ENDOKRYNOLOGIA POLSKA

E P ENDOKRYNOLOGIA POLSKA POLISH JOURNAL OF ENDOCRINOLOGY CONGRESSIONAL PAPERS

Materiały III Konferencji Sekcji Endokrynologii Molekularnej PTE Prace przedstawione podczas III KONFERENCJI SEKCJI ENDOKRYNOLOGII MOLEKULARNEJ Polskiego Towarzystwa Endokrynologicznego Poznań, - października 00 Pod redakcją: Dr hab. Med. Katarzyny Łąckiej Dr med. Ilony Gradeckiej-Kubik KOMITET HONOROWY KOMITET NAUKOWY Wojewoda Wielkopolski Andrzej Nowakowski J M Rektor Akademii Medycznej im. Karola Marcinkowskiego w Poznaniu Prof. dr hab. Grzegorz Bręborowicz Prezydent Miasta Poznania Ryszard Grobelny Dziekan Wydziału Lekarskiego II Prof. dr hab. Honorata Limanowska-Shaw Prezes Polskiego Towarzystwa Endokrynologicznego Prof. dr hab. Stefan Zgliczyński Konsultant Krajowy w dziedzinie endokrynologii Prof. dr hab. Janusz Nauman Przewodniczący Oddziału Poznańskiego Polskiego Towarzystwa Endokrynologicznego Prof. dr hab. Eugeniusz Korman Prof. dr hab. Barbara Jarząb Prof. dr hab. Andrzej Lewiński Dr hab. Katarzyna Łącka Prof. dr hab. Alicja Macke-Nauman Prof. dr hab. Wiesław H. Trzeciak KOMITET ORGANIZACYJNY Przewodniczący: dr hab. med. Katarzyna Łącka Sekretarz: dr med. Ilona Gradecka-Kubik Członkowie: dr med. Agata Czarnywojtek dr Hanna Komarowska dr Marta Ociepa-Zawal mgr Błażej Rubiś dr Aneta Rzepka dr Joanna Szarzyńska dr Maciej Wawrzyniak Sekretariat: Jolanta Jurek, Barbara Torz PROGRAM Piątek - października 00 8.00-9.0 OTWARCIE KONFERENCJI Wykład inauguracyjny prof. B. Jarząb (Gliwice) Molekularne obrazowanie ekspresji genów - nowa metoda badania ekspresji genów. SESJA 9.30-.40 Analiza mutacji genów tarczyca Przewodniczący: prof. dr hab. med. Andrzej Lewiński (Łódź) prof. dr hab. med. Janusz Nauman (Warszawa) prof. dr hab. med. Jerzy Sowiński (Poznań) 9.30-0.00 wykład Katarzyna Łącka (Poznań) Molekularne i kliniczne aspekty zaburzeń białek wiążących hormony tarczycy. Dyskusja. 0.00-0.30 wykład Marek Niedziela (Poznań) Rola peroksydazy tarczycowej w fizjologii i patologii gruczołu tarczowego. Dyskusja 0.30-0.40 Dedecjus M, Masson D, Lewiński A, Brzeziński J, Gambert Ph, Lagrost L (Łódź, Dijon) Stężenie oraz skorygowana i specyficzna aktywność CETP w surowicy pacjentów z różnymi zaburzeniami stanu tyreometabolicznego. Dyskusja 0.40-0.50 Pachucki J, Ambroziak M, Nauman A, Nauman J, (Warszawa) Poziom ekspresji czterech genów tarczycowych zlokalizowanych w tym samym odcinku chromosomu 5: ThOX, ThOX, revthox i revthoh wykazuje wzajemną korelację. Dyskusja 48

Endokrynologia Polska / Polish Journal of Endocrinology 003; 4 (54) 0.50-.00 Ambroziak M, Pachucki J, Gereben B, Łuczak J, Nauman J, Nauman A, (Warszawa, Budapeszt) Obecność transkryptu ludzkiego genu dio, zawierającego dodatkowy ekson w części kodującej, prawdopodobnie nie wpływa na aktywność dejodynazy typu II w tarczycy. Dyskusja.00-.0 Pawlaczek A, Kula D, Jarząb M, Gondek Ł, Staszel M, Jurecka-Lubieniecka B, (Gliwice) Związek polimorfizmu promotora genu interleukiny 4 589 C/T z chorobą Gravesa Basedowa. Dyskusja.0-.0 Jurecka-Lubieniecka B, Kula D, Hasse-Lazar K, Stęchły T, Krawczyk A, Szpak S, Jarząb M, Pawlaczek A, Gubała E, (Gliwice) Współudział polimorfizmu TNF i CTLA4 w predyspozycji genetycznej do choroby Gravesa Basedowa. Dyskusja.0-.30 Kula D, Stęchły T, Jurecka-Lubieniecka B, Hasse-Lazar K, Krawczyk A, Szpak S, Jarząb M, Pawlaczek A, Gubała E, (Gliwice) Predyspozycja genetyczna do choroby Hashimoto w populacji polskiej: związek z polimorfizmem genów TNF i CTLA-4. Dyskusja.30-.40 Dedecjus M, Masson D, Lewiński A, Brzeziński J, Gambert Ph, Lagrost L, (Łódź, Dijon) Cząsteczki HDL budowa, rozkład subfrakcji i ładunek elektrostatyczny - w hipotyreozie - wpływ leczenia L-tyroksyną..40-.5 przerwa SESJA.5 3.45 Analiza mutacji genów nadnercza, gonady Przewodniczący: prof. dr hab. med. Barbara Czarnocka (Warszawa) prof. dr hab. med. Jerzy Kosowicz (Poznań) prof. dr hab. med. Wiesław H. Trzeciak (Poznań).5-.45 wykład Monika Lewicka (Heidelberg) Cardiac aldosterone synthesis current concepts. Dyskusja..45-3.5 wykład Tomasz Lehmann, Justyna Biernacka-Łukanty, Jacques Y. Li, Wiesław H. Trzeciak (Poznań) Regulation of transcription of genes involved in steroid hormone synthesis in the adrenal cortex. Dyskusja 3.5-3-5 Lecybyl R, Rubis B, Trzeciak W H, (Poznań) Regulacja ekspresji dehydrogenazy ßhydroxysteroidowej typu II w komórkach nabłonkowych nerki szczura. Dyskusja 3.5-3.35 Ignacak M, Oksza Strzelecki N, Trzeciak WH, (Poznań) Mutacje genu receptora androgenów u chorych z zespołem niewrażliwości na androgeny. Dyskusja 3.35-3.45 Rabska-Pietrzak B, Obara-Moszyńska M, Kędzia A, Korman E, (Poznań) Ocena progresji wzrastania u dzieci leczonych rekombinowanym hgh z powodu somatotropinowej niedoczynności przysadki, współistniejącej z wrodzonym przerostem kory nadnerczy. Dyskusja 3.45-5.00 przerwa - lunch SESJA 3 5.00-6.30 Nowotwory gruczołów dokrewnych Przewodniczący: prof. dr hab. med. Barbara Jarząb (Gliwice) prof. dr hab. med. Alicja Macke-Nauman (Warszawa) prof. dr hab. med. Maciej Gembicki (Poznań) 5.00-5.30 wykład Monika Puzianowska Kuźnicka, Alicja Macke-Nauman, Janusz Nauman, (Warszawa) Potencjalny udział hormonów drobnocząsteczkowych i ich jądrowych receptorów w procesie nowotworzenia. Dyskusja 5.30-5.40 Czarnocka B, Pastuszka D, Łyczkowska A, Lange D, Nikiel B, Goraj-Zając A, Włoch J, (Warszawa, Gliwice) Ekspresja symportera sodowo-jodowego (NIS) i peroksydazy tarczycowej (TPO) w rakach tarczycy rozwiniętych z komórek nabłonkowych tarczycy. Dyskusja 5.40-5.50 Wiench M, Krawczyk A, Lisowska K, Jarząb B,. (Gliwice) Badanie profilu ekspresji genów w raku brodawkowatym tarczycy. Dyskusja 5.50-6.00 Krawczyk A, Handkiewicz-Junak D, Chmielik E, Wiench M, Gubała E, Jarząb B, (Gliwice) Ekspresja genu kodującego kalcytoninę w bioptatach węzłów chłonnych u chorych na raka rdzeniastego tarczycy. Dyskusja 6.00-6.0 Czyż W, Kołomecki K, Pasieka Z, Balcerzak E, Rudowicz M, Jakubiak M, Kuzdak K, Mirowski M, (Łódź) Ocena ekspresji genu HMGI (y) w nowotworach pęcherzykowych tarczycy z zastosowaniem metody RT PCR. Dyskusja 6.0-6.0 Kołomecki K, Stępień H, Czyż W, Stępień T, Kuzdak K, (Łódź) Ocena stężenia czynników adhezyjnych u chorych z guzami nadnercza nieczynnymi hormonalnie (incidentaloma). Dyskusja 6.0-6.30 Słowikowska-Hilczer J, Kula K, (Łódź) Aspekty molekularne przedinwazyjnego raka jądra: badania immunohistochemiczne i hormonalne. Dyskusja 6.30-6.50 przerwa - kawa 49

Materiały III Konferencji Sekcji Endokrynologii Molekularnej PTE SESJA 4 6.50 8.00 Diagnostyka molekularna Przewodniczący: prof. dr hab. med. Jan Komorowski (Łódź) dr hab. med. Katarzyna Łącka (Poznań) 6.50 7.05 Gubała E, Handkiewicz-Junak D, Zeman M, Chmielik E, Wiench M, Wołoszańska K, Jarząb B, (Gliwice) RT-PCR technika molekularna wspierająca wykrywanie wznowy węzłowej raka tarczycy. Dyskusja 7.05-7.0 Pasieka Z, Kuzdak K, Czyż W, Stępień H, Komorowski J, (Łódź) Cytokinowe cząsteczki adhezyjne (svcam-, sicam-) we krwi u chorych z rakiem tarczycy. Dyskusja 7.0-7.35 Krześlak A, Pomorski L, Gaj Z, Lipińska A, (Łódź) Czy glikoproteiny komórkowe mogą być markerem diagnostycznym odróżniającym nowotwory łagodne tarczycy od złośliwych? Dyskusja 7.35-7.45 Łącka K, Kwintkiewicz J, Szarzyńska J, Wiktorowicz K, Majewski K, Gembicki M, (Poznań) Przydatność oznaczeń zawartości DNA w różnicowaniu i prognozowaniu nowotworów tarczycy wywodzących się z komórki pęcherzykowej. Dyskusja 7.45-8.00 Sromek M, Wiśniewska A, Paszko Z, Jagielska A, Skasko E, Czapczak D, Czetwertyńska M, Kozłowicz Gudzińska I, Prokurat A, Łyczek M, Kaniewski M, Stachlewska-Nasfeter E, (Warszawa) Podsumowanie czteroletnich badań nad występowaniem patogennych mutacji w genie RET u chorych na rdzeniastego raka tarczycy. Dyskusja 9.00 Wieczór Towarzyski Sobota - października 00 SESJA 5 8.30-0.30 Etiopatogeneza cukrzycy i otyłości Przewodniczący: prof. dr hab. med. Ida Kinalska (Białystok) prof. dr hab. med. Bogna Wierusz- Wysocka (Poznań) 9.30 9.45 Bogdański P, Jagodziński P, Kujawa A, Pupek-Musialik D, (Poznań) Ocena ekspresji receptora chemokinowego CCR5 u chorych z cukrzycą typu. Dyskusja 9.45-0.00 Siewko K, Szelachowska M, Krętowski A, Stępień A, Kinalska I, (Białystok) Autoimmunologiczne i metaboliczne markery ryzyka rozwoju cukrzycy u krewnych I stopnia chorych na cukrzycę - badanie retrospektywne. Dyskusja 0.00-0.5 Szepietowska B, Szelachowska M, Górska M, Kinalska I, (Białystok) Ocena markerów humoralnej odpowiedzi immunologicznej oraz parametrów biochemicznych u dorosłych pacjentów ze świeżo rozpoznaną cukrzycą. Dyskusja 0.5-0.30 Bogdański P, Pupek-Musialik D, Łącki JK, Łuczak M, Bryl W, Jabłecka A, (Poznań) Ocena stężenia czynnika martwicy guza (TNF) u pacjentów z klinicznymi cechami insulinooporności. Dyskusja 0.30-.30 przerwa - kawa SESJA 6.30-3.30 Czynniki genetyczne niepłodności Osteoporoza Gonady Przewodniczący: prof. dr hab. med A. Warenik Szymankiewicz (Poznań) dr hab. med. Józef Krzysiek (Kraków).30-.00 wykład A. Śpik, A. Wojda, A. Latos- Bieleńska, P. Jędrzejczak, L. Pawelczyk, J. Jaruzelska, (Poznań) Diagnostyka genetyczna niepłodności męskiej. Dyskusja.00-.30 wykład Wanda Horst-Sikorska (Poznań) Genetyczne uwarunkowania gęstości kości. Dyskusja.30-3.00 wykład Alina Warenik-Szymankiewicz (Poznań) Genetyczne uwarunkowania zespołu PCO. Dyskusja 8.30-9.00 wykład Ida Kinalska, Małgorzata Szelachowska, (Białystok) Wybrane zagadnienia immunopatologii cukrzycy. Dyskusja 9.00-9.30 wykład Stanisław Czekalski, Andrzej Oko, Krzysztof Pawlaczyk, Ilona Idasiak- Piechocka, (Poznań) Genetyczne i środowiskowe uwarunkowania nefropatii cukrzycowej. Dyskusja 3.00 3.0 Ociepa M, Warenik-Szymankiewicz A, Trzeciak W H, (Poznań) Warianty splicingowe transkryptu genu receptora pregnanowego X w jajnikach policystycznych. Dyskusja 3.0-3.0 Kocki J, Wołowiec A, Putowski L, Korszeń- Pilecka I, Wojcierowski J, (Lublin) Badania mutacji genu cftr u pacjentów z niepłodnością. Dyskusja 3.0-4.30 przerwa - lunch 430

