ELECTRSPRAY INIZATIN (ESI)
NBEL 2002 John B. Fenn ur. 1917 r.
Źródło jonów ESI skonstruowane przez J. Fenna Copyright 2003 M. Mann, S. Shen i J. B. Fenn Electrospray Mass Spectrometry w: Mass Spectrometry in the Biological Sciences: A Tutorial, Ed. M. L. Gross, Kluver Academic Publishers, Dordrecht 1992.
Źródło jonów ESI w spektrometrze Mariner
Mechanizm przechodzenia jonów do fazy gazowej w technice ESI ETAP 1 Tworzenie aerozolu podczas wypływu cieczy z kapilary w polu elektrycznym kapilara gaz rozpylający
Mechanizm przechodzenia jonów do fazy gazowej w technice ESI ETAP 2 (powtarza się wielokrotnie) dparowanie rozpuszczalnika z kropli i jej rozerwanie ( eksplozja kulombowska ) po przekroczeniu bariery Raleigha + + + + + ++ + ++ + + + + odparowanie + + + + + + + + + rozpuszczalnika + + + + + "eksplozja kulombowska" po przekroczeniu bariery Raleigha + + + + + + + + + + + + + + + +
Mechanizm przechodzenia jonów do fazy gazowej w technice ESI ETAP 3 Wariant desorpcja z kropli Desorpcja jonu z kropli do fazy gazowej w wyniku działania pola elektrycznego + + + + + + + + + (średnica kropli ok. 10 nm) desorpcja jonu w wyniku działania pola elektrycznego + + + + + + + + + +
Mechanizm przechodzenia jonów do fazy gazowej w technice ESI ETAP 3 Wariant odparowanie do sucha W wyniku dalszego odparowywania rozpuszczalnika powstają częściowo solwatowane jony naładowane wielokrotnie mechanizm ten dotyczy dużych, polarnych cząsteczek + + + + + + + + + (średnica kropli ok. 10 nm) dalsze odparowywanie rozpuszczalnika i podziały kropli + + jon naładowany wielokrotnie + + + + + + +
Gaz rozpylający (N 2 ) Schemat źródła jonów electrospray w spektrometrze API 365 Dysza Płytka osłonowa Ciśnienie atmosferyczne Zbierak Pierścień Copyright 2003 Q0 - -- - - - -- -- - - -- -- -- -- -- -- -- -- - --- - - - - - Kapilara stalowa ~ 2 Torr 8 x 10-3 Torr Roztwór próbki Przechodzenie jonów do fazy gazowej Gaz osłonowy (N 2 ) Pompa wstępna Pompa turbomolekularna
Zasada działania źródła jonów typu TurboIonSpray
Źródło jonów typu TurboIonSpray
Zasada działania źródła jonów typu MicroIonSpray
Źródło jonów ESI firmy Agilent
Źródło jonów typu Z-SPRAY
Źródła jonów ESI - podsumowanie Electrospray lub IonSpray TurboIonSpray Microspray Nanospray Typ źródła Przepływ próbki 1 50 µl/min 50 1000 µl/min 50 1000 nl/min 1 100 nl/min Podstawowa zasada: im mniejszy przepływ tym większa czułość. Copyright 2003
100 90 41 57 % Intensity 80 70 60 50 40 43 55 30 20 60 74 69 10 Widma EI i ESI nadkaprylanu metylu EI 70 ev [M 2 CH 3 ] + 127 M = 174 CH 3 83 87 97 105 115 0 40 60 80 100 M/z 120 140 160 180 200 100 197.1 90 80 M+Na + ESI w MeH 70 60 M+H + 175.1 % Intensity 50 40 30 2M+Na + 371.2 Copyright 2003 20 192.2 10 166.1 213.1 279.2 301.2 339.2 0 150 200 250 300 350 400 Mass (m/z)
Widmo ESI związku o małej cząsteczce (M = 397, MeH, jony dodatnie) Spec #1[BP = 817.4, 2132] 2M + Na + 100 817.3 2132 90 Ph 80 N Ph % Intensity 70 60 50 M + H + M + Na + 420.2 398.2 H M = 397 818.4 40 30 M + K + 436.2 20 10 616.3 623.7 819.4 Copyright 2003 0 0 300 420 540 660 780 900 Mass (m/z)
