli nadrodziny receptorów TNFR, mogących potencjalnie również przesyłać sygnał apoptotyczny [9, 10]. Trymeryzacja receptorów śmierci i następująca asocjacja trzech domen śmierci wewnątrz cytoplazmy umożliwia utworzenie wywołującego śmierć kompleksu sygnałowego (death inducing signaling complex-disc), który prowadzi do aktywacji pro-kaspazy 8. Aktywacja receptorów śmierci może też prowadzić do wytworzenia dodatkowych substancji pełniących funkcję sygnałów śmierci, takich jak ceramidy [5]. Odpowiedź immunologiczna Uruchomienie odpowiedzi komórkowej albo humoralnej zależy od aktywacji określonej subpopulacji pomocniczych limfocytów T. W indukcji odpowiedzi typu komórkowego uczestniczą limfocyty Th1, a humoralnego Th2. Subpopulacje te różnią się profilem wydzielanych cytokin. Obydwa typy limfocytów mają na swojej powierzchni cząsteczki CD4 i rozpoznają antygen prezentowany w połączeniu z cząsteczkami MHC klasy II [11]. Limfocyty Th1 wydzielają IL-2, IL-3,IL-12 i IL-18 [12], limfokinę i IFN-γ, natomiast limfocyty Th2 interleukiny IL- 3,4,5,6,10 i 25. Cytokiny wydzielane przez limfocyty Th1 wspomagają proliferację i różnicowanie klonów komórek efektorowych limfocytów cytotoksycznych (Tc), zwalczających infekcje wirusowe, bądź limfocytów nadwrażliwości typu późnego (TDTH) w przypadku infekcji pasożytami wewnątrzkomórkowymi. Populacja Th2 wspomaga proliferację i poliklonalną odpowiedź limfocytów B, a także wpływa na swoistość ich odpowiedzi. Poznanie subpopulacji limfocytów Th różniących się wydzielanymi cytokinami umożliwiło zrozumienie antagonizmu pomiędzy odpowiedzią typu humoralnego a komórkowego [11]. Populacje limfocytów Th1i Th2 kontrolują wzajemnie swoją aktywność. IFNγ produkowany przez limfocyty Th1 hamuje Th2, a IL- 10 wydzielana przez Th2 hamuje aktywność Th1. Należy podkreślić, że skuteczność odpowiedzi zależy od jej właściwego ukierunkowania. Reakcje niszczące wolnożyjące bakterie są mało skuteczne w przypadku pasożytów wewnątrzkomórkowych. Limfocyty T odgrywają bardzo ważną rolę w regulacji odpowiedzi immunologicznej i jest to rola zarówno wspomagająca, jak i hamująca. Od dawna wiadomo było, że populacja limfocytów w trakcie życia okresowo zwiększa się i maleje, ale oscyluje wokół stałych wartości. Indukcja apoptozy poprzez limfocyty cytotoksyczne (Tc) Namnażanie się komórek limfoidalnych jest niezbędne do skutecznej odpowiedzi immunologicznej przeciwko atakującym organizm drobnoustrojom, ale po pokonaniu infekcji namnożone komórki efektorowe muszą zostać wyeliminowane. Wygaszanie odpowiedzi immunologicznej po zwalczeniu infekcji prowadzi do śmierci olbrzymiej ilości limfocytów, które brały udział w tej odpowiedzi. Wyższe kręgowce rozwinęły całą sieć szlaków sygnalizacji komórkowej, aby zapewnić mechanizmy kontroli aktywacji i ekspansji komórek podczas odpowiedzi immunologicznej, a potem eliminację na drodze apoptozy tych komórek, które nie są już potrzebne. Pozakomórkowe sygnały odbierane przez powierzchniowe receptory, które wywołują aktywację wewnątrzkomórkowych kaskad sygnałowych są zasadniczymi elementami kontroli tych procesów. Ważne łańcuchy sygnałowe prowadzą do uszkodzenia mitochondriów i uwolnienia silnego aktywatora kaspaz cytochromu C do cytoplazmy. Zjawisko to powiązane jest ze zmianą ekspresji genów rodziny Bcl-2, pozostających pod kontrolą genu białka p53, a aktywność tego ostatniego determinuje początek szlaku apoptozy. Wiele procesów immunologicznych kończy się apoptozą z udziałem oddziaływań receptora Fas (CD95/APO-1) i jego ligandu FasL, obu szeroko rozpowszechnionych na komórkach układu immunologicznego. Po związaniu CD95 cząsteczka adaptorowa białko zawierające domenę śmierci związane z receptorem Fas i prokaspaza 8 są przyłączane do receptora i tworzą kompleks sygnałowy indukujący śmierć. Wiązanie prokaspazy 8 prowadzi do jej autokatalitycznej aktywacji, podczas której aktywny enzym jest uwalniany do cytozolu. Raz aktywowana prokaspaza 8 może indukować PCD [13]. Takie oddziaływanie jest zasadniczym sposobem