Endokrynologia Polska / Polish Journal of Endocrinology 003; 4 (54) SESJA 7 4.30-6.00 Zaburzenia dojrzewania i różnicowania płci Przewodniczący: prof. dr hab. med Eugeniusz Korman (Poznań) prof. dr hab. med Krzysztof Kula (Łódź) 4.30-5.00 wykład Krzysztof Kula, J. Słowikowska- Hilczer, (Łódź) Badania kliniczne nad różnicowaniem płci w endokrynologii. Dyskusja 5.00-5.30 wykład Lucjusz Jakubowski (Łódź) Uwarunkowania genetyczne wad rozwojowych narządów płciowych. Dyskusja 5.30 5.40 Wawrzyniak M, Krysińska I, Ruchała M, Wojda A, Łącka K, (Poznań) Aberracje chromosomu X a obecność patologii w obrębie tarczycy u chorych z zespołem Turnera. Dyskusja 5.40-5.50 Kusz K, Szarras-Czapnik M, Warenik- Szymankiewicz A, Latos-Bieleńska A, Jaruzelska J, (Poznań) Poszukiwanie duplikacji regionu DSS powodujących zespół Swyera. Dyskusja 5.50-6.00 Łącka K, Rzepka A, Andrzejewska J, Wojda A, (Poznań) Płodność w zespole Turnera. Dyskusja 6.00 6.30 Zakończenie Konferencji SZANOWNI PAŃSTWO! Odkrycie struktury DNA przez J.D. Watsona i F. Cricka w roku 953 było kluczowym momentem dla rozwoju genetyki. Z kolei szybki rozwój technik biologii molekularnej i inżynierii genetycznej w latach 70-tych i 80-tych, uwieńczony opracowaniem metody szybkiego powielania wybranych fragmentów DNA czyli PCR, błyskawicznie przyspieszył badania nad poznaniem genomu ludzkiego oraz zintensyfikował badania nad etiopatogenezą schorzeń na poziomie molekularnym. Tymczasem określenie defektów molekularno-genetycznych chorób umożliwia ciągłe doskonalenie diagnostyki, w tym diagnostyki prenatalnej, prowadzenie poradnictwa genetycznego z wykrywaniem nosicieli choroby, a także na podjęcie prób terapii genowej. Szczególnie wdzięczną dziedziną dla genetyki i biologii molekularnej jest endokrynologia. Wynika to z faktu, że znakomita większość struktur niezbędnych dla prawidłowego funkcjonowania gruczołów dokrewnych wykazuje strukturę białkową, a tym samym jest zakodowana w genach. Zainteresowania endokrynologów wykorzystaniem metod biologii molekularnej datują się od lat 70-tych, kiedy to uzyskano za pomocą inżynierii genetycznej syntetyczną somatostatynę (977) i insulinę (979). W chwili obecnej nie ma takiej choroby endokrynnej, w etiopatogenezie której nie byłyby zaangażowane zmiany molekularne na poziomie DNA i RNA. Notuje się olbrzymi postęp w diagnostyce molekularnej endokrynopatii, a także produkcji rekombinowanych hormonów dla celów diagnostycznych i leczniczych. Doceniając potrzebę rozwoju endokrynologii molekularnej i genetyki w Polsce, decyzją Zarządu Głównego PTE, w roku 997 została powołana Sekcja Endokrynologii Molekularnej. Już w następnym roku odbyła się I Konferencja Sekcji, a następnie, w odstępach dwuletnich, kolejno II i III Konferencja (998, 000, 00). Dotychczasowymi tematami przewodnimi naszych spotkań były: molekularno-genetyczne aspekty etiopatogenezy chorób tarczycy, nadnerczy, gonad, układu podwzgórzowo-przysadkowego, zaburzeń dojrzewania płciowego, dysgenezji gonad, osteoporozy, cukrzycy, otyłości, nadciśnienia tętniczego, a także zespoły wielogruczołowe i nowotwory gruczołów dokrewnych. Ponadto wiele sesji było poświęconych diagnostyce molekularnej oraz leczeniu rekombinowanymi hormonami chorób gruczołów dokrewnych. W naszym kraju istnieje kilkanaście bardzo prężnych ośrodków zajmujących się endokrynologią molekularną, co znalazło swój wyraz w programach naszych spotkań. Wszystkie one obejmowały zarówno wykłady plenarne o bardzo różnorodnej tematyce z dziedziny endokrynologii molekularnej jak i prace oryginalne cenzurowane każdorazowo przez Komitet Naukowy. Spośród wykładowców gościliśmy m. in. z kraju: prof. S. Czekalskiego, prof. B. Jarząb, prof. I. Kinalską, prof. J. Kosowicza, prof. K. Kulę, prof. A. Lewińskiego, prof. A. Midro, prof. A. Nauman, prof. M. Pawlikowskiego, prof. D. Pupek-Musialik, prof. T. Romera, prof. WH. Trzeciaka, prof. A. Warenik-Szymankiewicz, doc. T. Ferenca, doc. L. Jakubowskiego, doc. J. Jaruzelską, doc. Z. Krawczyka, doc. K. Łącką, doc. M. Niedzielę, doc. M. Puzianowską- Kuźnicką, a z zagranicy: prof. R. Bernhardta, prof. I. Huhtaniemi, prof. M. Lewicką, prof. JI. Masona. III konferencja naszej sekcji została włączona do grupy kursów zalecanych dla specjalistów i osób specjalizujących się w dziedzinie endokrynologii, a posiadanie Certyfikatu Uczestnictwa uprawnia do uzyskania 0 punktów edukacyjnych przez Naczelną Izbę Lekarską. W trakcie ostatniej konferencji w obecności Wojewody Wielkopolskiego Pana Andrzeja Nowakowskiego, JM Rektora AM w Poznaniu prof. Grzegorza Bręborowicza oraz Prezesa Polskiego Towarzystwa Endokrynologicznego prof. Stefana Zgliczyńskiego nastąpiło uroczyste wręczenie Krzyża Komandorskiego panu profesorowi Jerzemu Kosowiczowi oraz Dyplomu Honorowego Członka Polskiego Towarzystwa Endokrynologicznego panu profesorowi Januszowi Naumanowi. 43

Materiały III Konferencji Sekcji Endokrynologii Molekularnej PTE Wręczenie Krzyża Komandorskiego panu profesorowi Jerzemu Kosowiczowi Serdecznie dziękuję Zarządowi Głównemu Polskiego Towarzystwa Endokrynologicznego, Komitetowi Naukowemu i Organizacyjnemu, Sponsorom i Firmom za wydatną pomoc w organizacji naszych konferencji i wyrażam głęboką nadzieję, że będą one nadal kontynuowane. Oddając do rąk Czytelników Endokrynologii Polskiej materiały z III Konferencji Sekcji Endokrynologii Molekularnej Polskiego Towarzystwa Endokrynologicznego zapraszam Wszystkich Państwa do wzięcia udziału w kolejnym, czwartym, spotkaniu naszej Sekcji jesienią 004 roku. Z pozdrowieniami Katarzyna ŁĄCKA Przewodnicząca Sekcji Endokrynologii Molekularnej Polskiego Towarzystwa Endokrynologicznego Profesor Janusz Nauman odbiera gratulacje Komitet Organizacyjny Konferencji. 43

Endokrynologia Polska / Polish Journal of Endocrinology 003; 4 (54) WYKŁADY Barbara Jarząb, Elżbieta Gubała, Zbigniew Wygoda Molecular imaging of gene expression Department of Nuclear Medicine and Endocrine Oncology Center of Oncology, Maria Skłodowska-Curie Memorial Institute, Gliwice Branch Summary: The human genome project has enabled a more comprehensive understanding of the molecular basis of disease and simultaneously has increased demand for non-invasive measurement of biological processes in living beings on both the cellular and molecular level. Molecular imaging develops in response to this demand and is a rather young discipline that bridges basic and clinical research. Two main directions of its development may be specified. First is imaging of cellular metabolism which has been widened significantly by the introduction of PET. Imaging of molecular signatures of cancer cells, detected by profiling of gene expression, may be in future a very significant task for this type of molecular imaging. The second direction is monitoring of gene therapy, necessary for animal studies but before all indispensable to assess human patients undergoing clinical trials with gene therapy vectors. This type of approaches will be presented in the lecture. The successful application of gene therapy requires stable expression of the introduced gene in target cells. In animals, this has been controlled after isolation of RNA from the targeted tissue. When repeated measurements are needed or human approaches are considered, in vivo imaging becomes necessary. When the transgene product exhibits enzymatic activity, its presence may be validated after administration of a radioactive substrate, traced either with positron tracers or with 3 iodine. Gene therapies with herpes simplex virus thymidine kinase gene (HSV TK) have used this possibility of monitoring. Because direct imaging of expression of many other genes Barbara Jarząb, Elżbieta Gubała, Zbigniew Wygoda is impossible, reporter genes may be applied per analogy to green fluorescence protein, used in animal studies. This is done by co-expressing marker genes, which can be visualized without the need to sacrifice the experimental animal, along with the therapeutic transgenes. HSV TK and other enzyme genes may serve as reporter genes. Type dopamine receptor gene, somatostatin receptor gene and NIS gene also are considered among genes which may serve for this goal. Using such reporter genes for the control of gene therapy has essential advantages for human applications, as commercially available radiotracers with known tissue distribution in humans are applied and PET scanners are not necessary for their detection. Alternate imaging modalities to detect expression of reporter genes include optical or near infra-red optical systems with luciferase as the reporter gene or nuclear magnetic resonance based methods of detection, which have been however analyzed only in animal systems until now. NMR molecular imaging is still less sensitive than PET. There is a gap between the quick development of functional genomics which provides the molecular targets and the demands and expectations of clinical medicine. The development of technologies of non-invasive detection and measurement of the expression of genes of interest may help to fill this gap. To report expression of many genes simultaneously still remains a challenge for further research. Obrazowanie molekularne: nowa metoda badania ekspresji genów Zakład Medycyny Nuklearnej i Endokrynologii Onkologicznej Centrum Onkologii Instytut im. Marii Skłodowskiej Curie, Oddział w Gliwicach Streszczenie: W pracy omówiono zasady obrazowania molekularnego jako metody badania ekspresji genów in vivo. Później omówiono możliwości medycyny nuklearnej w obrazowaniu ekspresji genów, ze szczególnym uwzględnieniem roli PET. Przestawiono możliwości monitorowania terapii genowej tymi metodami, po czym krótko zarysowano perspektywy dalszego rozwoju technik obrazowania molekularnego. Obrazowanie molekularne jest nowym pojęciem, jakie pojawiło się w biologii i medycynie zaledwie kilka lat temu i w najbliższym czasie zawita tak do endokrynologii molekularnej jak i klinicznej. Potrzeba obrazowania in vivo ekspresji genów wynikła przede wszystkim z rozwoju terapii genowej, ale postęp, jaki dokonał się w badaniu ekspresji genów in vitro, nadał tej gałęzi biologii i medycyny molekularnej nowe znaczenie. Obydwa kierunki zastosowań wynikają z potrzeby nieinwazyjnego, przyżyciowego badania ekspresji genów i wymagają tych samych metod, niezależnie od faktu, czy chcemy zbadać ekspresję genu wprowadzonego do komórek w wyniku terapii genowej czy też potrzebujemy charakteryzować zmianę w ekspresji wynikłą z różnych chorób (Ryc.). Nowe metody badania ekspresji genów in vitro Do znanych wszystkim i szeroko stosowanych metod badania ekspresji genów należą metody immunohi- 433