Widma ESI w trybie jonów dodatnich i ujemnych pochodnej binaftylu o masie 344 u, zawierającej grupy H i CH % Intensity 100 90 80 70 60 50 40 30 20 F? 149.0 201.0? 225.2 F 279.1? F? 301.1 239.2 367.1 205.1 Spec #1[BP = 201.0, 724] F 155.1 711.2 10 241.2 391.3 485.8 579.3 712.2 0 100 240 380 520 660 0 800 Mass (m/z) ESI (+) [2M + Na + ] + 724 100 90 80 70 60 343.1 CH (H) (H) m n Spec #1[BP = 343.1, 2675] [M H + ] ESI (-) 2675 % Intensity 50 40 30 20 344.1 Copyright 2003 10 187.0 345.1 0 100 240 380 520 660 0 800 Mass (m/z)
Widma LSIMS i ESI peptydu o masie 2524,6 u LSIMS w DTE/DTT 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 528 769 882 996 x 20 0.0 400 800 1200 1600 2000 2400 M + H + 2526 M/z Spec /1:8[BP = 632.1, 2248] 100 90 632.1 [M + 4H + ] 4+ 842.51 842.85 2248 ESI wmeh [M + 5H + ] 5+ % Intensity 80 70 60 50 40 [M + 3H + ] 3+ 842.5 842.18 843.18 843.53 M = 0,33 n = 3 30 603.9 Copyright 2003 20 505.9 441.3 660.4 10 880.5 [M + 2H + ] 2+ 1263.3 0 0 400 840 1280 1720 2160 2600 Mass (m/z)
100 90 Widmo ESI peptydu o masie 3377 u [M+4H + ] 4+ 846.17 Spec /1:14[BP = 846.1, 396] 846.17 845.92 846.33 M 0,25 n = 4 396.2 80 846.68 70 845.67 846.93 60 % Intensity 50 40 M 30 20 10 [M+5H + ] 5+ 676.95 [M+3H + ] 3+ 1127.88 0 500 740 980 1220 1460 1700 Mass (m/z) 3380.64 100 3379.63 90 3381.68 80 Spec /1:14=>DECNV[BP = 3380.5, 571] 571.1 70 3382.58 60 % Intensity 50 40 3378.64 3383.58 3384.48 Copyright 2003 3393.58 30 20 10 0 3367.0 3376.6 3386.2 3395.8 3405.4 3415.0 Mass (m/z)
WIDM ESI PEPTYDU MASIE 16952 Da 16952.20 Widmo po dekonwolucji m 2 m 1 m 1 = (M + n)/n m 2 = (M + n + 1)/(n + 1) n = (m 2 1)/(m 1 m 2 ) M = ( m 2 1)( m1 1) m 1 m 2
Widmo ESI(+) dimeru albuminy wołowej
Widmo ESI(-) syntetycznego oligonukleotydu Copyright 2003
Widmo ESI kompleksu w MeH roztwór świeżo przygotowany 100 90 80 70 [L + H ] 309.2 + + [2L+Co 2+ ] 2+ Spec #1[BP = 309.2, 8991] 337.7 L + CoCl wmeh [L+Co 2+ +Cl - ] + 2 8991 % Intensity 60 50 40 [L+Co 2+ +MeH] 2+ 30 199.6 402.1 [3L+Co 2+ ] 2+ 491.8 [2L+Co 2+ +Cl - ] + 710.3 20 10 0 183.5 404.1 232.6 645.9 839.2 249.6 617.4 768.3 842.2 0 100 280 460 640 820 1000 Mass (m/z) 712.3 [2L+2Co 2+ +3Cl - ] +
Widmo ESI kompleksu w MeH roztwór po 1 godzinie [L + 2H + ] 2+ Spec #1[BP = 155.1, 4153] 100 90 155.1 L + CoCl 2 wmeh 4153 80 [L + H + ] + 309.2 70 60 % Intensity 50 40 30 20 10 182.0 210.0 294.2 331.2 0 0 100 280 460 640 820 1000 Copyright 2003 Mass (m/z)
Widmo ESI kompleksów 18-C-6 z kationami litowców 349.2 M + Rb + M + Cs + 397.2 M = 264 351.2 18-C-6 + NaCl + RbCl + CsCl (1:1:1:1) w MeH H 2 (7:3) (bez K +!) M + Na + M + K + 303.1 287.1 282.1 2M + Cs + 661.5 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 460 480 500 520 540 560 580 600 620 640 660 680 700 m/z, amu
Widma ESI kompleksów eterów makrocyklicznych z kationami litowców 269.4 M + Na + 313.3 M + K + 329.2 M + Rb + 375.3 423.1 377.3 285.3 527.4 603.5 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 460 480 500 520 540 560 580 600 620 640 m/z, amu NH M = 290 HN Ligand + NaCl + KCl + RbCl + CsCl (1:1:1:1:1) w MeH H 2 (7:3) M + Cs + 2M + Na + M + Na + 625.5 M + K + M + Cs + 735.3 641.4 687.2 689.2 M + Rb + M = 602 N N CH 3 CH 3 Ligand + NaCl + KCl + RbCl + CsCl (1:1:1:1:1) w MeH H 2 (7:3) 2M + Na + 2M + K + 2M + Rb+ Copyright 2003 1227.7 2M + Cs + 1243.8 1289.7 1337.7 650 700 750 800 850 900 950 1000 1050 1100 1150 1200 1250 1300 1350 m/z, amu