Zjawisko apoptozy w chorobach alergicznych 51 zabijania komórek docelowych przez limfocyty T i komórki NK. Eliminacja komórek na drodze apoptozy Przykładem fizjologicznej roli, jaką pełni w złożonym organizmie proces apoptozy, jest regulacja liczby limfocytów. Układ odpornościowy spełnia tak ważną rolę w obronie organizmu przed mikroorganizmami i pasożytami oraz dysponuje tak skutecznymi mechanizmami efektorowymi, że jego czynność musi podlegać bardzo precyzyjnej i sprawnej regulacji zarówno wspomagającej, jak i hamującej rozwój procesów odpornościowych. W tej regulacji biorą udział różne subpopulacje limfocytów T pomocniczych (T helper) i regulatorowych (T reg) oraz przeciwciała. Odpowiednio regulowana apoptoza utrzymuje równowagę w układzie immunologicznym. Zjawiska te uczestniczą w eliminacji limfocytów autoreaktywnych, a także w ograniczaniu nadmiernej ekspansji limfocytów odpowiadających na obce antygeny [11]. Zarówno wzrost, jak i spadek nasilenia apoptozy prowadzą do nieprawidłowości [7] i gromadzenia się komórek immunologicznych podczas chorób zapalnych, takich jak astma [13]. Eliminacja komórek efektorowych układu immunologicznego, które już wypełniły swoje zadanie odbywa się również na drodze apoptozy, w której pośredniczy Fas. Delecja klonalna niedojrzałych limfocytów T w grasicy odbywa się bez udziału systemu Fas/FasL. Ponadto apoptoza zachodzi podczas takich reakcji, jak usuwanie limfocytów B w centrach namnażania po aktywacji antygenem. Atopia i alergia Atopia i alergia są pojęciami zbieżnymi, które określają pewne spektrum nieprawidłowych odpowiedzi na antygeny środowiskowe nazywane alergenami. W rozpoznaniu atopii pomocne są badania laboratoryjne i oznaczanie całkowitego poziomu IgE w surowicy, swoistych alergenowo IgE w surowicy, a przede wszystkim testy skórne punktowe [14]. Jest to choroba o podłożu immunologicznym, cechująca się podwyższonym poziomem IgE, prowadzącym do wystąpienia objawów klinicznych astmy, atopowego zapalenia skóry i zapalenia błony śluzowej nosa i spojówek. Interleukiny 4 i 13 produkowane przez limfocyty Th2, odgrywają centralną rolę w regulacji produkcji IgE i rozwoju nadwrażliwości natychmiastowej. Reakcja ta występuje w wyniku oddziaływania zewnątrzpochodnego antygenu z przeciwciałami IgE związanymi z receptorami powierzchniowymi (FcεRI) komórek tucznych i bazofilów krwi. Zachodzi ona miejscowo w różnych narządach lub może mieć charakter uogólniony, w zależności od drogi wnikania alergenu. Prowadzi to do uwalniania mediatorów zapalenia, w tym histaminy i licznych proteaz oraz do syntezy de novo prostaglandyn, leukotrienów, czynnika aktywującego płytki (PAF) i cytokin prozapalnych [15]. Genetyczne uwarunkowania alergii Na rozwój alergii wpływają czynniki środowiskowe i genetyczne. Obserwacje kliniczne jednoznacznie wskazują, że ryzyko wystąpienia alergii jest większe u osób z obciążeniem rodzinnym. W wypadku, gdy u jednego z rodziców stwierdzona została alergia, ryzyko jej rozwoju u dziecka wzrasta do 40%, gdy chorują oboje rodziców, ryzyko sięga 60%. Zapadalność na choroby alergiczne jest częstsza u chłopców [11]. Bardzo istotne jest zidentyfikowanie genów odpowiedzialnych za występowanie u alergików nadmiernych reakcji na nieszkodliwe antygeny środowiskowe. Poszukiwania te obejmują badania nad dziedziczeniem nadreaktywności w zakresie odpowiedzi