Materiały III Konferencji Sekcji Endokrynologii Molekularnej PTE Ryc. Możliwości obrazowania procesów molekularnych in vivo gen DNA informacja mrna funkcja bia ko struktura Poziom Gen (DNA) mrna Bia ko Funkcja Liczba cz steczek w komórce 00.000.000 b. silne wzmocnienie stochemiczne czy cytofluorymetria, które oceniają ekspresję na poziomie produktu białkowego oraz jakościowa i ilościowa reakcja odwrotnej transkrypcji i łańcuchowej reakcji polimerazy (RT-PCR i QPCR) czy metody hybrydyzacji in situ, oceniające obecność lub ilość informacyjnego RNA. Ostatnio dołączyły do nich metody genomiki funkcjonalnej i proteomiki [-4]. W odróżnieniu od klasycznych metod biologii molekularnej, którymi w jednym doświadczeniu można analizować ekspresję jednego, a najwyżej kilku genów, metody te oceniają jednocześnie ekspresję wielu nawet tysięcy genów. Jednoczesna analiza obecności większości lub wręcz wszystkich rodzajów informacyjnych RNA w komórce prowadzona jest na mikromacierzach DNA. Mikromacierze DNA (DNA microarrays), zwane również chipami, mikropanelami lub mikroukładami DNA, są zestawami tysięcy zminiaturyzowanych sond, gęsto umieszczonych na powierzchni szkiełka podstawowego. Dzięki ich upakowaniu wystarczy niewielka ilość RNA wyizolowanego z tkanki (zazwyczaj 5-0 µg), żeby przeprowadzić reakcję hybrydyzacji z sondami obecnymi na mikromacierzy. Dokonana hybrydyzacja sygnalizowana jest za pomocą barwników fluorescencyjnych i wymaga odczytu za pomocą skanera laserowego. Sygnał z lasera przetwarzany jest przez specjalne oprogramowanie, tak żeby uzyskana informacja odnosiła się już bezpośrednio do badanych genów. Uzyskany w ten sposób profil ekspresji może stać się źródłem informacji o nowych genach istotnych dla analizowanego zjawiska fizjologicznego czy chorobowego czy reakcji na stosowane leki, może być także użyteczny w diagnostyce chorób, gdyż dostarcza informacji nie tyle o poszczególnych markerach, co o całych zestawach genów markerowych, określanej jako profil molekularny danej tkanki. W piśmiennictwie anglosaskim szczególnie często używa się w tym kontekście określenia molecular signature, co przekłada się bezpośrednio na język polski jako podpis molekularny lub piętno molekularne danej tkanki [5, 6]. Szczególnie często stosuje się obecnie tę metodę w badaniach z zakresu onkologii, gdyż pozwala ona na trafniejszą klasyfikację nowotworów w stosunku do metod używanych dotychczas, a jednocześnie umożliwia typowanie nowych celów molekularnych dla terapii [, 6, 7, 8]. Coraz większe zastosowanie znajduje ona także w endokrynologii, na razie głównie w badaniach podstawowych, gdyż w ten 0-000 sposób można analizować, jak zmienia się ekspresja genów w komórce czy tkance pod wpływem działania hormonów. Można się spodziewać, że badania te przyspieszą przede wszystkim nasze rozumienie mechanizmu działania tych hormonów, które oddziałują z receptorami pełniącymi funkcję czynników transkrypcyjnych a więc hormonów steroidowych, hormonów tarczycy, kalcidiolu czy retinoidów [9, 0]. Aktywacja czy hamowanie transkrypcji określonego genu i powstawania RNA nie przekłada się w sposób liniowy na ostateczną ilość produktu białkowego. Dlatego badaniom obecności cząsteczek informacyjnych RNA w komórce muszą towarzyszyć badania obecności kodowanych przez nie białek. Możliwe są dwa podejścia do jednoczesnego badania ekspresji wielu białek w danym typie tkanek. Jedno z nich zakłada, że przyspieszamy analizę poprzez ułożenie na jednym szkiełku podstawowym wielu różnych skrawków, pochodzących od różnych chorych. Na przykład, jeżeli chcemy sprawdzić, czy zwiększonej ekspresji mrna dla wytypowanych przez nas genów w raku brodawkowatym tarczycy towarzyszy zwiększona ekspresja białek, możemy posłużyć się mikromacierzami tkankowymi raka tarczycy (tissue microarrays) []. Przygotowuje się je poprzez ułożeniu w jednym bloku parafinowym długich walcowatych wycinków z wielu raków brodawkowatych. Każdy z tych walców ma średnicę mniejszą od mm, więc na jednym szkiełku podstawowym zmieści się ich kilkadziesiąt, jeżeli tak powstały blok będziemy kroić poprzecznie na mikrotomie. Nałożenie na tak powstałą mikromacierz tkankową odczynu immunohistochemicznego umożliwia zminimalizowanie ilości przeciwciała i czasu potrzebnego do badania ekspresji jednego antygenu w wielu próbkach tkankowych jednocześnie. Wobec tego, dysponując panelem przeciwciał, możemy szybko uzyskać informację o ekspresji interesujących nas antygenów w wielu rakach. Inne, bardzo szerokie możliwości konfrontowania wyników uzyskanych przez badanie profilu ekspresji uzyskuje się dzięki metodom proteomicznym. Proteomika jest de facto działem genomiki funkcjonalnej. Jednoczesna analiza obecności wielu białek jest prowadzona metodami dwuwymiarowej elektroforezy ale wówczas można rozróżnić najwyżej kilkaset białek - lub metodami spektrometrii masowej (np. MALDI- TOF) [], której możliwości są znacznie większe. Można się spodziewać, że w przyszłości opracowanie rutynowych metod proteomicznych zaowocuje licznymi zastosowaniami diagnostycznymi, na razie jednak techniki te znajdują się w fazie rozwoju i są mniej zaawansowane, jeśli chodzi o wprowadzenie ich do badań stosowanych, niż mikromacierze DNA czy mikromacierze tkankowe. Obrazowanie molekularne jako badanie ekspresji genu in vivo Obrazowanie molekularne oznacza uwidocznienie rozkładu obecności markera ekspresji danego genu w badanym organizmie [3]. Najłatwiej zastosować w tym celu metody medycyny nuklearnej (Ryc. ) [4]. 434

Endokrynologia Polska / Polish Journal of Endocrinology 003; 4 (54) Ryc. Obrazowanie funkcjonalne metodami medycyny nuklearnej Scyntygrafia zawsze była traktowana jako obrazowanie funkcji, a nie struktury narządu. Najstarsze ze znanych badań scyntygraficznych, jakim jest scyntygrafia tarczycy, opiera się na wybiórczym wychwycie jodu przez komórki pęcherzykowe gruczołu tarczowego. Jeżeli uświadomimy sobie, że jodochwytność wynika z obecności symportera sodowo-jodkowego (NIS) w błonie komórki tarczycowej, łatwo jest przełożyć badany proces na język współczesnej biologii molekularnej: scyntygrafia tarczycy jest możliwa tylko wtedy, gdy dochodzi do ekspresji genu NIS [5]. Oczywiście, każdy endokrynolog doda, że przecież obok ekspresji genu NIS konieczne są inne warunki, (np. enzymy organifikacji jodu), ale jeżeli spojrzymy na scyntygrafię klatki piersiowej u chorego na raka tarczycy, u którego doszło do przerzutów do płuc, przełożenie na język molekularny staje się bardziej oczywiste: albo komórki raka wykazują ekspresję NIS i można je uwidocznić przez podanie izotopu promieniotwórczego jodu (Ryc. 3), albo nie ma ekspresji NIS i nie stwierdza się jodochwytności przerzutów. Wykazanie ekspresji NIS in vivo ma w raku tarczycy bezpośrednie przełożenie terapeutyczne, gdyż pozwala na lecznicze zastosowanie dużych dawek jodu promieniotwórczego. stwierdzamy w TK guz nadnercza i w ramach dalszej diagnostyki decydujemy się podać MIBG (meta-jodobenzylgwanidynę) znakowaną jodem promieniotwórczym, to de facto badamy, czy w guzie tym znajduje się błonowy transporter dla katecholamin. MIBG, jako związek o zbliżonej budowie, jest wówczas wychwytywana przez komórki guza. Wnioskowanie pośrednie pozwala nam rozpoznać guza chromochłonnego nadnerczy, ale gdyby guz znajdował się w innym umiejscowieniu, nie moglibyśmy jednoznacznie na tej podstawie różnicować, czy mamy do czynienia z pozanadnerczowym guzem chromochłonnym, rakowiakiem czy przerzutem raka rdzeniastego tarczycy, żeby wymienić tylko niektóre przykłady nowotworów narządów wydzielania wewnętrznego, które charakteryzują się ekspresją transportera katecholamin. Immunoscyntygrafie, w których obrazuje się cechy molekularne przez detekcję znakowanymi przeciwciałami, także można zaliczyć do obrazowania molekularnego (Ryc.4). Inny dobry przykład zastosowania scyntygrafii do badania ekspresji in vivo to scyntygrafia receptorowa przy zastosowaniu analogów somatostatyny, głównie oktreotydu znakowanego indem promieniotwórczym (oktreoskan) [6]. Możemy w ten sposób wykryć na przykład przerzuty złośliwego wyspiaka trzustki, czy znaleźć małe ognisko rakowiaka. W jednym i drugim przypadku wnioskujemy pośrednio, bo bezpośrednim celem badania jest wykrycie ekspresji receptora dla somatostatyny typu w guzie (sstr). Nie zawsze ma ono znaczenie czysto diagnostyczne, jak w tym przypadku. Jeżeli u chorego z orbitopatią tarczycową scyntygrafia receptorowa wykaże obecność sstr w tkankach oczodołu, informacja ta będzie miała znaczenie predykcyjne ponieważ dodatnia scyntygrafia receptorowa świadczy o aktywnej fazie zapalenia tworzy wskazania do podjęcia leczenia glikosteroidami. Ryc. 4 Możliwości obrazowania ekspresji genów poprzez scyntygrafię SPECT lub PET Ryc. 3 Scyntygrafia jodowa jako obrazowanie molekularne ekspresji genu NIS Immunoscyntygrafia (SPECT) ANTYGEN przeciwcia o DNA TRANSPORTER EKSPRESJA : ENZYM Scyntygrafia 3 I, 3 I (SPECT) ligand RECEPTOR substrat produkt Scyntygrafia receptorowa (SPECT) PET :000 Czy w endokrynologii można znaleźć inne przykłady obrazowania molekularnego za pomocą scyntygrafii? Oczywiście tak. Na przykład, jeżeli W onkologii wykazanie receptorów somatostatyny na błonach komórkowych guza nowotworowego bez względu na znaczenie tego faktu dla czynności komórki nowotworowej, tworzy możliwość celowanej terapii przez zastosowanie oktreotydu czy innego analogu somatostatyny sprzężonego z leczniczymi dawkami izotopu promieniotwórczego, emitującego 435