Widmo ESI w MeH związku o masie 451 Da M + Na + 474.1621 100 90 80 70 Spec /1:13[BP = 474.1, 3323] Ph N Tos C 26 H 29 N 4 S M = 451 % Intensity 60 50 40 2M + Na + 925.3404 30 20 10 304.2566 294.0725 511.2571 553.3115 [3M + Fe 2+ ] 2+ 704.7437 Copyright 2003 0 250 400 550 700 850 1000 Mass (m/z)
Fragment widma ESI w MeH związku o masie 451 Da odpowiadający jonowi [3M + Fe 2+ ] 2+ oraz widmo obliczone dla podanego wzoru % Intensity 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 Widmo zmierzone 703.74 704.74 705.25 Spec /1:13[BP = 474.1, 3323] 705.74 706.25 706.75 704.25 707.25 Ph 0 703.0 704.2 705.4 706.6 707.8 709.0 N Tos C 26 H 29 N 4 S M = 451 % Intensity 100 90 80 70 60 50 40 30 Widmo obliczone Copyright 2003 704.74 IS:C78H87N312S3Fe[BP = 704.7, 100] 705.24 705.74 706.24 20 706.74 10 703.74 704.24 707.24 0 703.0 704.2 705.4 706.6 707.8 709.0 Mass (m/z)
Widmo ESI w MeH estru metylowego N-FMC-proliny 100 M + Na + 374.1 3M + Ca 2+ 546.7 N CH 3 90 547.2 3M + Fe 2+ 554.7 80 M = 351 70 60 50 3M + Mg 2+ 539.7 539.2 555.2 547.7 555.7 40 30 20 10 M + H + 352.2 546.7 554.7 725.3 2M + Na + 539.7 0 300 400 500 600 700 800 Copyright 2003
Jonizacja chemiczna pod ciśnieniem atmosferycznym (APCI) Atmospheric Pressure Chemical Ionization
Jonizacja chemiczna pod ciśnieniem atmosferycznym (APCI) Copyright 2003
Widmo APCI(-) digoksyny w układzie MeH/CHCl 3 Molecular Weight = 780.9588 Exact Mass = 780.4296 Molecular Formula = C 41 H 64 14 H CH 3 CH 3 H H CH 3 H CH 3 H 389.2 + 1 + 35 = 425.2 519.3 + 1 + 35 = 555.3 649.4 + 1 + 35 = 685.4 780.4 + 35 = 815.4 CH 3 H -Q1: 14.074 to 15.247 min from CH3ClDigoxin.wiff Max. 2.6e6 cps. 2.6e6 2.4e6 2.2e6 2.0e6 1.8e6 1.6e6 1.4e6 1.2e6 1.0e6 8.0e5 6.0e5 425.2 685.6 555.2 687.6 557.6 815.6 817.6 4.0e5 427.5 Copyright 2003 2.0e5 649.8 211.3 407.7 667.7 797.8 295.6 389.6 779.9 519.6 537.7 0.0 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900 m/z, amu
Cechy charakterystyczne metod ESI i APCI zakres mas 10 100 000 (do 2000 dla APCI) związki polarne (ESI) i niepolarne (APCI) wprowadzane w roztworach lotnych rozpuszczalników współpraca z analizatorami magnetycznymi, kwadrupolowymi, pułapkami jonowymi i TF: możliwość badania fragmentacji wysokoenergetycznych i niskoenergetycznych oraz wykonywania dokładnych pomiarów masy możliwość bezpośredniej współpracy z HPLC mała wrażliwość na zanieczyszczenia próbki Copyright 2003
Fotojonizacja pod ciśnieniem atmosferycznym (APPI) Atmospheric Pressure Photoionization
Źródło jonów do APPI
Procesy jonizacji w metodzie APPI
Porównanie czułości metod APCI i APPI Copyright 2003
Analiza HPLC-MS mieszaniny wielopierścieniowych węglowodorów aromatycznych z detekcją APPI 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 Compound Naphthalene Acenaphthylene Acenaphthene Fluorene Phenanthrene Anthracene Fluoranthene Pyrene Benz(a)anthracene Chrysene Benzo(b)fluoranthene Benzo(k)fluoranthene Benzo(a)pyrene Benzo(g,h,I)perylene Indeno(1,2,3,c,d)pyrene Dibenz(a,h)anthracene Mass 128 152 154 166 178 178 202 202 228 228 252 252 252 276 276 278 Reversed Phase (pg on column) 1000 4000 500 400 400 400 400 400 100 100 400 400 40 100 100 100 Copyright 2003
Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization (MALDI)
Nobel 2002 Koichi Tanaka ur. 1959 r.