immunologicznej z udziałem IgE, czyli predyspozycji do alergii i badania nad korelacją występowania określonych antygenów MHC z odpowiedzią na dany alergen [11]. Znaleziono przekonywujące dowody na zaangażowanie w te reakcje odrębnych regionów genomu. Używając metod przesiewowego badania całego genomu i szczegółowych metod mapowania genetycznego ustalono dotąd istnienie czterech niezależnych regionów skojarzonych z występowaniem alergii i astmy. Każdy z nich ma inne właściwości funkcjonalne i każdy może wskazywać na inny szlak metaboliczny w patogenezie astmy. Geny podatności zostały omówione w artykule Kere i Laitinen [15], którzy zidentyfikowali na chromosomie 7p gen, odpowiedzialny za podwyższoną produkcję IgE i podatność na astmę. Gen ten, kodujący receptor związany z białkiem G (GPCR) i ulegający wysokiej ekspresji w tkankach zapalnych, wydaje się być wprost związany z fenotypem astmatycznym zależnym od wysokiego poziomu IgE [15]. Predyspozycja genetyczna i czynniki środowiskowe ustalają próg aktywacji, funkcje efektorowe i czas życia komórek T, innych komórek zapalnych i komórek danej tkanki. U osób z atopową chorobą alergiczną ulegają apoptozie aktywowane, swoiste wobec alergenu limfocyty T, wykazujące wysoką ekspresję IFN-γ, co przesuwa równowagę w kierunku przeżywających limfocytów Th2. W tkankach dotkniętych procesem alergicznym komórki te zaczynają produkować zapalne cytokiny i wywołują aktywację i śmierć komórek nabłonka. U osób z alergią na pojedynczy alergen, ale bez podłoża atopowego, dominuje natomiast zakłócenie równowagi na skutek przewagi limfocytów Th2 swoistych wobec alergenu nad komórkami T reg1 [16]. Patogeneza alergii Aktywacja subpopulacji limfocytów T, które wydzielają czynniki zapalenia, w tym IL-4, IL-5 i/lub IL-13, to kluczowe wydarzenie w patogenezie alergii. Interleukiny są niezbędne do produkcji IgE swoistych dla alergenu, IL- 4 przy inicjacji odpowiedzi o charakterze przewlekłym,

52 Joanna Rutkowska IL-13 przy ich podtrzymaniu, IL-5 jest wymagana do przeżycia eozynofili. Razem te cytokiny inicjują reakcje nadwrażliwości natychmiastowej przeciwko alergenom i aktywują tkanki zapalne i komórki efektorowe alergii. Swoiste dla alergenu limfocyty T można znaleźć zarówno u osób alergicznych, jak i u zdrowych, uczulonych na alergen [15]. Współczesne środowisko człowieka nie tylko stale pomnaża liczbę potencjalnych alergenów, ale także poprzez działanie różnych czynników szkodliwych natury biologicznej, fizycznej i chemicznej poważnie uszkadza naturalne bariery ochronne ustroju i ułatwia ich penetrację. Regulacja odpowiedzi alergicznej Rola komórek dendrytycznych (DC) Aktywacja DC i subpopulacji swoistych efektorowych lub regulatorowych limfocytów przez alergen to wstępne etapy, prowadzące do alergii lub do normalnej odpowiedzi immunologicznej. Kuipers i Lambrecht [15] opisali wzajemną zależność komórek dendrytycznych, limfocytów Th2 i T reg w rozwoju alergii i astmy a także wykazali, że DC mają swoją funkcję podczas odpowiedzi efektorowej w klinicznych postaciach choroby. Z perspektywy terapeutycznej zdolność DC do stymulowania ekspansji i funkcji swoistych w stosunku do alergenu komórek T reg może zostać wykorzystana do stworzenia nowych sposobów zapobiegania lub leczenia alergii i astmy. DC różnego pochodzenia stymulują ekspansję populacji komórek T, która wykazuje fenotyp T reg, charakteryzujący się produkcją IL-10. A zatem limfocyty T reg są definiowane przez swoją funkcję i są dominującą populacją komórek T u osób zdrowych, w porównaniu z alergikami [15]. Rola limfocytów T reg U zdrowych osób odpowiedź na białka alergenów jest silnie wytłumiana przez limfocyty T regulatorowe, wydzielające