Materiały III Konferencji Sekcji Endokrynologii Molekularnej PTE promieniowanie jonizujące beta o działaniu kancerobójczym, na przykład itru 90 czy galu 67 [7]. W ten sposób zaczynamy leczyć nie tylko guzy neuroendokrynne, ale i inne nowotwory, które mogą charakteryzować się ekspresją receptora dla somatostatyny, na przykład rozsianego raka piersi czy zaawansowanego chłoniaka, w którym zawiodły inne metody leczenia. Także sprzęganie swoistych przeciwciał ze znacznikami izotopowymi służy obrazowaniu molekularnemu ekspresji tych antygenów, przeciwko którym skierowane są przeciwciała (Ryc. 5), a potem w konsekwencji ich celowanej terapii. Ryc. 5 Obrazowanie ekspresji genu w komórkach guza może prowadzić do nowego typu terapii - immunoscyntygrafia antygenów nowotworowych anty-cea - scyntygrafia receptorowa: analogi somatostatyny Octreoscan terapia raka rdzeniastego tarczycy przeciwcia ami 90 Y-anty CEA terapia guzów neuroendokrynnych znakowanymi analogami somatostatyny 90 Y-DOTATOC Niestety, klasyczne znaczniki scyntygraficzne rozpoznają tylko nieliczne ligandy komórkowe, stąd badanie ekspresji większości genów jest w ten sposób niemożliwe. Dlatego też przełom w obrazowaniu molekularnym wiąże się w medycynie nuklearnej z wprowadzeniem badań PET. Obrazowanie molekularne w pozytronowej tomografii emisyjnej Pozytronowa tomografia emisyjna (PET) zrewolucjonizowała metody badania procesów molekularnych in vivo [8]. Jest to możliwe przede wszystkim dzięki temu, że izotopy emitujące pozytony (czyli cząstki beta naładowane dodatnio) można znaleźć także wśród izotopów pierwiastków budujących podstawowe związki organiczne. I tak dysponujemy izotopem węgla C-, tlenu O-5, azotu N-3. Jeżeli wprowadzimy te izotopy do związków normalnie użytkowanych w naszym organizmie, takich jak aminokwasy, nukleotydy itp., możemy in vivo obrazować przemiany metaboliczne zachodzące w naszym ustroju. Ponieważ znaczniki są często substratami dla enzymów ulegających ekspresji w komórce, dzięki ich aktywności katalitycznej uzyskujemy znaczne wzmocnienie sygnału (Ryc.4). Do tego, fizyczne własności emitowanego promieniowania sprawiają, że skaner PET pozwala na znacznie czulsze i bardziej rozdzielcze obrazowanie nawet niewielkich ognisk gromadzenia w porównaniu do klasycznej gamma-kamery. Za jego pomocą można obrazować ogniska o średnicy około 5 mm. Jakkolwiek rozdzielczość tomografii komputerowej czy rezonansu magnetycznego jest nawet wyższa, to w praktyce rozpoznawanie zmian o średnicy kilku mm jest w tych klasycznych technikach obrazowania bardzo trudne na przykład nie można wówczas na podstawie cech anatomicznych różnicować między prawidłowym a przerzutowym węzłem chłonnym. Zastosowanie PET i znacznika swoistego dla komórki nowotworowej ma tu wówczas znaczenie decydujące. Przełomowe znaczenie dla badań PET miało wprowadzenie jako znacznika deoksyglukozy znakowanej fluorem-8 (FDG) [9]. Fluor-8, jako chlorowiec, łatwo wchodzi do związków organicznych w miejsce atomu wodoru i nie zmienia w sposób istotny własności molekuł. Jednocześnie jego półokres trwania wynosi około godziny, jest więc dłuższy niż dla wielu istotnych znaczników pozytonowych. FDG, jako analog glukozy, jest transportowana do większości komórek i rozpoznawana przez heksokinazę, enzym przeprowadzający glukozę do jej fosforanu w pierwszym etapie glikolizy (Ryc. 6). Proces ten jest szczególnie wydajny w komórkach nowotworowych, które traktują beztlenową glikolizę jako podstawowe źródło energii. W przystosowaniu do swojego wysokiego zapotrzebowania na energię wykazują one wysoką ekspresję zarówno transporterów glukozy w błonie komórkowej jak i heksokinazy wewnątrz komórki. Dla obrazowania komórki nowotworowej konieczny jest mechanizm pułapki molekularnej, która pojawia się już na następnym etapie: fosforan deoksyglukozy (a więc również FDG-P) nie jest przeprowadzany do kolejnych etapów glikolizy, nie może również dyfundować na zewnątrz komórki ani ulegać defosforylacji do FDG. W szybkim czasie gromadzi się więc w komórkach nowotworowych w znacznie większej ilości niż w otaczających komórkach zdrowych i ujawnia się na scyntygramie. Mimo, że obrazowanie molekularne dotyczy tu bardzo pospolitego procesu metabolicznego, aktywnego w większości tkanek, różnice w ekspresji transporterów glukozy i heksokinazy między tkanką zdrową a tkanką nowotworową ułatwiają swoiste obrazowanie tej ostatniej, co więcej, pozwalają na monitorowanie żywotności komórek. Ryc. 6 Medycyna nuklearna w onkologii: 8 FDG-PET 8 F-deoksyglukoza 8 FDG odzwierciedla intensywno glikolizy w guzie glukoza Mi sak uda z przerzutami do p uc i ródpiersia heksokinaza glukozo-6-fosfataza pu apka molekularna 8 F-deoksyglukozo-6-P Glukozo-6-P glikoliza energia cykl Krebsa Scyntygrafia FDG-PET staje się powoli niezbędna w rozpoznaniu wielu nowotworów [4]. Siła obrazowania molekularnego w badaniach PET wychodzi jednak daleko poza stosowanie FDG. W tabeli przedstawiono szereg znaczników pozytonowych i procesy molekularne, które można w ten sposób obrazować. Obrazowanie rozkładu receptorów estrogenowych w komórkach raka piersi i jego przerzutów za pomocą estradiolu znakowanego fluorem 8 jest bezpośrednim 436

Endokrynologia Polska / Polish Journal of Endocrinology 003; 4 (54) badaniem ekspresji tych białek in vivo o potencjalnym wielkim znaczeniu dla wyboru optymalnej terapii raka piersi. Trudno przecenić przyszłe zastosowanie markerów hipoksji guza, apoptozy czy oporności wielolekowej [0,, ]. Trzeba jednak zaznaczyć, że wymienione w tabeli znaczniki znajdują się w fazie badań i jeszcze nie zostały wprowadzone do praktyki klinicznej. Inne metody obrazowania molekularnego Spośród metod obrazowania diagnostycznego, stosowanych obecnie w medycynie, największe nadzieje wiąże się z rezonansem magnetycznym, ze względu na doskonałą czułość i rozdzielczość uzyskiwanych w ten sposób obrazów [3]. Klasyczne badanie MR dostarcza jednak głównie informacji anatomicznej, obrazowanie funkcjonalne, a tym bardziej obrazowanie molekularne za pomocą MR znajduje się dopiero w fazie rozwoju. Jeden z kierunków rozwijanych dla uzyskania informacji o znaczeniu funkcjonalnym zakłada spektroskopię rezonansu magnetycznego. Najwcześniej rozwinęła się spektroskopia protonów, ostatnio coraz szerzej wprowadza się spektroskopię jąder fosforu. Dla obrazowania molekularnego większe znaczenie będzie miało jednak wprowadzenie specjalnych znaczników, na przykład nanocząstek żelaza, którymi będzie się znakować przeciwciała czy inne związki organiczne. Jakkolwiek prowadzi się obecnie wiele badań nad takimi zastosowaniami MR, w praktyce czułość MR w obrazowaniu molekularnym jest o 4-6 rzędów wielkości niższa niż czułość PET i stąd kliniczne zastosowanie obrazowania molekularnego jest o wiele bliższe realizacji w tej ostatniej technice, mimo że wymaga specjalnego skanera i cyklotronu dla produkcji krótkożyciowych izotopów pozytonowych (podczas gdy dostępność badań MR w klinice jest oczywiście o wiele większa). W badaniach na zwierzętach wykorzystuje się także szereg metod optycznych, wykorzystujących bądź zjawisko fluorescencji bądź luminescencji [4]. Te metody nie mogą na dzisiejszym etapie rozwoju techniki znaleźć zastosowania u ludzi, gdyż grubość ich tkanek jest zbyt duża. U małych zwierząt doświadczalnych barwnik fluorescencyjny będzie przeświecał przez cienkie powłoki, możliwe też jest wzbudzenie tej fluorescencji w tkankach przez działanie źródłem światła ultrafioletowego z zewnątrz. Takie obrazowanie jest szczególnie często potrzebne dla sprawdzania ekspresji genów u zwierząt transgenicznych a więc zwierząt, u których metodami inżynierii genetycznej wprowadziliśmy dodatkowy nowy gen i chcemy sprawdzić, czy ulega on wydajnej ekspresji. Jeżeli pod tym samym promotorem wprowadzimy gen kodujący barwnik fluorescencyjny (na przykład zielone białko fluorescencyjne, GFP), to pojawienie się zielonego świecenia we wszystkich tkankach myszy transgenicznej lub tylko w wybranych narządach przy bardziej wybiórczych metodach transgenezy (np. metoda CrE-Loc) będzie dowodem, że również drugi gen, którego wprowadzeniem jesteśmy zainteresowani, ale którego ekspresji nie możemy obrazować, odczytywany jest w sposób wydajny. Gen GFP pełni więc w tym przypadku funkcję genu reporterowego. Podobne znaczenie mogą mieć geny zapisujące białka pobudzające bioluminescencję, na przykład gen lucyferazy enzymu, którego produktem jest barwnik luminescencyjny (czyli świecący bez potrzeby wzbudzania, jak to ma miejsce przy fluorescencji). Obrazowanie molekularne terapii genowej Terapia genowa, która polega na wprowadzaniu brakujących lub dodatkowych genów do komórek (Ryc.7), dzięki czemu zmieniamy ich właściwości przywracamy im brakującą funkcję albo stymulujemy nowa funkcję, jest przedmiotem ogromnych oczekiwań ze strony wszystkich specjalności medycznych. W endokrynologii myślimy przede wszystkim o uzupełnieniu produkcji hormonów białkowych i o efektach przeciwnowotworowych, żeby wymienić tylko próby terapii genowej cukrzycy czy terapii agresywnych raków tarczycy raka anaplastycznego czy raka rdzeniastego. Niemniej, oczekiwania jakie wiążemy od co najmniej 0 lat z wprowadzeniem terapii genowej, nie wypełniły się dotąd i rutynowych protokołów opracowano niewiele, a w endokrynologii jeszcze żadnego. Wynika to między innymi z niewielkiej wydajności transfekcji albo nietrwałości ekspresji wprowadzonego genu. Dlatego niezwykle ważnym elementem dalszych prac nad terapią genową staje się wprowadzenie skutecznych, nieinwazyjnych metod badania ekspresji genów in vivo, co dostarczyło silnego impulsu dla rozwoju obrazowania molekularnego [5]. Ryc. 7 Schemat terapii genowej gen komórki pakuj ce in ynieria genetyczna wektor (plazmid) transfekcja transfekcja retrowirusy, adenowirusy komórka docelowa nowy gen transdukcja wirus pozbawiony zdolno ci do replikacji Jak obrazować skuteczność terapii genowej? Przeanalizujmy to na przykładzie kinazy tymidynowej wirusa opryszczki zwykłej (HSVTK), jednego z genów najczęściej używanych w terapii genowej nowotworów (Ryc. 8). Ta kinaza, w przeciwieństwie do endogennej kinazy tymidynowej ssaków, charakteryzuje się nieco szerszym powinowactwem substratowym fosforyluje nie tylko tymidynę, ale również zbliżone nukleozydy, w tym gancyklowir, zamieniając go w silny środek genotoksyczny. Jeżeli więc gen HSVTK wprowadzimy do komórek guza, a następnie podamy 437