Spektrometr MALDI TF (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time f Flight) wiązka światła lasera V Laser wiązka jonów droga wiązki jonów = l Detektor Zależność czasu przelotu jonu od jego masy t = l v ev = mv = 2 l 2eV m 2 m = = v = 2eV 2 l l 2eV t 2eV m 2 m Próbka na blaszce stalowej Copyright 2003 Znaczenie symboli: m masa jonu (kg) e ładunek elementarny (C) V napięcie przyspieszające (V) v prędkość liniowa jonu (m/s) t czas przelotu jonu (s) l droga wiązki jonów (m)
Mechanizm jonizacji w technice MALDI Impuls laserowy trafia w powierzchnię próbki (a) przekazując jej energię, która powoduje stopienie i odparowanie cząsteczek obojętnych i jonów z małego obszaru próbki (b). Po kilku nanosekundach cząsteczki obojętne zostają odpompowane, a cząstki naładowane (jony) są wciągane polem elektrycznym do analizatora spektrometru masowego (c).
Matryce stosowane w technice MALDI Copyright 2003
Widmo MALDI-TF β-galaktozydazy M+H + 116 336 Da
Widmo MALDI-TF białka (M = 149 190 Da)
Widma MALDI-TF zarejestrowane przy użyciu lasera podczerwonego i nadfioletowego Copyright 2003
Widma ESI i MALDI polistyrenu z dodatkiem CF 3 CAg Copyright 2003 ESI MALDI
Cechy charakterystyczne metody MALDI zakres mas 100 1 000 000 związki polarne, stałe lub nielotne ciecze mała wrażliwość na zanieczyszczenia próbki MALDI współpracuje praktycznie tylko z analizatorami TF umiarkowana rozdzielczość (w najnowszych spektrometrach wysoka) metody badania fragmentacji ciągle wymagają dopracowania możliwość pełnej automatyzacji wprowadzania próbek i rejestrowania widm Copyright 2003
Desorption-Ionization Mass Spectrometry on Porous Silicon (DIS)
Matryce krzemowe stosowana w technice DIS Copyright 2003
Widma zarejestrowane metodą DIS Copyright 2003 a, The DIS mass spectrum of a mixture of five peptides (2 pmol each). b, The DIS mass spectrum of a mixture of three small molecules, including caffeine (m/z 196), an antiviral drug WIN (m/z 357) and reserpine (m/z 609) (1 pmol each). c, The DIS mass spectrum of 10 pmol N-octyl β-dglucopyranoside (m/z 293) and its sodium adduct ion (m/z 315). The sodium ion (m/z 23) itself was also detected. Desorption ionization mass spectrometry on porous silicon; Jing Wei, Jillian M. Buriak & Gary Siuzdak, Nature, 399 (1999) 243-246.
Widma zarejestrowane metodą DIS Figure 4. DIS mass spectra of des-argbradykinin using small quantities of sample and in the presence of salt. a d, DIS mass spectra with: a, 7 fmol; b, 700 attmol; c, 2 pmol in the presence of a 2M NaCl; d, 2 pmol in a saturated solution of K 3 P 4 buffer solution. All spectra shown were generated from an n- type mesoporous silicon surface modified with an ethyl phenyl termination; they are the average of 128 shots with a nitrogen laser (337 nm) at an intensity, typical of MALDI experiments, of 2 to 50 mj per pulse. Desorption ionization mass spectrometry on porous silicon; Jing Wei, Jillian M. Buriak & Gary Siuzdak, Nature, 399 (1999) 243-246.
Surface-Enhanced Laser Desorption/Ionization (SELDI)
Matryca ProteinChip
Widmo SELDI-TF mieszaniny peptydów Copyright 2003 Fig. 2. SELDI-TF MS spectra of glucocerebrosidase after tryptic digestion. Positive-ion mass spectra of peptide products resulting from on-chip tryptic digestion of glucocerebrosidase, as analyzed by SELDI- TF MS. The mass/charge (m/z) values of all detected species are shown. Emilia Caputo, Ramy Moharram, and Brian M. Martin, Analytical Biochemistry 321 (2003) 116 124