IL-10 i/lub TGFβ. Rozwój niedostatecznej liczby T reg wydaje się być znakiem rozpoznawczym stanu alergicznego, w porównaniu ze zdrowymi osobami, u których występuje dostateczna liczna komórek T reg IL- 10+. Zarówno komórki efektorowe Th1 i Th2, jak i komórki T reg wymagają aktywacji przez DC i peptyd antygenowy. A zatem trzy funkcjonalne fenotypy limfocytów T wykazują stan aktywacji na obwodzie i wymagają ciągłej stymulacji antygenowej do ekspansji i aktywności, a prawdopodobnie również do podtrzymania pamięci immunologicz-nej. Wydaje się zatem oczywiste, że te wszystkie trzy fenotypy funkcjonalnych komórek T należą do frakcji komórek T wykazujących ekspresję CD25 (markera aktywowanych limfocytów T). Inne czynniki transkrypcyjne są zwykle czynne w każdym z tych fenotypów komórek efektorowych lub regulacyjnych [15]. Brak równowagi pomiędzy limfocytami Th2 i T reg powoduje niedostateczną tolerancję alergenu [15]. Wykazano to dla prawidłowej i alergicznej odpowiedzi na różne alergeny, używając limfocytów CD4+ świeżo wyizolowanych z krwi obwodowej, wydzielających IL-10 (T reg1), IL-4 (Th2) lub IFNγ (Th1). Równowaga pomiędzy efektorowymi limfocytami Th1 i Th2 a T reg jest utrzymywana przez komórki prezentujące antygen i warunki środowiskowe, a sądzi się, że proces podobny do różnicowania się komórek Th1 i Th2 może także generować komórki populacji regulatorowych. Wydaje się zwłaszcza, że siła wiązania TCR do peptydu związanego na MHC klasy II i ilość antygenu odgrywają zasadniczą rolę. Siła oddziaływań pomiędzy kompleksem TCR antygenem kompleksem MHC jest decydująca dla wytworzenia odpowiednich fenotypów cytokinowych [15]. Rola TGFβ Indukowanie komórek T reg, supresja lub zmiana odpowiedzi immunologicznej są regulowane przez TGFβ. Schmidt-Weber i Blaser [15] dokonali przeglądu regulacyjnej funkcji TGFβ w indukcji tolerancji immunologicznej i roli TGFβ w procesach zapalnych i zmianach tkankowych. TGFβ jest zdolny do wywierania licznych działań wewnątrz i poza układem immunologicznym. Ostatnie odkrycia podkreślają rolę TGFβ w supresji i różnicowaniu się limfocytów T reg. Jednak rośnie też liczba argumentów za udziałem TGFβ w procesach naprawczych, co prowadzi do odkładania się macierzy międzykomórkowej i przebudowy tkanki. TGFβ może działać korzystnie w przewlekłych procesach zapalnych, takich jak astma, hamując swoistą odpowiedź immunologiczną, podczas gdy zmiana tkanki wywoływana przez TGFβ jest poważnym powikłaniem w tych chorobach zapalnych [15]. Migracja komórek T Aktywowane limfocyty T selektywnie zasiedlające skórę mają antygen limfocytów skojarzonych ze skórą (cutaneous lymphocyte antygen, CLA), dzięki czemu mogą być izolowane. Co ciekawe, limfocyty, które przemieściły się i uległy aktywacji w skórze przeżywają, chociaż wykazują w wysokim stopniu ekspresję receptorów śmierci i wydzielają odpowiadające im ligandy. Są one chronione przed apoptozą przez cytokiny, takie jak IL-2, IL-4 i IL-15, a także przez niektóre białka macierzy [15]. Gdy komórki T ulegną aktywacji, migrują przy udziale chemokin i mediatorów zapalnych komórek efektorowych do ognisk zapalnych. Komórki T, które przywędrowały do tkanki i uległy tam dalszej aktywacji, prawdopodobnie pod wpływem superantygenów bakteryjnych lub wirusowych, wykazują przedłużone przeżycie w tkance, wspomagane głównie przez białka macierzy międzykomórkowej, jak i niektóre cytokiny. Wreszcie, w odpowiedzi nawet na małe ilości IFNγ lub TNFα wydzielanego przez komórki T i komórki efektorowe podczas odpowiedzi alergicznej,