Materiały III Konferencji Sekcji Endokrynologii Molekularnej PTE Ryc. 8 Obrazowanie molekularne terapii genowej na przykładzie genu kinazy tyrozynowej ( gen samobójczy ) Perspektywy obrazowania molekularnego komórki nowotworowe poddane terapii genowej HSV-TK Terapia genem samobójczym substrat leku (gancyklowir) gen enzym mier komórki nowotworowej bystander effect mier komórki prawid owej komórki prawid owe nie zawieraj HSV-TK choremu gancyklowir, to dla innych komórek ciała będzie on środkiem nietoksycznym, gdyż nie będzie ulegał fosforylacji. Jedynie w tych komórkach guza, w których doszło do wydajnej tra nsfekcji, będzie zachodziła reakcja uczynniania cytostatyku i te komórki zostaną śmiertelnie zagrożone. Niestety, możemy liczyć się też z tak zwanym efektem sąsiedztwa (bystander effect) z jednej strony gen może przejść także do zdrowych komórek z sąsiedztwa guza, z drugiej strony może dojść do przenikania uczynnionego cytostatyku (Ryc. 8). Jeżeli po przeprowadzeniu terapii genowej podamy najpierw znakowany analog gancyklowiru (dysponujemy zarówno znacznikiem pozytonowym, jak i klasycznym znacznikiem gamma), to wykonując scyntygrafię możemy uwidocznić zarówno pożądaną ekspresję genu w komórkach nowotworowych i przy okazji przynajmniej półilościowo ocenić jej nasilenie jak i ekspresję niepożądaną, zachodzącą w komórkach zdrowych [6]. Znacznie częstsza, i trudniejsza jest sytuacja, w której wprowadzany gen wcale nie jest enzymem albo nie ma możliwości uwidocznienia powstającego produktu reakcji. Wówczas można zastosować wspomniany powyżej model genu reporterowego. Doświadczalnie wykorzystuje się wówczas najczęściej również gen HSVTK, wyprowadzając go pod wspólnym promotorem z genem docelowym. Ostatnio rozważa się również gen symportera sodowo-jodkowego jako gen reporterowy, ze względu na znaczną prostotę i dostępność wymaganych radiofarmaceutyków jodu lub technetu promieniotwórczego [5]. W przyszłych badaniach u ludzi myśli się również w tym kontekście o genie receptora somatostatynowego sstr, gdyż ligandy receptora są już dopuszczonymi na rynku radiofarmaceutykami, co w badaniach na ludziach ma duże znaczenie [7]. W badaniach zwierzęcych wykorzystuje się też gen receptora dopaminowego, ze względu na bardzo wysoką swoistość tego obrazowania z gromadzeniem fizjologicznym mamy do czynienia wyłącznie w mózgu. Co więcej, przy wieloetapowej terapii genowej można na każdym etapie stosować inny gen reporterowy, co ułatwia kontrolę nad jej przebiegiem. Terapia genem samobójczym mo e by monitorowana bezpo rednio znakowany analog leku 8 FMBG 3 IVFRU 3 IFIRU u apka metaboliczna) b stander effect Ogromne zainteresowanie metodami obrazowania molekularnego, jakie notujemy ostatnio zarówno w badaniach doświadczalnych jak i w klinice, wynika z wielkich możliwości poszerzenia spektrum badań diagnostycznych, lepszego zrozumienia patofizjologii chorób dotychczas nieuleczalnych i perspektywy stosowania tych metod w rozwoju terapii celowanej ( targeted therapy ). Można się spodziewać, że w najbliższych latach klinicznie użyteczne obrazowanie molekularne będzie prowadzone przede wszystkim metodami medycyny nuklearnej, zarówno przez badania SPECT jak i PET. W porównaniu do klasycznych metod obrazowania, dających przede wszystkim informację anatomiczną (Ryc. 9), rozszerzy to nasz horyzont o badania funkcjonalne na poziomie molekularnym. W przyszłości można się spodziewać, że także za pomocą rezonansu magnetycznego będziemy mogli obrazować ekspresję określonych białek i śledzić wybrane procesy molekularne. Ryc. 9 Obrazowanie może odbywać się na różnych poziomach informacyjnych informacja Technika CT US MRI Nuklearna Optyczne Nanosensorowa anatomiczna fizjologiczna metaboliczna molekularna Metody optyczne pozostają dzisiaj w kręgu zainteresowań medycyny doświadczalnej, gdyż możliwe są tylko w stosunku do małych zwierząt. Ich rozwój wynika dzisiaj również faktu, że tomografy komputerowe czy skanery PET optymalizowane są do badań na ludziach i nie można za pomocą zwykłych obrazów uzyskiwać obrazów małych zwierząt. Stąd wynika albo potrzeba budowy specjalnych aparatów TK i PET dla myszy i takie aparaty zresztą już powstają [8] albo konieczność szukania innych metod obrazowania. Dlatego obrazowanie terapii genowej, która dziś odbywa się jeszcze na ogół na modelu zwierzęcym, dokonywane jest często poprzez geny reporterowe dla produktów wykazujących zdolność fluorescencji czy luminescencji. Można się jednak spodziewać, że także w medycynie rozwój nowych technik obrazowania molekularnego nie ograniczy się tylko do techniki PET, SPECT czy MR. 438

Endokrynologia Polska / Polish Journal of Endocrinology 003; 4 (54) Obrazowanie molekularne odnosi się na razie do jednego lub najwyżej -3 genów jednocześnie. Rozwój wysokowydajnych metod genomiki stwarza pytanie o obrazowanie profilu ekspresji genów. In vivo jest to na razie nie możliwe, ale podejmuje się już pierwsze próby trójwymiarowej wizualizacji danych uzyskanych in vitro [9]. Piśmiennictwo:. Golub TR, Slonim DK, Tamayo P et al. Molecular Classification of Cancer: Class Discovery and Class Prediction by Gene Expression Monitoring. Science 999; 86: 53-537. Marx J. DNA arrays reveal cancer in its many forms. Science 000; 89: 670-67 3. Blohm DH, Guiseppi-Elie A. New developments in microarray technology Current Opinion in Biotechnology 00; : 4-47 4. Jarząb B, Włoch J, Gubała E. DNA microarrays in oncology description of a new tool. Annals Diag Paediatric Pathol 003; 7: -7 5. Dhanasekaran SM, Barrette TR, Ghosh D, Shah R, Varambally S, Kurachi K, Pienta KJ, Rubin MA, Chinnaiyan AM. Delineation of prognostic biomarkers in prostate cancer. Nature 00; 4: 8-86 6. Van t Veer LJ, De Jong D. The microarray way to tailored cancer treatment. Nat Med 00; 8: 68-74 7. Vant t Veer LJ, Dai H, van de Vijver MJ et al. Gene expression profiling predicts clinical outcome of breast cancer. Nature 00; 45: 530-6 8. Monni O, Hyman E, Mousses S et al. From chromosomal alterations to target genes for therapy: integrating cytogenetic and functional genomic views of the breast cancer genome. Cancer Biol 00; : 395-40 9. Gruvberger S, Ringnér M, Cehn Y et al. Estrogen receptor status in breast cancer is associated with remarkably distinct gene expression patterns. Can Res 00; 5: 5979-5984 0. Weitzel JM, Radtke C, Seitz HJ. Two thyroid hormonemediated gee expression patterns in vivo identified by cdna expression arrays in rat. Nucl Acid Res 00; 9:548-555. DNA Microarrays. A molecular cloning manual. Bowtell D, Sambrook J (eds.) 003 Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York. Celis JE, Kruhöffer M, Gromova I et al. Gene expression profiling: monitoring transcription and translation products using DNA microarrays and proteomics. FEBS Lett 000; 480: -6 3. Lok C. Picture perfect. Nature 00; 4(6845): 37-374 4. Bishof DA. Progress in the diagnosis and treatment of disease by nuclear medicine and molecular imaging: highlights of the European Association of Nuclear Medicine Congress, Naples 00. Eur J Nucl Med Mol Imaging 00; 9: 39-59 5. Dohan O, De L, Paroder V, Riedel C, Artani M, reed M et al. The sodium/iodide symporter (NIS): characterization, regulation, and medical significance. Endocr Rev 003; 4: 48-77 6. Ugur O, Kothari PJ, Finn RD, Zanzonico P, Ruan S, Guenther I et al. Ga-66 labeled somatostatin analogue DOTA-Dphe- Tyr3-octreotide as a potential agent for positron emission tomography imaging and receptor mediated internal radiotherapy of somatostatin receptor positive tumors. Nucl Med Biol 00; 9: 47-57 7. Froidevaux S, Erlebe AN, Christe M, Sumanovski L, Heppeler A, Shmitt JS et al. Neuroendocrine tumor targeting: study of novel gallium-labeled somatostatin radiopeptides in a rat pancreatic tumor model. Int J Cancer 00; 98(6): 930-937 8. Czernin J, Phelps ME. Positron emission tomography scanning: current and future applications. Annu Rev Med 00; 53: 89-9. Brady F, Luthra SK, Brown GD, Osman S, Aboagye E, Seleem A et al. Radiolabelled tracers and anticancer drugs for assessment of therapeutic efficacy using PET. Curr Pharm Des 00; 7: 863-89 0. Chapman JD, Schneider RF, Urbain JL, Hanks GE. Singlephoton emission computed tomography and positronemission tomography assays for tissue oxygenation. Semin Radiat Oncol 00; : 47-57. Engelhardt EL, Schneider RF, Sheeholzer SH, Stobbe CC, Chapman JD. The synthesis and radiolabeling of - nitroimidazole derivatives of cyclams and their preclinical evaluation as positive markers of tumor hypoxia. J Nucl Med 00; 43: 837-850. Mier W, Haberkorn U, Eisenhut M. [8F] FLT; portrait of a proliferation marker. Eur J Nucl Med Mol Imaging 00; 9: 65-69 3. Hogemann D, Basilion JP. Seeing inside the body : MR imaging of gene expression. Eur J Nucl Med Mol Imaging 00; 9: 400-408 4. Weissleder R. Scaling down imaging: molecular mapping of cancer in mice. Nat Rev Cancer 00; : -8 5. Heberkorn U, Altman A. Imaging methods in gene therapy of cancer. Curr Gene Ther 00; : 63-8 6. Wiebe LI, Knaus EE, Enzyme-targeted, nucleoside-based radiopharmaceuticals for scintigraphic monitoring of gene transfer and expression. Curr Pharm Des 00; 7: 893-906 7. Zinn KR, Chaudhuri TR. the type human somatostatin receptor as a platform for reporter gene imaging. Eur J Nucl Med Mol Imaging 00; 9: 388-399 8. Chatziioannou AF. Molecular imaging of small animals with dedicated PET tomographs. Eur J Nucl Med Mol Imaging 00; 9: 98-4 9. Brown VM, Ossadtchi A, Khan AH et al. High-throughput imaging of brain gene expression. Genome Res 00; : 44-45 439

Materiały III Konferencji Sekcji Endokrynologii Molekularnej PTE Katarzyna Łącka Molecular and clinical aspects of thyroid hormones binding protein defects Department of Endocrinology, Metabolism and Internal Medicine, K. Marcinkowski University of Medical Sciences, Poznań, Poland Summary: Data of thyroid hormones binding protein with special respect to thyroxine binding globulin (TBG) have been presented. Their properties and clinical abnormalities which lead to their disturbances (excess and deficiency) have been described. An attention is drawn to congenital defects of thyroxine binding globulin; describing changes in TBG gene leading to various TBG types. Key words: thyroid hormone protein binding, TBG, congenital defect of TBG, TBG gene mutations, TBG types Katarzyna Łącka Molekularne i kliniczne aspekty zaburzeń białek wiążących hormony tarczycy Katedra Endokrynologii, Przemiany Materii i Chorób Wewnętrznych Akademia Medyczna im. K. Marcinkowskiego w Poznaniu Streszczenie: W pracy przedstawiono informacje na temat białek wiążących hormony tarczycy, ze szczególnym uwzględnieniem globuliny wiążącej tyroksynę (TBG- Thyroxine Binding Globulin). Omówiono właściwości tychże białek i stany kliniczne prowadzące do ich zaburzeń (nadmiaru i niedoboru). Zwrócono uwagę na wrodzone zaburzenia białek wiążących hormony tarczycy; opisując zmiany w genie kodującym TBG a prowadzące do różnych wariantów białka TBG Wstęp Hormony tarczycy w surowicy krwi występują w postaci wolnej, stanowiącej 0,03%-0,05% ogólnej ilości tyroksyny i około 0,3% ogólnej ilości trijodotyroniny oraz w postaci związanej z nośnikami białkowymi (całkowite hormony tarczycy). Białka nośnikowe, syntetyzowane w wątrobie, oprócz funkcji transportującej, stanowią ważny magazyn hormonów tarczycy. Wśród białek wiążących hormony tarczycy (TBP-Thyroxine Binding Protein) wyróżnia się: białko wiążące tyroksynę (TBG-Thyroxine Binding Globulin), prealbuminę oraz albuminę wiążącą hormony tarczycy (odpowiednio: TBPA-Thyroxine Binding Prealbumin oraz TBA-Thyroxine Binding Albumin). Tyroksyna jest związana w 70% z TBG, w 0% z TBPA i w 0% z TBA; natomiast trijodotyronina związana jest w 70-80% z TBG, w 0-0% z TBPA i w minimalnych ilościach z TBA. Globulina wiążąca tyroksynę (TBG) TBG, główne białko wiążące hormony tarczycy, zostało opisane i częściowo scharakteryzowane w roku 95 przez Gordona i wsp. []. Jest to α- globulina o ciężarze cząsteczkowym około 54 000D, produkowana przez komórki wątroby [, 3]. TBG jest glokiproteiną o zawartości węglowodanów około 5%. Pojedynczy łańcuch polipeptydowy składa się z 395 aminokwasów i wykazuje homologię w 55-56% Słowa kluczowe: białka wiążące hormony tarczycy, TBG, wrodzone defekty TBG, mutacje genu TBG, warianty TBG Dr hab. Katarzyna Łącka Katedra Endokrynologii, Przemiany Materii i Chorób Wewnętrznych Akademia Medyczna im. K. Marcinkowskiego Przybyszewskiego 49, 60355 Poznań E-mail: KLacka@wp.pl Tabela. Białka transportujące hormony tarczycy w surowicy krwi. %LDäNR 0DVD F]ñVWHF]NRZD 5R]PLHV]F]HQLH 7 7 *OREXOLQD ZLññFD W\URNV\Qö 7%*7K\UR[LQH %LQGLQJ *OREXOLQ 3UHDOEXPLQD ZLññFD W\URNV\Qö 7%3$7K\UR[LQH %LQGLQJ 3UHDOEXPLQ $OEXPLQD ZLññFD W\URNV\Qö 7%$7K\UR[LQH %LQGLQJ $OEXPLQ QLH]QDF]QH LORFL z globuliną wiążącą kortyzol (CBG, transkortyna), α -antytrypsyną i antychemotrypsyną [4, 5]. Opracowanie radioimmunologicznej metody oznaczania TBG w surowicy przez Refetoffa i wsp. w roku 984 umożliwiło badania tego nośnika hormonów tarczycy w różnych stanach patologicznych oraz określenie ich przydatności w diagnostyce [6]. Stężenie TBG w surowicy przy użyciu metody fluoroimmunometrycznej (FIA; Delphia kits) u osób zdrowych wynosi od 3,6 do 36,6 mg/l. Stężenie TBG w surowicy ulega zmianom pod wpływem hormonów, leków oraz w niektórych chorobach. 440

Endokrynologia Polska / Polish Journal of Endocrinology 003; 4 (54) Tabela. Przyczyny nadmiaru TBG (TBG excess: TBG-E). hiperestrogenizacja (ciąża, antykoncepcja, guzy wydzielające estrogeny). u noworodków 3. wiek podeszły 4. ostre i przewlekłe zapalenia wątroby 5. pierwotna marskość żółciowa wątroby 6. porfiria 7. chłoniaki 8. niektóre leki: klofibrat, estrogeny, metadon 9. heroina 0. genetycznie uwarunkowany nadmiar TBG Tabela 3. Przyczyny niedoboru TBG (TBG deficiency: TBG-D). zespół cushinoidalny. akromegalia 3. marskość wątroby 4. zespół nerczycowy 5. wyniszczenie, niedożywienie 6. leki: glikokortykosteroidy, androgeny (m.in. danazol), L-asparaginaza 7. genetycznie uwarunkowany niedobór TBG Zaburzenia TBG Wyróżnia się trzy typy genetycznie uwarunkowanych zaburzeń TBG. Są to całkowity niedobór TBG (TBG complete deficiency: TBG-CD), częściowy niedobór TBG (TBG partial deficiency: TBG-PD) oraz nadmiar TBG (TBG excess: TBG-E) [7, 8]. Tabela 4 przedstawia krótki rys historyczny badań nad defektami TBG. Tabela 4. Główne etapy badań zaburzeń TBG 95 Gordon et al.[] odkrycie TBG 959 Beierwaltes et Robbins [9] pierwszy opis rodziny ze wzrostem TBG 964 Nicloff et al. [0] pierwszy opis rodziny z niedoborem TBG 966 Nikolai et al. [] powiązanie rodzinnie występującego niedoboru TBG z chromosomem X 967 Nikolai et al. [] powiązanie rodzinnie występującego nadmiaru TBG z chromosomem X 968 Refetoff et Selenkow [3] opis rodzinnie występującego niedoboru TBG u chorej z zespołem Turnera (45,X) Nadmiar TBG. Postać dziedziczna nadmiaru TBG występuje bardzo rzadko, a przekazywana jest potomstwu jest jako cecha związana z chromosomem X. Częstość występowania tego zespołu waha się w szerokich granicach od :6000 w regionie Bermingham w Wielkiej Brytanii do : 40 000 w USA [4, 5, 6]. Klinicznie występuje wole bez zaburzeń czynności tarczycy. Opisywane są przypadki z tarczycą niepowiększoną, a także współistniejącym limfocytarnym zapaleniem tarczycy. U niektórych chorych obserwuje się niski wzrost. W badaniach dodatkowych w surowicy stwierdza się podwyższone stężenie TBG i całkowitych hormonów tarczycy (ct 4 i ct 3 ), obniżony współczynnik wiązania trijodotyroniny oraz prawidłowe stężenie wolnych hormonów tarczycy, indeksu wolnych hormonów, stężenia TSH w warunkach podstawowych i po stymulacji TRH, a także prawidłową jodochwytność tarczycy [7, 8, 7]. Niedobór TBG. Samoistne zmniejszenie stężenie TBG w surowicy lub jego brak jest chorobą uwarunkowaną genetycznie i występuje z częstością :5000 do :3 000 wśród rasy kaukaskiej oraz :00 do :9000 wśród japończyków [4]. Sposób dziedziczenia określa się jako dominujący, związany z chromosomem X. Stąd zupełny brak TBG występuje u mężczyzn-homozygot, natomiast zmniejszona pojemność TBG może się pojawić u kobiet heterozygot. Badanie kliniczne chorych z niedoborem TBG ujawnia wole; wyjątkowo rzadko może występować tarczyca prawidłowej wielkości. U przeważającej części osób stwierdza się prawidłową czynność tarczycy, niekiedy mogą pojawić się objawy hipo- lub hipertyreozy [8]. Badania biochemiczne wykazują obniżenie lub całkowity brak TBG w surowicy, spadek stężenia całkowitych hormonów tarczycy przy podwyższonej wartości indeksu trijodotyroniny oraz prawidłowe stężenie wolnych hormonów tarczycy i TSH. Ponadto stwierdza się brak wzrostu stężenia TBG po podaniu estrogenów i prawidłową reakcję poziomu TSH po podaniu TRH [7, 8, 7]. Spośród zaburzeń białek wiążących hormony tarczycy defekty TBG są najczęstsze. Jednak opisywane są rzadkie przypadki zaburzeń albuminy i Gen TBG Gen kodujący globulinę wiążącą tyroksynę TBG zlokalizowany jest na długim ramieniu chromosomu (Xq-) [9]. Stąd pełna ekspresja fenotypowa defektów TBG występuje u płci męskiej. cdna dla TBG (SERPINA 7) długości 5.5 kpz składa się z pięciu eksonów. Rycina przedstawia lokalizację genu TBG oraz jego strukturę [0,]. Warianty TBG Zmiany w genie TBG prowadzą do powstania różnych wariantów białka TBG, które biochemiczne powodują całkowity lub częściowy niedobór TBG, nadmiar TBG lub dają stany przebiegające z prawidłowym stężeniem TBG. Są one wynikiem różnego typu mutacji zlokalizowanych w eksonach genu kodującego białko TBG lub, rzadziej, jego promotorze. Warianty TBG prowadzące do całkowitego wrodzonego niedoboru TBG w surowicy (TBG-CD). TBG-CD5 [] Leu7Pro (CTA CCA) Leu83Phe (TTG TTT) (opisano u Francuzów Kanadyjskich, zmiany w eksonie i 3) TBG-CD6 [3] delecja nukleotydu 65 (opisano u Anglików, zmiany w eksonie, zmiana ramki odczytu prowadząca do skrócenia łańcucha do 44

Materiały III Konferencji Sekcji Endokrynologii Molekularnej PTE 67 aminokwasów zamiast 395) TBG-CDJ (Japan) [3,8] delecja I zasady eksonu 35 w eksonie 4 (częsta mutacja u Japończyków) TBG-CD-Yonago [4] mutacja punktowa w eksonie 44 i 45 (zamiana cytozyny i tyminy na adeninę w eksonie prowadząca do zmiany ramki odczytu; stop kodon w kodonie 5) TBG-CD-Buffalo [5] Trp80Stop (TGG TAG) w eksonie 3 Leu83Phe ( TTG TTT) w eksonie 3 (prowadzi do braku 6 wminokwasów) TBG-CD-Kankakee [6] insercja w eksonie TBG-CD-Negev [7] delecja w kodonie 38 (ekson ) (u Beduinów w Izraelu) Warianty TBG prowadzące do częściowego wrodzonego niedoboru TBG w surowicy TBG-PD). TBG-PD-Kumamoto) [8] Prol363Leu (CCT CTT) TBG-PDJ (Japan) [9] Prol363Leu (CCT CTT) TBG-S [30] Asp7Asn (GAC AAC) TBG-San Diego [3] Ser3Thr (TCA ACA) TBG-A [3] Thr9Ala (ACA GCA) Phe83Leu (TTT TTG) TBG-Quebec [33] His33Tyr (CAT TAT) TBG-Montreal [34] Ala3Prol (GCC CCC) TBG-G Gary [35] Ile96Asn (ATC AAC) Warianty TBG prowadzące do nadmiaru TBG. Powstają w wyniku amplifikacji genu (duplikacji lub triplikacji) [36,37]. Warianty TBG przebiegające z prawidłowym jego stężeniem w surowicy. TBG-Poly [38] Leu83Phe (TTG TTT) TBG-Chicago [33] Tyr 309Phe (TAT TTT) W roku 00 Reutrakul i wsp. opisali przypadki chorych z wrodzonym całkowitym niedoborem TBG w surowicy, u których nie znaleziono żadnych mutacji zarówno w eksonach jak i w promotorze, co sugerowałoby możliwość występowania jeszcze innego defektu genetycznego, który byłby odpowiedzialny za niedobór TBG [39]. Do chwili obecnej opisano zmiany o charakterze mutacji punktowych prowadzących do zamiany aminokwasów zmieniających właściwości lub stężenie TBG w surowicy (np. w TBG-PD), zmiany o charakterze duplikacji lub triplikacji genu (np. TBG-E) lub zmian, w wyniku których dochodzi do przedwczesnego zakończenia procesu translacji (np. skrócenie łańcucha TBG o 6 aminokwasów w przypadku TBG-CD-Buffalo) [-38]. Rodzinnie izolowana hipertyroksynemia (hipertyroksynemia dysalbuminemiczna). Choroba ta została po raz pierwszy opisana w roku 979 przez Hennemanna i wsp. oraz Lee i wsp.[40,4]. Występuje bardzo rzadko, częściej u rasy kaukaskiej. Dziedziczy się w sposób autosomalny, dominujący. Przyczyną choroby są zmiany ilościowe lub jakościowe albuminy wiążącej tyroksynę (TBA) powstające w wyniku mutacji w obrębie genu kodującego to białko. Spośród opisanych mutacji genu TBA najczęstsze są zlokalizowane w kodonie 8. Są to: 8 CGC CAC prowadząca do zamiany aminokwasów A8H [4, 43] oraz 8 CGC CCC dająca zamianę A8P [44]. Choroba charakteryzuje się eutyreozą przy następujących parametrach biochemicznych: ct 4, ct 3, T 3 I, wt 4 I, wt 3, wt 4, oraz zwiększeniem wiązania T 4 przez albuminy. Wzrost TBPA Ta postać zaburzeń białek wiążących hormony tarczycy występuje wyjątkowo rzadko. Przyczyną schorzenia jest wzrost stężenia prealbuminy wiążącej tyroksynę. Dziedziczy się w sposób autosomalny, dominujący. Chorobę rozpoznaje się na podstawie następujących zmian w surowicy krwi: wzrostu stężenia tyroksyny i indeksu wolnej tyroksyny przy prawidłowej wartości współczynnika wiązania trijodotyroniny, indeksu wolnej trijodotyroniny oraz prawdiłowym stężeniu trijodotyroniny. W Polsce brak precyzyjnych danych na temat częstości występowania wrodzonych defektów TBG. Brak również danych na temat zmian molekularnogenetycznych prowadzących do powstania zaburzeń ilości i jakości TBG u chorych. W chwili obecnej prowadzone są badania nad ustaleniem mutacji w obrębie genu kodującego białko TBG w dwóch rodzinach z całkowitym wrodzonym niedoborem TBG (w opracowaniu). Piśmiennictwo. Gordon AH, Gross J, O Connor D, Pitt-Rivers R. Nature of the circulating thyroid hormone-plasma protein complex. Nature 95; 69:9-5. Marshall JS, Pensky J, Green AM. Studies on human thyroxine-binding globulin. IV The nature of slow thyroxinebinding globulin. J Clin Invest 97; 5: 373-379 3. Bartalena L, Tata JR, Robbins J. Characterization of nascent and secreted thyroxine-binding globulin in cultured human hepatoma (Hep G) cells. J Biol Chem 984; 59:3605-609 44