Zjawisko apoptozy w chorobach alergicznych 53 pobudzane są receptory śmierci na komórkach danej tkanki, które powodują zmiany gąbczaste tkanki i indukowaną aktywacją śmierć (AICD) komórek nabłonka. Ta seria zjawisk immunologicznych doprowadza do destrukcji tkanek objętych zapaleniem. Co ciekawe, komórki Th1 są bardziej podatne na AICD niż komórki Th2. Wydaje się to być przyczyną niezrównoważonej odpowiedzi, przesuniętej w kierunku Th2. A zatem zróżnicowana regulacja AICD w komórkach Th1 i Th2, przedłużone przeżywanie aktywowanych komórek T i eozynofili w tkance, a także AICD komórek nabłonka są w ostatecznym rozrachunku odpowiedzialne za powstanie i objawy zapalenia alergicznego w konkretnym narządzie. Tak dzieje się również w wyprysku indukowanym przez leki. Dokładne zrozumienie mechanizmów komórkowych na poziomie cząsteczek jest podstawą celowanej terapii i może być wykorzystane w zapobieganiu chorobom alergicznym i innym o podłożu zapalnym [15]. Fazy choroby alergicznej Rozwój chorób alergicznych można podzielić na fazę indukcji i fazę efektorową. Faza indukcji charakteryzowana jest przez przesunięcie równowagi odpowiedzi T- komórkowej w stronę limfocytów Th2, czemu towarzyszy wzrost IgE z receptorami powierzchniowymi komórek tucznych i eozynofili. Może być tak, że to środowisko immunologiczne w narządach podatnych na choroby alergiczne faworyzuje odpowiedź Th2 albo alergeny powodują dysregulację, lub też nadmierną aktywację komórek Th2. Efekt objawia się w fazie efektorowej, której różne składniki odpowiedzi Th2 pojawiają się po wywołaniu stanu zapalnego. Proces zapalny może być dwufazowy. Najpierw następuje degranulacja komórek tucznych, co powoduje uwolnienie mediatorów z efektem farmakologicznym zarówno na otaczające tkanki, jak i z aktywnością chemotaktyczną. To prowadzi do wtórnego zapalenia przez przyciąganie eozynofilów, monocytów, neutrofilów i dodatkowych limfocytów do miejsca reakcji. Uwalniane są duże ilości cytokin, które w dalszym ciągu zaburzają homeostazę [14]. W atopowym zapaleniu skóry krążące limfocyty wykazujące ekspresję antygenu CLA + i CD45RO +, ze swoistymi dla skóry receptorami zasiedlania, stanowią populację aktywowanych komórek pamięci i efektorowych. Wykazują one wysoki poziomy Fas i ligandu dla Fas oraz podlegają apoptozie pod wpływem aktywacji. Wyizolowane komórki CLA+ CD45O+ od pacjentów atopowych wykazują szczególną właściwość w apoptozie zainicjowanej in vivo, polegającą na degradacji prokaspaz i tworzeniu aktywnej formy kaspazy 8. Przede wszystkim komórki Th1 z puli aktywowanych komórek pamięci i komórek efektorowych w sposób selektywny podlegają śmierci na skutek aktywacji, co u chorych z atopowym zapaleniem skóry przesuwa odpowiedź immunologiczną w kierunku przeżywających komórek Th2 [17]. Limfocyty T przeważają w naciekach komórkowych w zapaleniu alergicznym. Zaburzenie równowagi poprzez przesunięcie w stronę Th2 obwodowej odpowiedzi immunologicznej wydaje się być istotnym czynnikiem w patogenezie [18]. Akdis i wsp. [15] wskazali na znaczącą rolę regulacyjną apoptozy w selekcji limfocytów T i w zapaleniach tkanki w chorobach alergicznych. Wykazali oni, że defekty apoptozy i tolerancji obwodowej limfocytów T określają fenotyp alergiczny. W zapaleniu alergicznym limfocyty T są początkowo aktywowane przez alergeny pochodzące z powietrza, pokarmu, autoantygeny, superantygeny bakteryjne [18]. Aktywowane limfocyty T swoiste wobec alergenu, najłatwiejsze do pobudzenia przez superantygeny bakteryjne lub wirusowe i produkujące następnie duże ilości IFNγ, ulegają apoptozie przede wszystkim w krążeniu. Może to być przyczyną przekierowania odpowiedzi immunologicznej w kierunku przeżywających komórek Th2. W zaatakowanych tkankach pod wpływem stymulacji superantygenem, komórki te produkują cytokiny efektorowe, które z kolei indukują zmiany