Endokrynologia Polska / Polish Journal of Endocrinology 003; 4 (54) 4. Flink IL, Bailey TJ, Gustefson TA, Markham BE, Morkin E. Complete amino aced sequence of human thyroxine-binding globulin (TBG) deduced from cloned DNA:close homology to the serine antiproteases. Proc Natl Acad Sci USA 986; 83: 7708-77 5. Hammond GL, Smith CL, Goping IS, Underhill DA, Harley MJ, Reventos J, Musto NA, Gunsalus GL, Bardin CW. Primary structure of human corticosteroid binding globulin deduced from hepatic and pulmonary cdnas, exhibits homology with serine protease inhibitors. Proc Natl Acad Sci USA 987; 84: 553-558 6. Refetoff S, Murata Y, Vassart G, Chandromouli V, Marshall JS. Radioimmunoassays specific for the tertiary and primary structures of thyroxine-binding globulin (TBG): measurement of denatured TBG in serum. J Clin Endocrinol Metab 984; 59:69-78 7. Refetoff S. Inherited thyroxine-binding globulin abnormalities in man. Endocr Rev 989; 0:75-93 8. Burr WA, Ramsden DB, Hoffenberg R. Hereditary abnormalities of thyroxine-binding globulin concentration. Quart J of Med, 980; 49: 95-33 9. Beierwaltes WH, Robbins J. Familial increase in the thyroxine-binding sites in serum alpha globulin. J Clin Invest 959; 38: 683-89 0. Nicoloff JT, Dowling JT, Patton DD. Inheritance of decreased thyroxine-binding by the thyroxine-binding globulin. J Clin Endocrinol Metab 964; 4: 94-98. Nikolai TF, Seal US. X-chromosome linked familial decrease in thyroxine-binding globulin deficiency. J Clin Endocrinol Metab 966; 5: 835-839. Nikolai TF, Seal US. X-chromosome linked inheritance of thyroxine-binding globulin deficiency. J Clin Endocrinol Metab 967; 7: 55-5 3. Refetoff S, Selenkow HA. Familial thyroxine-binding globulin deficiency in a patient with Turner s syndrome (XO): genetic study of a kindred. N Engl J Med 968; 78: 08-089 4. Jenkins MB, Steffes MW. Congenital thyroxine binding globulin deficiency: incidence and inheritance. Hum Genet 987; 77:80-84 5. Mandel S, Hamma C, Boston B, Sesser D, LaFranchi S. Thyroxine-binding globulin deficiency detected by newborn screening. J Pediatr 993, :7-30 6. Carta-Soorcini M, Moschini L, Fiore L, et al. Familial thyroxine-binding globulin deficiency detected in a pilot screening program for congenital hypothyroidism. J Endocrinol Invest 98; 5:-5 7. Łącka K. Choroby tarczycy. Rozpoznawanie i leczenie. PZWL, Wyd II. 00: 48-50 8. Tojo K, Miura Y, Mori Y, Yano M, Tanaka H, Hosoya T, Sakai O. Familial thyroxine-binding globulin deficiency associated with hyperthyreoidism. Inter Med 995; 34(5): 43-47 9. Trent JM, Flink IL, Morkin E, Van Tuinen P, Ledbetter DH. Localization of the human thyroxine-binding globulin gene to the long arm of the X-chromosome (Xp-). Am J Hum Genet 987; 4:48-435 0. Hayashi Y, Mori Y, Janssen OE, Sunthornthepvarakul T, Weiss RE, Takeda K, Weinberg M, Seo H, Bell GI, Refetoff S. Human thyroxine-binding globulin gene: complete sequence and transcriptional regulation. Mol Endocrinol 993; 7:049-060. Refetoff S, Murata Y, Mori Y, Janssen OE, Takeda K, Hayashi Y. Thyroxine-binding globulin: organization of the gene and variants. Hor Res 996; 45:8-38. Mori Y, Takeda K, Charboneeau M, Refetoff S. Replacement of Leu7 by Pro in thyroxine-binding globulin (TBG) is associated with complete TBG deficiency in three of eight families with this inherited defect. J Clin Endocrinol Metab 990; 70: 804-809 3. Takeda K, Iyota K, Mori Y, Tamura Y, Suehiro T, Kubo Y, Refetoff S, Hashimoto K. Gene screening in Japanese families with complete deficiency of thyroxine-binding globulin demonstrates that a nucleotide deletion at codon 35 may be a race specific mutation. Clin Endocrinol (Oxf) 994; 40:- 6 4. Ueta Y, Mitani Y, Yoshida A, Taniguchi S, Mori A, Hattori K, Husatome I, Manabe I, Takeda K, Sato R, Ahmmed GU, Tsuboi M, Ohtahara A, Hiroe K, Tanaka Y, Shigemasa C. A novel mutation causing complete deficiency of thyroxinebinding globulin. Clin Endocrinol (Oxf) 997; 47: -5 5. Carvalho GA, Weaiss RE, Vladutiu AO, Refetoff S. Complete deficiency of thyroxine-binding globulin (TBG-CD Buffalo) caused by a new nonsense mutation in the thyroxine-binding globulin gene. Thyroid 998; 8: 6-65 6. Carvalho GA, Weiss RE, Refetoff S. Complete thyroxinebinding globulin (TBG) deficiency produced by a mutation in acceptor splice site causing frameshift and early termination of translation (TBG-Kankakee). J Clin Endocrinol Metab 998; 83: 3604-3608 7. Miura Y, Hershkovitz E, Ingaki A, Parvari R, Oiso Y, Phillip M. A novel mutation causing complete thyroxine-binding globulin deficiency (TBG-CD-Negev) among the Bedouins in Southern Israel. J Clin Endocrinol Metab 000; 85: 3687-3689 8. Shirotani T, Kishikawa H, Wake N, Miyamura N, Hashimoto Y, Motoyoshi S, Yamaguchi K, Shichiri M. Thyroxine-binding globulin variant (TBG-Kumamoto): identification of a point mutation and genotype analysis of its family. Endocrinol Jpn 99; 39:577-584 9. Miura Y, Mori Y, Yamammori I, Tani Y, Murata Y, Yoshimoto M, Kinoshita E, Matsumoto T, Oiso Y, Seo H. Sequence of a variant thyroxine-binding globulin (TBG) in a family with partial TBG deficiency in Japanese (TBG-PDJ). Endocr J 993; 40:7-3 30. Waltz MR, Pullman TN, Takeda K. Molecular basis for the properties of the thyroxine-binding globulin-slow variant in American Blacks. J Endocrinol Invest 990; 3:343-349 3. Bertenshaw R, Sarne D, Tornari J, Weinberg M, Refetoff S. Sequencing of the variant thyroxine-binding globulin (TBG) San Diego reveals two nucleotide substitutions. Biochem Biophys Acta 99; 39:307-30 3. Takeda K, Mori Y, Sobieszczyk S, Seo H, Dick M, Watson F, Flink IL, Seino S, Bell GI, Refetoff S. Sequence of the variant thyroxine-binding globulin of Australian Aborigines: only one of two amino acid replacements is responsible for its altered properties. J Clin Invest 989; 83:344-348 33. Bertenshaw R, Takeda K, Refetoff S. Sequencing of the variant thyroxine-binding globulin (TBG)-Quebec reveals two nucleotide substitutions. Am J Hum Genet 99; 48:74-744 34. Janssen OE, Takeda K, Refetoff S. Sequence of the variant thyroxine-binding globulin (TBG) in a Montreal family with partial TBG deficiency. Hum Genet 99; 87:9-35. Kambe F, Seo H, Mori Y,Murata Y, Janssen OE, Refetoff S, Matsui N. An additional carbohydrate chain in the variant thyroxine-binding globulin Gary (TBGAsn-96) impairs its secretion. Mol Endocrinol 99; 6:443-449 36. Mori Y, Miura Y, Takeuchi H, Igarashi Y, Sugiura J, Saito H, Oiso Y. Gene amplification as a cause of inherited thyroxinebinding globulin excess in two Japanese families. J Clin Endocrinol Metab 995; 80: 3758-376 37. Mori Y, Jing P, Kayama M, Fujieda K, Hasegawa T, Nagimori T, Hirooka Y, Mitsuma T. Gene amplification as a common cause of inherited thyroxine- binding globulin excess: analysis of one familial and two sporadic cases. Endocr J 999; 46: 63-69 38. Takamatsu J, Refetoff S. Inherited heat stable variant thyroxine-binding globulin (TBG Chocago). J Clin Endocrinol Metab 986; 63: 40-45 39. Reutrakul S, Dumitrescu A, Macchia PE, Moll GW Jr, Vierhapper F, Refetoff S. Complete thyroxine-binding globulin (TBG) deficiency in two families without mutations in coding or promoter regions of the TBG genes: in vitro demonstration of exon skipping. J Clin Endocrinol Metab 00; 87: 045-05 40. Hennemann G, Docter R, Krenning EP, Bos G, Otten M, Visser TJ. Raised total thyroxine and free thyroxine index but normal free thyroxine. A serum abnormality due to inherited increased affinity of iodothyronines for serum binding protein. Lancet 979; : 639-64 443

Materiały III Konferencji Sekcji Endokrynologii Molekularnej PTE 4. Lee WNP, Golden MP, Van Herle AJ, Lippe BM, Kaplan SA. Inherited abnormal thyroid hormone-binding protein causing selective increase of total serum thyroxine. J Clin Endocrinol Metab 979; 49: 9-99 4. Peterson CE, Scottolini AG, Cody LR, Mandel M, Reimar N, Bhagavan NV. A point mutation in the human serum albumin gene results in familial dysalbuminaemic hyperthyroxinemia. J Med Genet 994; 3: 355-359 43. Southornthepvarakul T, Angkeow P, Weiss RE, Hayashi Y, refetoff S. An identical missense mutation in the albumin gene results in familial dysalbuminemic hyperthyroxinemia in 8 unrelated families. Bioch Biohys Res Commun 994; 0: 78-787 44. Wada N, Hitoshi C, Chikara S, Hiromichi K, Mitsumasa K, Takao K. A novel missense mutation in codon 8 of the albumin gene in a distinct phenotype of familial dysalbuminemic hyperthyroxinemia in a Japanese kindred. J Clin Endocrinol Metab 997; 8: 346-350 Marek Niedziela The role of thyroid peroxidase in physiology and pathology of thyroid gland Department of Pediatric Endocrinology and Diabetes, Karol Marcinkowski University of Medical Sciences in Poznan, Poland. Abstract: Thyroid peroxidase (TPO) is a key-enzyme in thyroid hormone (TH) biosynthesis in humans. The human TPO gene is located on chromosome p5 covers about 50 kb of DNA, divided into 7 exons. TPO is consisted of 933 aminoacids and its molecular weight is 03 kd. The physiological role of TPO is the organification of intrathyroidal iodide and iodination of thyrosyl residues within TH precursors. The significant role of TPO was found in the following pathological states: () congenital hypothyroidism (CH), () thyroid neoplasia and (3) autoimmune thyroiditis (AIT). Key words: thyroid peroxidase, congenital hypothyroidism, autoimmune thyroiditis - Thyroid neoplasia Marek Niedziela Rola peroksydazy tarczycowej w fizjologii i patologii gruczołu tarczowego Klinika Endokrynologii i Diabetologii Wieku Rozwojowego Instytutu Pediatrii Akademii Medycznej im. Karola Marcinkowskiego w Poznaniu. Streszczenie: Peroksydaza tarczycowa (TPO) jest kluczowym enzymem w syntezie hormonów tarczycy u człowieka. Gen dla ludzkiej TPO zlokalizowany na chromosomie p5 posiada około 50 kb DNA, podzielonych na 7 eksonów. Białko to zbudowane jest z 933 aminokwasów a jego masa cząsteczkowa wynosi 03 kd. Fizjologiczna rola TPO obejmuje organifikację wewnątrztarczycowego jodu i jodowanie reszt tyrozylowych prekursorów hormonów tarczycy. Znacząca rola TPO została poznana w takich stanach chorobowych jak: () wrodzona niedoczynność tarczycy (WNT), () nowotwory tarczycy oraz (3) autoimmunologiczne zapalenie tarczycy (AIZT). Słowa kluczowe: peroksydaza tarczycowa, wrodzona niedoczynność tarczycy, autoimmunologiczne zapalenie tarczycy, nowotwór tarczycy, Dr n. med. Marek Niedziela Klinika Endokrynologii i Diabetologii Wieku Rozwojowego Instytut Pediatrii Akademii Medycznej im. Karola Marcinkowskiego w Poznaniu ul. Szpitalna 7/33; 60-57 Poznań; Tel.: (06) 848 09, 849 48, 849 40; Fax: 848 09 Podziękowanie: Praca była finansowa w części z projektu Akademii Medycznej w Poznaniu nr 50--05-/00. Peroksydaza tarczycowa (TPO), enzym obecny w komórce pęcherzykowej tarczycy, odgrywa kluczową rolę w procesie biosyntezy hormonów tarczycy i stąd jej niedobór lub brak jest jedną z przyczyn wrodzonej niedoczynności tarczycy (WNT). TPO to także najważniejszy autoantygen w patogenezie autoimmunologicznego zapalenia tarczycy (AIZT), które prowadzi do nabytej niedoczynności tarczycy oraz jeden z potencjalnych markerów procesu nowotworowego w tarczycy. Rycina ukazuje organizację pojedynczej komórki pęcherzykowej tarczycy z uwzględnieniem kaskady procesów wewnątrzkomórkowych i systemu regulacyjnego zewnątrzkomórkowego. Obraz ultrasonograficzny prawidłowego gruczołu tarczowego przedstawiono na Fot.. Schemat funkcjonowania pojedynczej komórki pęcherzykowej tarczycy przedstawiono na rycinie a prawidłowy obraz ultrasonograficzny gruczołu tarczowego na fotografii. 444

5(5 Endokrynologia Polska / Polish Journal of Endocrinology 003; 4 (54) Ryc.. Schemat funkcjonowania pojedynczej komórki pęcherzykowej tarczycy 5\F6FKHPDWIXQNFMRQRZDQLDSRMHG\QF]HMNRPyUNLSFKHU]\NRZHMWDUF]\F\ FKU ;T7%* 3U]HG]LDá SU]\SRGVWDZQ\ 3U]HG]LDá DGOXPLQDOQ\ I7 775 '- I7 77 HQGRF\WR]D HJ]RF\WR]D 7 '- 7 3L+ 7,6 FKU SS 7\U 0,7',7 7+; FKUT '+ α FKU T 75 α FKU T 7J 73 FKU S - - β FKU S 3'6 -W\U7J7 75 β ZWURED QHUNL ) FHUE Αα 75 β SU]\VDGND SRGZ]JyU]H - " - 4 $$ $$,QVXOLQD,*), (*) 7*)α E)*) 7*)β $* FKU T Fot.. Obraz ultrasonograficzny prawidłowego gruczołu tarczowego - przekrój poprzeczny. PEROKSYDAZA TARCZYCOWA 3/& 3.& α γ β 75+ 76+ 3,,3 '$* &D TPO to kluczowy enzym (glikoproteina) w biosyntezie hormonów tarczycy. Gen ludzkiej TPO zlokalizowany jest na chromosomie (p5) []. Gen ten zbudowany jest z ~50 kilo par zasad (kb) DNA i składa się z 7 eksonów oraz 6 intronów [-3]. Eksony 8-9-0 kodują podjednostkę katalityczną enzymu i w tym części genu wykryto najwięcej dotąd mutacji [Ryc. ]. 76+5 )RVIRU\ODFMD ELDáHN FKU TT 75+5FKU FKU T 77).; 77) 3$; -GUR NRPyUNRZH α FKU β FKU S 3RGZ]JyU]H JVSFKU T γ α $& β 3U]\VDGND F$03 $73 3.$ 77) FKU T 77) FKU T 3$; FKU TT ZLDWáRSFKHU]\NDWDUF]\F\ /HJHQGD &]\QQLNLZ]URVWRZH,*),LQVXOLQRSRGREQ\ (*)QDVNyUNRZ\ 7*)αWUDQVIRUPXMF\ E)*)ILEUREODVWyZ 7*)βWUDQVIRUPXMF\ 7%* JOREXOLQD ZL*FD W\URNV\Q 3, IRVIRLQR]\WRO,3 WULIRVIRLQR]\WRO '$* GLDF\OJOLFHURO 77).; 77)3$; F]\QQLNL WUDQVNU\SF\MQH 75+ W\UHROLEHU\QD 76+ W\UHRWURSLQD JVS JHQGODELDáND*V 3.$ NLQD]D ELDáNRZD $ 3.& NLQD]DELDáNRZD& &$ F\NOD]D DGHQ\ORZD 3/& IRVIROLSD]D &,6 V\PSRUWHU 7J W\UHRJOREXOLQD 73 SHURNV\GD]D WDUF]\FRZD 3'6 SHQGU\QD SRPSD MRGNRZRFKORUNRZD $$ DPLQRNZDV\ '- GHMRG\QD]\ W\S 7+; RNV\GD]D JHQHUXMFD + '+ GHKDORJHQD]D 3L+ SURWHD]\ L K\GUROD]\ 5(5 VLDWHF]ND UyGSOD]PDW\F]QD V]RUVWND $* DSDUDW *ROJLHJR SRáF]HQLH FLVáH PLG]\NRPyUNRZH Głównym regulatorem funkcji enzymu jest hormon tyreotropowy (TSH). Izoformy peroksydazy tarczycowej W 987 r. trzej badacze: Kimura [], Libert [4-5] i Seto [6] opisali niezależnie dwie formy TPO występujące w prawidłowej tarczycy jako wyraz alternatywnego splicingu RNA tego samego genu - Ryc. 3 (warianty różnych transkryptów ludzkiej TPO htpo mrna). Ostatecznym produktem translacji są dwie izoformy białka: () htpo- 933 aminokwasy główna postać TPO () htpo- 876 aminokwasów (brak eksonu 0 powoduje delecję 7 par zasad w mrna (nukleotydy 670-840), w konsekwencji w cząsteczce brakuje 57 aminokwasów Rola htpo- nie jest poznana, raczej jest formą nieaktywną, gdyż nie posiada dystalnych reszt histydyny niezbędnych dla aktywności TPO. Ryc. Schemat organizacji genu peroksydazy tarczycowej [-3]. ES F'$K73 +,6 +,6 +,6 3/,$6,*$/ 445

Materiały III Konferencji Sekcji Endokrynologii Molekularnej PTE Ryc. 3. Różnorodne transkrypty ludzkiego mrna [, 4-0]. Tabela. Przyczyny wrodzonej niedoczynności tarczycy. NE A. PIERWOTNA (90-95%) K73 :LOGW\SH K73 K73 =DQHOOLHWDO K73, K73,, $EUDPRZLF] 7DUJRYQLNHWDO (NVRQ\ (NVRQ\,QWURQ (NVRQ\,QWURQ" (NVRQ\ K73P5$ (NVRQ Ekspresja peroksydazy tarczycowej (NVRQ ES Pozytywną ekspresję TPO, tj. >80% spośród minimum 00 analizowanych komórek, zaobserwowano w dwóch przedziałach komórkowych: (a) cytoplazmatycznym (i bardziej intensywnie w błonie szczytowej komórki pęcherzykowej od strony światła pęcherzyka) u płodów, dzieci i młodych dorosłych, oraz (b) okołojądrowym starsi dorośli oraz w podeszłym wieku []. Rola peroksydazy tarczycowej w fizjologii gruczołu tarczowego Rola TPO dotyczy: - organifikacji jodu (przekształcenie J - do J o ), - wbudowywania jodu do reszt tyrozylowych tyreoglobuliny i tworzenia jod-tyreoglobuliny (formy magazynowej hormonów tarczycy), oraz - wewnątrztarczycowego sprzęgania jodowanych tyrozyn, prowadząc do wytworzenia T 4 i T 3. ROLA PEROKSYDAZY TARCZYCOWEJ WE WRODZONEJ NIEDOCZYNNOŚCI TARCZYCY. Dysgenezja tarczycy (TTF-, TTF-, PAX-8) a) agenezja (-4%) b) dysplazja i ektopia (35-4%). Tarczyca o prawidłowym położeniu (4-36%) a) genetyczne zaburzenia biosyntezy hormonów tarczycy (TPO, NIS, pendryna, Tg, oksydaza, dejodynaza, inne enzymy) b) hipoplazja jako wynik nieaktywnej mutacji receptora TSH lub działania przeciwciał blokujących TBII B. WTÓRNA (5-0%) Podwzgórzowo-przysadkowa (pit-, prop-, TRH, TSH) C. Inne (oporność na hormony tarczycy, utrata hormonów tarczycy - zespół utraty białek, interakcja hormonów tarczycy (z lekami) na poziomie receptora W związku z różnorodnością przyczyn WNT obserwujemy odmienny obraz ultrasonograficzny w różnych postaciach WNT: - postać bez wola (aplazja/hipoplazja Fot. ), - postać z wolem (blok syntezy Fot. 3) oraz - nieprawidłową lokalizację gruczołu (ektopia). Na fot. 4 przedstawiono obraz kliniczny ciężkiej postaci WNT w przebiegu całkowitego bloku syntezy hormonów tarczycy [4]. Fot.. Wrodzona niedoczynność tarczycy postać bez wola (aplazja/hipoplazja). Pierwotna wrodzona niedoczynność tarczycy jest jednym z najczęstszych zaburzeń endokrynologicznych w okresie rozwojowym. Kliniczna manifestacja tej choroby może obejmować szerokie spektrum zaburzeń, od formy łagodnej aż do ciężkiej postaci. Istnieje szereg przyczyn WNT jakkolwiek wole noworodkowe stwierdza się tylko u 5-0% dzieci z WNT i te dzieci podejrzewane są o blok syntezy [-3]. Jeśli wystąpi nieprawidłowość w jakimkolwiek miejscu kaskady czynnościowej wówczas oczekiwać możemy różnych postaci klinicznych wrodzonej niedoczynności tarczycy (Tabela ) a defekt TPO stanowi statystycznie najważniejszą przyczynę bloku syntezy hormonów tarczycy i może objawiać się wolem noworodka. Fot. 3. Wrodzona niedoczynność tarczycy postać z wolem (blok syntezy). 446