gąbczaste i apoptozę komórek nabłonka w skórze i płucach. W badaniach Akdis i wsp. [15] opisano, że apoptoza krążących komórek pamięci lub efektorowych była ograniczona do osób atopowych, podczas kiedy nieatopowi pacjenci zdrowi i uczuleni na jad pszczeli nie wykazywali śladu apoptozy komórek T in vivo [17]. Ostatnio w krajach rozwiniętych notuje się wzrost nasilenia i częstości występowania chorób atopowych. Jednym z czynników wpływających na tę tendencję może być spadek częstości chorób zakaźnych, w tym chorób pasożytniczych i gruźlicy, dzięki poprawie standardu życia, szczepieniom i lekom przeciwrobaczym [19]. Podsumowanie W odpowiedzi alergicznej zaburzone są nie tyle mechanizmy apoptozy, co szlaki regulatorowe, prowadzące do przedłużania życia komórek, które fizjologicznie powinny wypełnić swoje zadanie i zginąć. W oparciu o obecny stan wiedzy wydaje się, że za to zakłócenie odpowiada przede wszystkim nieprawidłowa aktywność i/lub liczba limfocytów T reg. Piśmiennictwo 1. Ramirez C. R., Carracedo A.J., Moreno A.C., Guerra M.P.: Apoptosis and disease. Alergol. Immunol. Clin., 1999, 14, 6, 367-374. 2. Guerra F., Carracedo J., Madueno J.-A., Sanchez-Guijo P., Ramirez R.: Allergens Induce Apoptosis in Lymphocytes from Atopic Patients. Human Immunol.,, 1999, 60, 840-847. 3. Zimmermann K.C., Green D.R.: How cells die: Apoptosis pathways. J. Allergy Clin. Immunol.,2001, 108, 99-103. 4. Kłyszejko-Stefanowicz L.: Cytobiochemia. Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa, 2002, 772-814. 5. Vaskivuo T.: Regulation of apoptosis in the female reproduc-

54 Joanna Rutkowska tive system: Acta Universitatis Ouluensis Medica D 676, 2002 University of Oulu, Oulu Finland. 6. Lenardo M.J.: Introduction: The molecular regulation of lymphocyte apoptosis. Immunology, 1997, 9, 1-5. 7. Sepiashvili R.I., Shubich M.G., Kolesnikova N.V., Slavyanskaya T.A., Lomtatidze L.V.: Apoptosis in immunologic processes. Clin. Applied Immunol., 2001, Reviews 1, 163-172.2 8. Lynch D.H., Ramsdell F., Alderson M.R.: Fas and FasL in the homeostatic regulation of immune responses. Immunol. Today, 1995, 16, 569. 9. Itoh N., Nagata S.: A novel protein domain required for apoptosis. Mutationalanalysis of human Fas antigen., J. Biol. Chem., 1993, 268, 10932. 10. Krammer P.H.: CD95 (APO-1/Fas)-mediated apoptosis: live and let die. Adv. Immunol., 1995, 71, 163. 11. Gołąb J., Jakóbisiak M., Lasek W. Immunologia. Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 2002, 337-356. 12. Multiple pathways driving IgE production and chronic dermatitis in mice: a model for atopic dermatitis? J. Invest. Dermatol., 2005, 124, 1, 11-12. 13. Holtzman M.J., Green J.M., Jayaraman S., Arch R.H.: Regulation of T cell apoptosis. Apoptosis, 2000, Nov; 5(5), 459-71. 14. Yazdanbakhsh M., van den Biggelaar A., Maizels R. M.: Th2 responses without atopy: immunoregulation in chronic helminth infection and reduced allergic disease. Trends Immunol., 2001, 22, 7, 372-377. 15. Blaser K.: Allergy and hypersensitivity:from genes to phenotype. Curr. Opin. Immunol., 2004, 16, 685-688. 16. Akdis C., A., Blaser K., Akdis M.: Apoptosis in tissue inflammation and allergic disease. Curr. Opin. Immunol.,, 2004, 16, 717-723. 17. Adkis M., Trautmann A., Klunker S.i wsp.: T helper (Th) 2 predominance in atopic diseases is due to preferential apoptosis of circulating menory/effector Th1 cells. FASEB J., 2003, 17, 1026-1035. 18. Akdis C.A., Blaser K., Akdis M.: Apoptosis in tissue inflammation and alergic disease. Curr. Opin. Immunol., 2004, 16, 717-723. 19. Mao Xiao-Quan, Sun D.-J., Miyoshi A. i wsp.: The Link between Helminthic Infection and Atopy. Parasitol. Today, 2000, 16, 5, 186-188.